一種抗bpi-anca抗體檢測(cè)試紙條的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫分析檢測(cè)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)BPI-ANCA的免疫 層析檢測(cè)試紙的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 炎癥性腸?。╥nflammatoryboweldisease，IBD)是一種病因尚不十分清楚的 慢性非特異性腸道炎性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerativecolitis，UC)和克羅恩病 (Crohn'sdisease，CD)?？肆_恩病于 1932 年由Crohn、Ginzterg和Oppenheime最早描 述，故得此名。1973年，世界衛(wèi)生組織醫(yī)學(xué)科學(xué)國際組織委員會(huì)將本病定名為Crohn病。其 特點(diǎn)為病因未明，多見于青年人，表現(xiàn)為肉芽腫性炎癥病變，合并纖維化與潰瘍。可侵及全 胃腸道的任何部位，包括口腔、肛門，病變呈節(jié)段性或跳躍性分布，并可侵及腸道以外，特別 是皮膚。臨床表現(xiàn)因病變部位、范圍及程度不同而多樣化，病程緩慢，易復(fù)發(fā)。
[0003] IBD是北美和歐洲的常見病，近30年來日本IBD發(fā)病率亦呈逐步增高趨勢(shì)，我國雖 尚無普通人群的流行病學(xué)資料，但近10多年來本病就診人數(shù)呈逐步增加趨勢(shì)則非常明顯。 IBD的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，不僅有消化道癥狀，還可有腸外表現(xiàn)。由于癥狀為腹痛、腹瀉、便 血等非特異性腸炎表現(xiàn)，⑶與UC、以及IBD與結(jié)核性腸炎等其他腸道慢性疾病很難鑒別診 斷，特別在缺乏組織學(xué)證據(jù)時(shí)，需有更多相對(duì)特異性的標(biāo)志物為診斷提供幫助。研宄發(fā)現(xiàn)， 多種非侵入性的生物活性標(biāo)志物對(duì)IBD的診斷及炎癥活動(dòng)性的評(píng)價(jià)具有重要意義。
[0004] 明確具有診斷價(jià)值的血清特異性抗體標(biāo)記物包括核周型抗中性粒細(xì)胞抗體 (pANCA)、抗釀酒酵母抗體（ASCA)、抗胰腺腺泡抗體（PAB)、抗細(xì)胞外膜蛋白復(fù)合物抗體 (OmpC)、12抗體和鞭毛蛋白（包括CBirUFlaX和A4-Fla2)等。其中抗中性粒細(xì)胞胞漿抗 體（anti-neutrophilcytoplasmicantibody，ANCA)ANCA是以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞胞衆(zhòng) 成分為抗原的自身抗體。研發(fā)發(fā)現(xiàn)，與IBD相關(guān)的ANCA抗原蛋白主要包括通透性殺菌蛋白 BPI-ANCA、髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MP0-ANCA)，以及PR3-ANCA。王瓊等報(bào)道（齊齊 哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2010年第31卷第23期），約46. 9%的pANCA陽性的UC患者為BPI-ANCA 抗體陽性，而⑶患者中PBI-ANCA抗體陽性率只有3. 3%，提示該指標(biāo)可用于有效鑒別UC和 CD。BPI是一類陰離子抗菌蛋白，由于BPI有結(jié)合脂多糖、中和內(nèi)毒素的作用，是宿主反應(yīng) 中中性粒細(xì)胞殺滅革蘭陰性桿菌的活性蛋白。因此它是粒細(xì)胞防御和清除外界感染的重要 因子。UC患者BPI-ANCA抗體的出現(xiàn)可能與機(jī)體在某種微生物感染后，觸發(fā)中性粒細(xì)胞BPI 的合成和釋放增加，而機(jī)體的免疫識(shí)別及調(diào)節(jié)的異?？僧a(chǎn)生針對(duì)BPI的自身抗體。
[0005] 現(xiàn)有BPI-ANCA的檢測(cè)方法主要有兩種：間接免疫熒光法（Indirect immunofluorescenceassay,IIF)和酶聯(lián)免疫吸附法（Enzymelinkedimmunosorbent assay，ELISA)oELISA法檢測(cè)可用于高通量標(biāo)本測(cè)定，靈敏度也比較高，目前也被廣泛認(rèn)可， 但其操作比較繁瑣，需要多次加樣洗滌及孵育步驟，完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程需要3小時(shí)左右，需 要酶標(biāo)儀，對(duì)于實(shí)驗(yàn)人員專業(yè)技術(shù)要求比較高，同時(shí)受到各種環(huán)境條件的影響，對(duì)實(shí)驗(yàn)帶來 諸多不便。
[0006] 間接免疫熒光檢測(cè)技術(shù)是把抗原細(xì)胞固定在載玻片上，熒光染色用熒光顯微鏡進(jìn) 行觀察，該技術(shù)具有高特異性，但由于顯微鏡觀察需要主觀判斷，對(duì)檢驗(yàn)人員的要求高，并 且依賴于熒光顯微鏡，使用不便。
[0007] 免疫層析法（Immunochromatography)是近幾年來興起的一種快速診斷技術(shù)，其 原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的纖維 素一端浸入樣品（尿液或血清）后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至 固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成肉眼可見的檢 測(cè)帶。現(xiàn)有的免疫層析試紙條產(chǎn)品常用的示蹤標(biāo)記粒子有納米金、納米硒、彩色膠乳等等， 其中以納米金應(yīng)用最為廣泛，納米金也稱為膠體金。
[0008] 以膠體金作為失蹤標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)特稱為免疫膠體金技術(shù)（Immune colloidalgoldtechnique，GICT)。膠體金是由氯金酸（HAuC14)在還原劑如白磷、抗壞血 酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定 的膠體狀態(tài)而得名。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢 固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì) 結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物 理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而 使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。
[0009] 表面帶活性基團(tuán)的彩色膠乳微球也可以作為免疫層析的示蹤劑，與膠體金技術(shù)一 樣，彩色膠乳標(biāo)記免疫層析技術(shù)也具有操作簡便、試劑穩(wěn)定、快速出結(jié)果、可室溫保存等優(yōu) 點(diǎn)。彩色膠乳標(biāo)記是將不同直徑范圍〇.IUM~IUM彩色膠乳微球與含有羧基、氨基、羥基 等酯類或其他大分子物質(zhì)共價(jià)結(jié)合，使這些大分子標(biāo)記上顏色，當(dāng)在檢測(cè)線或質(zhì)控線上富 集停留后形成肉眼可見的彩色條帶。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)ELISA和IFA相比，免疫層析法檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)主要包括：（1)使用方便 快速，便于基層使用和現(xiàn)場使用，所有反應(yīng)能在20分鐘內(nèi)完成；（2)成本低，不需要特殊的 儀器設(shè)備；（3)應(yīng)用范圍廣，可適應(yīng)多種檢測(cè)條件；(4)可以進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè)，若陽性樣本比較 難獲得，多項(xiàng)檢測(cè)可以節(jié)省樣品，降低成本；（5)標(biāo)記物穩(wěn)定，標(biāo)記樣品在4°C貯存兩年年以 上，無信號(hào)衰減現(xiàn)象；(6)膠體金本身為紅色，不需要加入發(fā)色試劑，省卻了酶標(biāo)的致癌性 底物及終止液的步驟，對(duì)人體無毒害。
[0011] 在自體免疫性疾病診斷方面，已出現(xiàn)較多的免疫層析試紙，但基于抗BPI-ANCA抗 體檢測(cè)的免疫層析試紙?jiān)趪鴥?nèi)外市場上仍沒有問世。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有方法的不足，將免疫層析法應(yīng)用到抗 BPI-ANCA抗體的檢測(cè)中，采用間接免疫法來實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中的抗BPI-ANCA抗體進(jìn)行檢測(cè)，通 過把BPI-ANCA抗原蛋白包被在結(jié)合墊或分析膜的檢測(cè)帶上，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中抗BPI-ANCA抗 體的高特異、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的檢測(cè)，快速篩查抗BPI-ANCA抗體陽性標(biāo)本，為臨床炎癥 性腸病等自體免疫性疾病提供快速的輔助診斷。
[0013] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種快速、準(zhǔn)確的抗BPI-ANCA抗體的免疫層析檢測(cè) 試紙條及制備方法，目的之二是提供一種基于免疫層析技術(shù)的抗BPI-ANCA抗體檢測(cè)方法。
[0014] 作為本發(fā)明第一個(gè)方面的一種抗BPI-ANCA抗體的免疫層析檢測(cè)試紙條，包括樣 品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水墊和底板，分析膜上設(shè)置檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，所述底板的上部貼合 有分析膜，分析膜上部的兩端分別貼合有結(jié)合墊和吸水墊，結(jié)合墊上部的一端貼合有樣品 墊。
[0015] 所述的結(jié)合墊（2)包被膠體金標(biāo)記物或彩色膠乳標(biāo)記物。
[0016] 所述的結(jié)合墊為1層（圖1)或2層（圖2)，其中2層時(shí)錯(cuò)落與分析膜搭接。
[0017] 所述檢測(cè)帶⑷設(shè)1條或2條，用于同時(shí)或分別檢測(cè)BPI-ANCA抗體的IgG型和 IgA型。
[0018] 所述抗BPI-ANCA抗體的免疫層析檢測(cè)試紙條的制備方法，包括以下步驟：
[0019] 步驟I.BPI-ANCA抗原蛋白的制備
[0020] 步驟2.結(jié)合墊⑵制備
[0021] (1)納米金標(biāo)記物的制備：用納米金溶液標(biāo)記BPI-ANCA抗原蛋白、抗人IgG抗體、 抗人IgA、葡萄球菌A蛋白（SPA)、鏈球菌G蛋白（ProteinG)，以及其他與質(zhì)控帶C線能形 成免疫復(fù)合物的蛋白。
[0022] (2)彩色膠乳標(biāo)記物的制備：用帶活性氨基或羧基基團(tuán)的彩色膠乳標(biāo)記BPI-ANCA 抗原蛋白、抗人IgG抗體、抗人IgA葡萄球菌A蛋白（SPA)、鏈球菌G蛋白（ProteinG)，以 及其他與質(zhì)控帶C線能形成免疫復(fù)合物的蛋白。
[0023] (3)結(jié)合墊（2)制備：玻璃纖維膜或聚脂膜作為結(jié)合墊，先用含BSA和糖的緩沖液 預(yù)處理并烘干，將步驟（1)制備的納米金標(biāo)記物或膠乳標(biāo)記物，用噴涂儀噴涂在預(yù)處理的 玻璃纖維膜或聚脂膜上，干燥備用。
[0024] 步驟3.分析膜（3)制備
[0025] (1)檢測(cè)帶T線⑷制備：根據(jù)結(jié)合墊標(biāo)記蛋白類型選擇檢測(cè)帶T線包被蛋白，如 結(jié)合墊上的結(jié)合蛋白含BPI-ANCA，檢測(cè)帶T線的包被蛋白是抗人IgG或/和IgA。如果結(jié) 合墊上含有抗人IgG或/和IgA，檢測(cè)帶T線包被蛋白為BPI-ANCA。
[0026] (2)質(zhì)控帶C線（5)制備：根據(jù)結(jié)合墊的標(biāo)記蛋白類型選擇質(zhì)控帶的包被蛋白，如 結(jié)合墊標(biāo)記蛋白是單一的BPI-ANCA，質(zhì)控帶C線的包被蛋白為抗BPI-ANCA的抗體；如果結(jié) 合墊標(biāo)記蛋白是單一的抗人IgG或IgA抗體，質(zhì)控帶C線的標(biāo)記蛋白為對(duì)應(yīng)的抗人IgG或 IgA抗體的抗體；或者其他結(jié)合墊標(biāo)記蛋白形成免疫復(fù)合物的蛋白。
[0027] 步驟4.樣品墊制備
[0028] 將玻璃纖維