一種酶納米復(fù)合物及其可控自組裝方法和在免疫分析中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫分析領(lǐng)域，特別涉及一種酶納米復(fù)合物及其可控自組裝方法和復(fù) 合物在免疫分析中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶聯(lián)免疫分析（Enzyme-Linked TmmunoSorbent Assay, ELISA)是臨床、科研中應(yīng) 用廣泛的特異性目標(biāo)分子分析方法，其主要通過抗原-抗體分子間的特異性識別和酶分子 的高效催化來實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜混合物中目標(biāo)分子的檢測，傳統(tǒng)的ELISA方法，通過在抗體分子 上進(jìn)行酶分子修飾來進(jìn)行信號輸出，通常是一對抗原抗體復(fù)合物對應(yīng)一個酶分子，檢測范 圍在0. lng/ml-100ng/ml之間。隨著技術(shù)的發(fā)展，該靈敏度已經(jīng)不能夠滿足臨床檢測和科 學(xué)研究中的需求，因此亟需發(fā)展新型的高靈敏分析方法。
[0003] 目前，現(xiàn)有技術(shù)為了增加檢測靈敏度，常見的方法是增加修飾的酶分子的數(shù)量從 而提高檢測靈敏度。主要包括以下幾種方法：
[0004] 1.層層自組裝生物素化蛋白網(wǎng)絡(luò)，例如現(xiàn)有技術(shù)"Layer by layer assembly of biotinylated protein networks for signal amplification"，Chem. Commun.，2013, 49, 2397,該技術(shù)通過多生物素標(biāo)記的蛋白分子與親和素反復(fù)的結(jié)合形成大 的復(fù)合物，從而使生物素增多，結(jié)合大量親和素修飾的酶分子，提高免疫分析靈敏度。但是， 該方法存在步驟多，檢測時(shí)間長，復(fù)合物表面酶分子數(shù)量不可控等問題，會造成信號不穩(wěn)定 或者批次間操作的差異等問題。
[0005] 2.酶信號循環(huán)放大法，例如現(xiàn)有技術(shù)CN 102809648 A公開了一種酶信號循環(huán)放 大高靈敏免疫檢測方法，該方法主要是通過使用抗HRP的抗體與HRP交聯(lián)，兩者間相互結(jié)合 形成大的酶分子復(fù)合物，來提高靈敏度。然而該方法交聯(lián)會破壞HRP或抗體的活性，相互結(jié) 合形成大團(tuán)復(fù)合物后，尺寸、酶分子數(shù)量完全不可控，會造成信號輸出不穩(wěn)定等問題，而且 制備過程復(fù)雜。
[0006] 3.納米自組裝法，如現(xiàn)有技術(shù)"Seeding-induced self-assembling protein nanowires dramatically increase the sensitivity of immunoassaysNano Lett. 9(6):2246-50. 2009 An auto-biotinylated bifunctional protein nanowire for ultra-sensitive molecular biosensing. Biosens Bioelectron，'，26 (4) : 1137-41. 2010。 納米自組裝方法是通過自組裝的方法將酶分子和特異性結(jié)合分子整合在蛋白納米線上，提 高最終結(jié)合在抗原-抗體復(fù)合物上的酶分子數(shù)量，提高檢測靈敏度。但是該方法也存在制 備不可控的問題，酶分子數(shù)量不確定，最終導(dǎo)致信號不穩(wěn)定，無法應(yīng)用于定量檢測。且制備 過程繁瑣、成本高。
[0007] 4.納米管、納米顆粒法，在納米材料（如金納米顆粒、碳納米管等）上修飾酶分子 和抗體分子，通過提高酶分子數(shù)量來提高檢測靈敏度的。但是該方法中修飾過程不可控，會 導(dǎo)致蛋白分子功能失活，修飾數(shù)量和質(zhì)量難以控制，批次間重現(xiàn)性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)酶分子數(shù)量不可控、重現(xiàn)性差、信號不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，提供 了一種酶納米復(fù)合物及其可控自組裝方法，復(fù)合物所含有的酶分子數(shù)量基本一致，并且通 過調(diào)整組裝比例，可以得到具有不同酶分子數(shù)量的酶納米復(fù)合物。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0010] 本發(fā)明提供一種酶納米復(fù)合物，包括位于核心層的納米顆粒，位于中間層的生物 素及位于外層的親和素修飾的酶；其中所述納米顆粒為由M個相同或同源的亞基通過自 組裝形成的球形納米顆粒，每個納米顆粒通過遺傳修飾表面均勻連接M個生物素，所述 M彡12,且M為整數(shù)。
[0011] 優(yōu)選的，酶納米復(fù)合物（簡稱ENC)中所含有的酶分子數(shù)量可通過以下公式進(jìn)行簡 略計(jì)算：
[0012] X = nXM-iXn/2
[0013] 其中，X代表ENC中酶分子的數(shù)量，M代表納米顆粒的亞基數(shù)目，η代表ENC中所整 合的生物素化的蛋白納米顆粒（簡稱NP)的數(shù)量，i代表每個NP與相鄰顆粒共享的親和素 修飾的酶分子的數(shù)量。
[0014] 優(yōu)選的，所述納米顆粒為蛋白納米顆粒；本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，所述納米顆粒還可 為病毒納米顆粒。更為優(yōu)選的，所述納米顆粒為鐵蛋白納米顆粒，其中，每個鐵蛋白納米顆 粒通過遺傳修飾表面均勻連接24個生物素。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，鐵蛋白納米顆粒還可為 小鐵蛋白，其中，每個小鐵蛋白納米顆粒通過遺傳修飾表面均勻連接12個生物素。
[0015] 優(yōu)選的，所述酶納米復(fù)合物為單體，其中，所述單體表面修飾有M個酶分子。更為 優(yōu)選的，所述單體表面修飾有24個酶分子。
[0016] 優(yōu)選的，所述酶納米復(fù)合物為多聚體；優(yōu)選的，所述多聚體可為二聚體至十聚體 (包括二、三、四、五、六、七、八、九、十聚體），更為優(yōu)選的，所述多聚體可為二聚體、三聚體 或四聚體。當(dāng)所述酶納米復(fù)合物為二聚體時(shí)，兩個納米顆粒共用一個生物素，當(dāng)納米顆粒為 鐵蛋白納米顆粒時(shí)，二聚體表面修飾有47個酶分子；當(dāng)復(fù)合物為三聚體時(shí)，當(dāng)納米顆粒為 鐵蛋白納米顆粒時(shí)，三聚體表面修飾有69個酶分子；當(dāng)復(fù)合物為四聚體，納米顆粒為鐵蛋 白納米顆粒時(shí)，四聚體表面修飾有92個酶分子。依次類推，隨著共用的生物素?cái)?shù)量的增加， 形成包括更多酶分子的多聚體。
[0017] 優(yōu)選的，所述每個納米顆粒通過遺傳修飾表面均勻連接M個生物素包括：
[0018] 通過分子克隆在所述納米顆粒亞基的N末端融合生物素接受多肽（biotin accepted peptide, BAP)得到融合蛋白基因，將所述融合蛋白基因克隆入表達(dá)載體；
[0019] 將生物素蛋白連接酶（Biotin-protein ligase, BirA)克隆入共表達(dá)載體中；
[0020] 將所述表達(dá)載體、共表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主中培養(yǎng)，活化至對數(shù)生長期后加入誘 導(dǎo)表白蛋白和生物素；
[0021 ] 經(jīng)破碎、純化后制得生物素化的納米顆粒。
[0022] 優(yōu)選的，所述納米顆粒為鐵蛋白納米顆粒，鐵蛋白包括24個相同或同源的 亞基；更為優(yōu)選的，鐵蛋白為重組人重鏈鐵蛋白（recombinant human heavy-chain ferritin, rHF)〇
[0023] 優(yōu)選的，通過分子克隆在所述納米顆粒亞基的N末端融合連接多肽之后再融合生 物素接受多肽得到融合蛋白基因。減少可能存在的位阻的影響，保持生物素接受多肽遠(yuǎn)離 納米顆粒的表面。
[0024] 優(yōu)選的，所述表達(dá)載體和所述共表達(dá)載體為質(zhì)粒載體，所述表達(dá)宿主選自大腸桿 菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、棒狀桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母或哺乳動物細(xì)胞。更為優(yōu) 選的，所述表達(dá)載體為pET-28、pET-32、pET-15或pET-11，所述共表達(dá)載體為pCDFDuel-1， 所述表達(dá)宿主為大腸桿菌。
[0025] 優(yōu)選的，所述克隆通過鏈?zhǔn)矫妇酆戏磻?yīng)（PCR)完成。
[0026] 優(yōu)選的，將生物素蛋白連接酶（BirA)克隆入共表達(dá)載體中具體包括：獲取BirA基 因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物，在上、下游引物中分別加入限制性內(nèi)切酶NcoI和Sail的酶切 位點(diǎn)，通過PCR擴(kuò)增BirA基因；將PCR產(chǎn)物BirA和表達(dá)載體p⑶FDuel-I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)， 收集酶切產(chǎn)物；將收集到的酶切產(chǎn)物BirA和p⑶FDuel-I載體按物質(zhì)的量比以6 :1進(jìn)行連 接反應(yīng)，得到 BirA-pCDFDuel-1。
[0027] 優(yōu)選的，將所述表達(dá)載體、共表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主中培養(yǎng)，活化至對數(shù)生長期后 加入誘導(dǎo)表白蛋白和生物素具體包括：將表達(dá)載體和共表達(dá)載體加入含有表達(dá)宿主和抗生 素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，直至活化至對數(shù)生長期，加入IPTG誘導(dǎo)表白蛋白和生物素過夜， 進(jìn)行培養(yǎng)和表達(dá)。
[0028] 優(yōu)選的，經(jīng)破碎、純化后制得生物素化的納米顆粒具體包括：收集表達(dá)后的產(chǎn)物進(jìn) 行超聲破粹，收集上清液，水浴反應(yīng)后離心，收集上清液利用蔗糖密度梯度離心或凝膠排阻 層析收集納米顆粒。
[0029] 優(yōu)選的，所述酶為辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶或堿性磷酸酶。
[0030] 另一方面，本發(fā)明還提供一種酶納米復(fù)合物可控自組裝方法，通過遺傳修飾制備 生物素化的納米顆粒，將所述生物素化的納米顆粒與親和素修飾的酶混合，其中，所述納米 顆粒為由M個相同或同源的亞基通過自組裝形成的球形納米顆粒，