一種檢測(cè)水中疊氮根離子或氰離子的方法
【專利說明】-種檢測(cè)水中疊氮根離子或氯離子的方法 (-)技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及水中疊氮離子和氯離子的測(cè)定方法，特別設(shè)及利用面醇脫面酶催化水 中的疊氮離子和氯離子與環(huán)氧化物反應(yīng)，生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的取代醇，通過氣相色譜分析生成的取 代醇的量來確定水中疊氮離子和氯離子的含量，該方法適用于水中疊氮離子和氯離子的檢 測(cè)。 (二）【背景技術(shù)】
[0002] 疊氮化合物和氯化物在有機(jī)合成反應(yīng)中占有重要的作用，它們常常被用于一些醫(yī) 藥中間體和精細(xì)化學(xué)品的合成，其中疊氮化鋼還用于制造汽車的安全氣囊。但是疊氮離子 和氯離子都是劇毒化合物，可W與人體的血紅蛋白結(jié)合，降低其運(yùn)輸氧氣的能力，導(dǎo)致人窒 息而死。因此，需要一個(gè)快速準(zhǔn)確的分析方法檢測(cè)水中的疊氮離子和氯離子。
[0003] 目前，檢測(cè)水中疊氮離子和氯離子的方法有分光光度法，離子色譜，氣相-質(zhì)譜聯(lián) 用分析法等。其中分光光度法收受外界的干擾較大，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，讀取的數(shù)值波動(dòng)較 大，精確度不高。離子色譜和氣相-質(zhì)譜法較為準(zhǔn)確，但是操作繁瑣，對(duì)設(shè)備要求高。 (H)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種間接檢測(cè)水中疊氮離子和氯離子的方法，該方法對(duì)設(shè)備要求 低，操作穩(wěn)定性好，同時(shí)分析所W的時(shí)間短，可W快速對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行分析。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一種檢測(cè)水中疊氮根離子或氯離子的方法，所述方法為；W含面醇 脫面酶編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體經(jīng)超聲破碎后的上清液為催 化劑，W環(huán)氧化物為助劑，W待測(cè)水樣作為原料，在40~45°C、500巧m條件下反應(yīng)30~ 60min，取反應(yīng)液用己酸己醋萃取，取上層有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鋼干燥后采用氣相色譜檢測(cè) 4-疊氮-3-哲基了醇或4-氯基-3-哲基了醇峰面積，根據(jù)W 4-疊氮-3-哲基了醇或4-氯 基-3-哲基了醇峰面積為縱坐標(biāo)、W疊氮化鋼或氯化鋼濃度為橫坐標(biāo)制作的疊氮化鋼標(biāo)準(zhǔn) 曲線或氯化鋼標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測(cè)水樣中疊氮根離子或者氯離子的濃度；所述催化劑的用 量W含面醇脫面酶編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)超聲破碎前濕菌體重量計(jì)為5-20mg/mL 待測(cè)水樣（優(yōu)選lOmg/mL)，環(huán)氧化物的用量為0. 05~0. 2mol/L待測(cè)水樣（優(yōu)選0. 18mol/ L) 〇
[0007] 進(jìn)一步，所述面醇脫面酶的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
[000引進(jìn)一步，氣相色譜檢測(cè)條件為：采用日本島津氣相GC-14,色譜柱Astec CHIRALDEX? G-TA，載氣為氮?dú)?，分流比?0:1，進(jìn)樣口和檢測(cè)器的溫度均為220°C，GC程序 為 120°C保留 5min，5°C /min 升溫至 140°C，保留 2min。
[0009] 進(jìn)一步，標(biāo)準(zhǔn)曲線按如下方法制備；用蒸饋水配制0. 2~2. OmM的疊氮化鋼水溶 液，分別向2ml EP管中加入500 y 1不同濃度的疊氮化鋼水溶液，450 y 1環(huán)氧了燒溶液和 50 y 1面醇脫面酶粗酶液，在40°C，500巧m，反應(yīng)30min，分別向EP管中加入1ml己酸己醋進(jìn) 行萃取，取上層有機(jī)相800 y 1，經(jīng)無水硫酸鋼干燥后采用氣相檢測(cè)4-疊氮-3-哲基了醇的 峰面積，W疊氮化鋼濃度為橫坐標(biāo)，W 4-疊氮-3-哲基了醇的峰面積為縱坐標(biāo)，獲得疊氮化 鋼標(biāo)準(zhǔn)曲線；所述面醇脫面酶粗酶液為面醇脫面酶經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體超聲破碎后的 上清液，所述粗酶液的濃度W超聲破碎前濕菌體重量計(jì)為0.Ig/ml ;所述環(huán)氧了燒溶液是 用200mM、pH 7. 5的PBS緩沖液配制的200mM環(huán)氧了燒溶液，氯化鋼標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作同疊氮 化鋼標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0010] 進(jìn)一步，環(huán)氧化物為環(huán)氧了燒或環(huán)氧辛燒。
[0011] 進(jìn)一步，環(huán)氧化物的用量為0.Imol/L水樣。
[0012] 進(jìn)一步，催化劑的制備方法為；將含面醇脫面醇編碼基因的重組基因工程菌接 種在含終濃度50μg/ml的氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中，置于37°C搖床中培養(yǎng)至ODe。。達(dá) 到0. 6~0. 8時(shí)，加入終濃度0. 2mM異丙基硫代半乳糖巧，在28°C搖床誘導(dǎo)12-14小時(shí)， 9000rpm離屯、10分鐘，棄上清，離屯、獲得的濕菌體按照0.1 g/L的比例混懸于lOOmM的磯酸 緩沖液中，50 %功率超聲破碎30min，破碎混合液在120(K)巧m離屯、20分鐘，收集上清，獲得 含有面醇脫面酶的粗酶液，即為催化劑。
[0013] 本發(fā)明檢測(cè)方法是要測(cè)定疊氮離子和氯離子的含量，所W只要保證足量的面醇脫 面酶，使得疊氮離子和氯離子完全轉(zhuǎn)化就可W，本發(fā)明粗酶液中面醇脫面酶純酶質(zhì)量約占 30%左右。
[0014] 本發(fā)明疊氮離子和氯離子的定量檢測(cè)方法包括；（1)利用面醇脫面酶催化樣品中 的疊氮離子或氯離子與環(huán)氧化物（優(yōu)選環(huán)氧了燒）反應(yīng)，將疊氮離子或氯離子轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng) 的4-疊氮-3-哲基了醇或4-氯基-3-哲基了醇；(2)利用氣相色譜定量檢測(cè)4-疊氮-3-哲 基了醇或4-氯基-3-哲基了醇含量，進(jìn)而確定水中疊氮離子和氯離子的含量。
[0015] 本發(fā)明利用生物催化法，將水中的無機(jī)離子（疊氮離子或氯離子）轉(zhuǎn)化為可用氣 相分析的有機(jī)化合物，其反應(yīng)原理如下式所示：
[0016]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)水中疊氮根離子或氰離子的方法，其特征在于所述方法為：以含鹵醇脫鹵 酶編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體超聲破碎后的上清液為催化劑，以 環(huán)氧化物為助劑，以待測(cè)水樣作為原料，在40~45°C、500rpm條件下反應(yīng)30~60min，取反 應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，取上層有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鈉干燥后采用氣相色譜檢測(cè)4-疊氮-3-羥 基丁醇或4-氰基-3-羥基丁醇峰面積，根據(jù)以4-疊氮-3-羥基丁醇或4-氰基-3-羥基丁 醇峰面積為縱坐標(biāo)、以疊氮化鈉或氰化鈉濃度為橫坐標(biāo)制作的疊氮化鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線或氰化鈉 標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測(cè)水樣中疊氮根離子或者氰離子的濃度；所述催化劑的用量以含鹵醇脫 鹵酶編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)超聲破碎前濕菌體重量計(jì)為5~20mg/mL待測(cè)水樣，環(huán) 氧化物的用量為〇? 05~0? 2mol/L待測(cè)水樣。
2. 如權(quán)利要求1所述檢測(cè)水中疊氮根離子或氰離子的方法，其特征在于所述鹵醇脫鹵 酶的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
3. 如權(quán)利要求1所述檢測(cè)水中疊氮根離子或氰離子的方法，其特征在于氣相色譜檢 測(cè)條件為：采用日本島津氣相GC-14,色譜柱Astec CHIRALDEX? G-TA，載氣為氦氣，分流比 為20:1，進(jìn)樣口和檢測(cè)器的溫度均為220°C，GC程序?yàn)?20°C保留5min，5°C /min升溫至 140°C，保留 2min。
4. 如權(quán)利要求1所述檢測(cè)水中疊氮根離子或氰離子的方法，其特征在于標(biāo)準(zhǔn)曲線按 如下方法制備：用蒸餾水配制0. 2~2. OmM的疊氮化鈉水溶液，分別向2ml EP管中加入 500 y 1不同濃度的疊氮化鈉水溶液，450 y 1環(huán)氧丁燒溶液和50 y 1鹵醇脫鹵酶粗酶液， 在40°C，500rpm，反應(yīng)30min，分別向EP管中加入1ml乙酸乙酯進(jìn)行萃取，取上層有機(jī)相 800 y 1，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后采用氣相檢測(cè)4-疊氮-3-羥基丁醇的峰面積，以疊氮化鈉濃 度為橫坐標(biāo)，以4-疊氮-3-羥基丁醇的峰面積為縱坐標(biāo)，獲得疊氮化鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線；所述鹵醇 脫鹵酶粗酶液為鹵醇脫鹵酶經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體超聲破碎后的上清液，所述粗酶液的 濃度以超聲破碎前濕菌體重量計(jì)為〇. lg/ml ;所述環(huán)氧丁烷溶液是用200mM、pH 7. 5的PBS 緩沖液配制的200mM環(huán)氧丁烷溶液，氰化鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作同疊氮化鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線。
5. 如權(quán)利要求1所述檢測(cè)水中疊氮根離子或氰離子的方法，其特征在于環(huán)氧化物為環(huán) 氧丁烷或環(huán)氧辛烷。
6. 如權(quán)利要求1所述檢測(cè)水中疊氮根離子或氰離子的方法，其特征在于環(huán)氧化物的用 量為0? lmol/L水樣。
7. 如權(quán)利要求1所述檢測(cè)水中疊氮根離子或氰離子的方法，其特征在于催化劑的制備 方法為：將含鹵醇脫鹵醇編碼基因的重組基因工程菌接種在含終濃度50 y g/ml的氨芐青 霉素的LB培養(yǎng)基中，置于37 °C搖床中培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)到0. 6~0. 8時(shí)，加入終濃度0. 2mM異 丙基硫代半乳糖苷，在28°C搖床誘導(dǎo)12-14小時(shí)，9000rpm離心10分鐘，棄上清，離心獲得 的濕菌體按照0. lg/L的比例混懸于IOOmM的磷酸緩沖液中，50 %功率超聲破碎30min，破碎 混合液在12000rpm離心20分鐘，收集上清，獲得含有鹵醇脫鹵酶的粗酶液，即為催化劑。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測(cè)水中疊氮根離子或氰離子的方法，所述方法利用鹵醇脫鹵酶催化水中的疊氮離子或氰離子與環(huán)氧化物反應(yīng)，生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的4-疊氮-3-羥基丁醇或4-氰基-3-羥基丁醇，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，用氣相色譜定量分析生成的4-疊氮-3-羥基丁醇或4-氰基-3-羥基丁醇含量，進(jìn)而確定樣品中疊氮離子或氰離子的濃度；本發(fā)明方法準(zhǔn)確性好，可以檢測(cè)疊氮離子和氰離子的最低濃度分別為0.1mM和0.3mM；同時(shí)，該發(fā)明方法重現(xiàn)性好、靈敏度高，其測(cè)定的疊氮離子和氰離子濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2分別為0.997和0.995，該發(fā)明方法可用于環(huán)境污水，工業(yè)廢水以及飲用水等各種樣品中的疊氮離子和氰離子的濃度測(cè)定。
【IPC分類】G01N30-02
【公開號(hào)】CN104749273
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510108903
【發(fā)明人】柳志強(qiáng), 鄭裕國(guó), 萬南微, 薛峰, 沈寅初
【申請(qǐng)人】浙江工業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2015年3月12日