膜或聚酯膜經(jīng)緩沖液浸漬烘干備用，或者直接使用。
[0029] 步驟5?試紙條組裝
[0030] 把步驟1~4所制作完成的材料，按圖1或圖2搭接，根據(jù)底板的規(guī)格切割成一定 的長度和寬度，安裝在底板和卡殼里。優(yōu)選地，試紙條長度為6. 5cm，寬度為3_或4_。
[0031] 所述的BPI-ANCA抗原蛋白是把全長BPI-ANCA基因或者含有重要抗原表位的基因 序列，克隆到原核或真核表達載體里，表達純化獲得。
[0032] 所述的BPI-ANCA抗原蛋白是用多肽合成儀合成含有BPI-ANCA重要抗原表位的 BPI-ANCA多肽，并偶聯(lián)到載體蛋白上而獲得。
[0033]所述的抗人IgG抗體為鼠源、兔源、羊源、馬源、駱駝源或豚鼠源中的一種或多種 單克隆抗體或多克隆抗體。
[0034] 所述的抗BPI-ANCA的抗體是以BPI-ANCA為免疫源，鼠源、兔源、羊源、馬源、駱駝 源或豚鼠源中的一種或多種單克隆抗體或多克隆抗體。
[0035] 所述的抗人IgG抗體的抗體是指能與該抗體形成免疫復(fù)合物的抗體，比如該抗人 IgG抗體是鼠抗人IgG，它的抗體是羊抗鼠IgG的抗體或其他非鼠源的鼠IgG抗體。
[0036] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種抗BPI-ANCA抗體檢測方法，用本發(fā)明第一方面方 法及步驟所制備的抗BPI-ANCA抗體免疫層析試紙條，對待檢樣品進行檢測，具體步驟：
[0037] (1)樣本處理：取血清、血漿或全血樣本，用加樣緩沖液稀釋0~100倍；
[0038] (2)把上述處理過的樣品滴加到試紙條的樣品墊上，靜置5~20分鐘，觀察T線和 C線；
[0039] (3)結(jié)果判讀：T線和C線均顯現(xiàn)，結(jié)果為陽性；T線不顯現(xiàn)，C線顯現(xiàn)，結(jié)果為陰性； T線和C線均不顯現(xiàn)，提示試紙失效。
[0040] 本發(fā)明的檢測原理：
[0041] 選用金標(biāo)/膠乳等標(biāo)記BPI-ANCA抗原蛋白或其他能與待檢樣品中目的物結(jié)合的 蛋白，噴涂在結(jié)合墊上，制成結(jié)合墊；在檢測帶上包被能與標(biāo)記蛋白-目的物蛋白復(fù)合物 發(fā)生免疫反應(yīng)的蛋白，當(dāng)把待檢樣本加樣到樣品墊上后，樣本中的BPI-ANCA抗體與結(jié)合墊 上的標(biāo)記蛋白形成免疫復(fù)合物，由于毛細(xì)管效應(yīng)，該復(fù)合物向吸水墊方向泳動，此復(fù)合物 與包被于檢測帶T線上的抗原蛋白發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，形成金標(biāo)/膠乳蛋白-抗 BPI-ANCA抗體-BPI-ANCA抗原蛋白三聯(lián)體復(fù)合物而被截留在檢測線上，逐漸富集形成較深 的紫紅色條帶或膠乳顏色；由于毛細(xì)效應(yīng)繼續(xù)泳動向前，金標(biāo)/膠乳兔IgG與包被在質(zhì)控線 上的羊抗兔IgG發(fā)生特異的免疫反應(yīng)被截留，逐漸富集在質(zhì)控線上形成較深的紫紅色條帶 或膠乳顏色，多余的未結(jié)合的物質(zhì)繼續(xù)層析到吸水墊上，因此在檢測線和質(zhì)控線都出現(xiàn)條 帶的判為陽性結(jié)果；若血清樣品中不含有抗BPI-ANCA抗體，標(biāo)記蛋白到達檢測線時，不與 包被在檢測線上的相應(yīng)蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，因此在檢測線處沒有出現(xiàn)顯色帶，而金標(biāo)/膠 乳兔IgG繼續(xù)泳動向前與包被于質(zhì)控線處的相應(yīng)包被蛋白發(fā)生特異的免疫反應(yīng)而被截留， 逐漸富集在質(zhì)控線上形成紫紅色條帶或膠乳顏色，因此僅在質(zhì)控上出現(xiàn)條帶判為陰性結(jié) 果。
[0042] 本發(fā)明首次將免疫層析技術(shù)應(yīng)用于抗BPI-ANCA抗體檢測，實現(xiàn)了高特異性、高靈 敏度的檢測性能。與現(xiàn)有文獻報道的ELISA和化學(xué)發(fā)光試劑盒相比，本發(fā)明的優(yōu)點主要包 括：檢測時間短（5~20min);不需要任何特殊儀器，可實現(xiàn)床邊檢測和門診即時檢測；操 作簡便，只需一步反應(yīng)，操作人員無需培訓(xùn)，檢測成本低；對溫度無特殊要求，無需冷凍，儲 存運輸方便，室溫可保存24個月。
【附圖說明】
[0043] 圖1本發(fā)明檢測帶T線1條時的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖1。
[0044] 圖2本發(fā)明檢測帶T線1條時的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖2。
[0045] 圖3本發(fā)明檢測帶T線2條時的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖3。
[0046] 圖4本發(fā)明檢測帶為1條時陽性和陰性結(jié)果示意圖4。
[0047] 其中4a是條帶示意圖；4b為陽性結(jié)果；4c為陰性結(jié)果；4d和4e表示試紙條失效。
[0048] 圖5本發(fā)明檢測帶為2條時陽性和陰性結(jié)果示意圖5. 其中5a是條帶示意圖；5b為IgG和IgA均陽性；5c為IgG陽性，IgA陰性；5d為IgA陽性，IgG陰性；5e為陰性結(jié)果；5f和5g表示試紙失效。
【具體實施方式】
[0049] 本發(fā)明所述的BPI-ANCA抗體檢測免疫層析試紙，如圖1所示，該試紙是在底板（7) 上由一側(cè)向另一側(cè)順次相互搭接地粘貼分析膜（3)、結(jié)合墊（2)、樣品墊（1)、吸水墊（6)。
[0050] 結(jié)合墊（2)上噴涂有金標(biāo)/膠乳標(biāo)記蛋白，分析膜（3)上設(shè)置檢測帶（4)和質(zhì)控 帶（5)，根據(jù)結(jié)合墊上標(biāo)記蛋白的不同，選用相應(yīng)的檢測帶包被蛋白和質(zhì)控帶包被蛋白。優(yōu) 選地，在結(jié)合墊上噴涂的標(biāo)記蛋白為BPI-ANCA抗原蛋白和鼠IgG，貝Ij檢測帶上的包被蛋白 為抗人IgG抗體或/和IgA，質(zhì)控帶上的包被蛋白為抗鼠IgG。另一優(yōu)選，在結(jié)合墊上噴涂 的標(biāo)記蛋白為抗人IgG抗體或/和IgA，貝Ij檢測帶上的包被蛋白為BPI-ANCA抗原蛋白。
[0051] 下面結(jié)合具體實施例和附圖，進一步闡述本發(fā)明。
[0052] 實施例I.BPI-ANCA抗原蛋白制備
[0053] 1)試劑
[0054]大腸桿菌宿主菌DH5a、BL21 (DE3)，克隆載體pCR2.IT-vector，表達質(zhì)粒 pET28a(+)，DNA聚合酶rTaq，T4DNA連接酶，DNA聚合酶rTaq、LATaq以及限制性內(nèi)切酶 BamHI、HindIII和EcoRI、BamHI，DL2000DNAMarker、T4DNA連接酶，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋 白，DNA膠回收試劑盒，IPTG等
[0055] 2)儀器
[0056] 普通搖床SCS-24;隔水式恒溫電熱培養(yǎng)箱；Biophotometer分光光度計、臺式冷凍 離心機Centrifuge5810R、臺式離心機MiniSpin;高速冷凍離心機；蛋白質(zhì)電泳儀以及凝 膠成像系統(tǒng)；PCR儀；超聲裂解儀；恒溫金屬??；HIS蛋白純化柱等。
[0057] 3)實驗方法
[0058]設(shè)計引物CGCCATATGATGAGAGAGAACATGGCCAGG和CCGCTCGAGTCAITT ATAGACAACGTCTGC從模板DNA中PCR擴增出BPI-ANCA片段，膠回收試劑盒回收片段后 連接到pCR2. 1克隆載體進行測序鑒定。將鑒定正確的序列克隆至表達載體pET28a(+)中， 酶切位點為EcoRI、BamHI，同時載體上有6XHIS標(biāo)簽，便于后續(xù)的蛋白純化。
[0059] b?表達
[0060] 將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)，通過抗性篩選陽性表達菌株。將篩選 出來的陽性菌液按1 : 1000的比例接種加有Kan抗性的LB培養(yǎng)基中，每個菌接種兩管，一 管用于誘導(dǎo)，另一管用于非誘導(dǎo)對照，同時要接種一管空質(zhì)粒菌作對照。37°C過夜培養(yǎng)至 0D600值約為0. 4-0. 6時，誘導(dǎo)管和空質(zhì)粒對照管加入IPTG至終濃度為lmmol/L，非誘導(dǎo)對 照不加，最終選擇表達能力高的兩個菌，用于大量的蛋白的表達。并按照常規(guī)的SDS-PAGE 方法對表達產(chǎn)物進行鑒定。
[0061]c?純化
[0062] 將表達的產(chǎn)物用HIS蛋白純化柱純化蛋白，并透析脫鹽，經(jīng)測定純化后的蛋白濃 度為 509mg/L。
[0063]BPI-ANCA抗原蛋白制備方法2:篩選BPI-ANCA重要抗原表位多肽2-5個，用多肽 合成儀進行從從C端（羧基端）向N端（氨基端）合成，然后與載體蛋白偶聯(lián)，使分子量 增大，便于結(jié)合在結(jié)合墊和分析膜上。常用的載體蛋白包括但不限于牛血清白蛋白（BSA)、卵清蛋白（OA)、鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH)、人血清白蛋白（HSA)及人工合成的多聚賴氨酸（PLL) 等。
[0064] 實施例2抗體制備
[0065] 結(jié)合墊及檢測帶包被抗體抗人IgG單克隆抗體和多克隆抗體，以及用于質(zhì)控帶和 結(jié)合墊其他動物來源的單克隆抗體和多克隆抗體，可通過免疫動物獲得。
[0066] 1、單克隆抗體制備的具體操作方法為：
[0067] 1)通過將0? 05mg~Img免疫制劑（分別針對山羊或小鼠或兔子）與1倍體積的 弗氏完全佐劑混合得到注射溶液，將該注射溶液在動物皮內(nèi)多部位注射；
[0068] 2) -個月后將動物用的人IgG的弗氏完全佐劑混合液經(jīng)多部位動物皮下注射而 加強免疫。7~14天后將動物放血，測定抗血清滴度。
[0069] 3)對動物加強免疫直至滴度達到平臺期。通過從被免疫的動物回收脾細(xì)胞與小鼠 骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，篩選后即可得到能穩(wěn)定表達目的抗體的雜交瘤細(xì)胞。
[0070] 4)體外培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞，接種小鼠或大鼠腹腔，取腹水純化獲得單克隆抗體； 或者從培養(yǎng)上清液中純化獲得單克隆抗體。
[0071] 2、多克隆抗體制備：
[0072]同單克隆抗體步驟1)和2)，在獲得抗血清后，純化抗血清獲得多克隆抗體。
[0073] 3、葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白制備
[0074] 根據(jù)葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白的基因序列，可通過大腸桿菌原核表達克隆 化基因來制備，具體操作方法可參見（分子克隆實驗指南），或?qū)嵤├?BPI-ANCA的步驟。
[0075] 實施例3膠體金層析各組分制備
[0076] (1)膠體金溶液制備
[0077] 用去離子水配制0? 01% (w/v)的氯金酸溶液