基于金屬釕多吡啶配合物的三聚氰胺熒光光譜檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種三聚氰胺的檢測方法，尤其是涉及一種基于金屬釕多吡啶配合物 的三聚氰胺熒光光譜檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 三聚氰胺（C3H3N6),是一種白色單斜晶體，俗稱為密胺或者蛋白精，是一種重要的 氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，通常被廣泛的應(yīng)用于防火材料。三聚氰胺不是食品添加劑，不允許加 入到食品和動(dòng)物飼料中。但近年來不法分子為提高奶粉的含氮量在嬰幼兒奶粉中加入三聚 氰胺，摻有三聚氰胺的奶粉導(dǎo)致多名嬰幼兒發(fā)生泌尿系統(tǒng)疾病，導(dǎo)致眾多的嬰幼兒身體健 康出現(xiàn)問題，并有死亡病例。通常，食品中蛋白質(zhì)含量的檢測方法為一凱氏定氮法，該方法 是通過檢測食品中氮的含量來確定蛋白質(zhì)的當(dāng)量。蛋白質(zhì)主要是由氨基酸組成的，而蛋白 質(zhì)的平均含氮量是16%左右，而三聚氰胺的含氮量達(dá)到了 67%左右。由于凱氏定氮法的存 在的不足，一些不法商人將三聚氰胺作為食品添加劑添加入食品及相關(guān)產(chǎn)品中（如嬰幼兒 配方奶粉、牛奶、酸奶、寵物飼料等，以提高產(chǎn)品中氮的檢測含量降低產(chǎn)品成本。而三聚氰胺 作為一種白色晶體，無味，使得三聚氰胺添加入食品中后不易被發(fā)現(xiàn)，從而劣質(zhì)的食品通過 了檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的檢驗(yàn)。三聚氰胺不能在體內(nèi)代謝，過多的攝入這種食品不但會(huì)引起腎結(jié)石，而 且還會(huì)因?yàn)榈鞍踪|(zhì)攝入不足引起營養(yǎng)不良。所以，必須嚴(yán)格控制三聚氰胺在奶制品和其它 食品中使用。如何快速、高效、準(zhǔn)確進(jìn)行三聚氰胺的檢測是人民健康安全的第一保證。
[0003] 目前三聚氰胺的檢測主要有毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法（HPLC)、氣相色譜/ 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC/GC-MS)、酶聯(lián)免疫法（ELISA)、電化學(xué)方法、納米材料比色法。目 前熒光光譜法檢測三聚氰胺還比較少的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種基于金屬釕多 吡啶配合物的三聚氰胺熒光光譜檢測方法。
[0005] 本發(fā)明利用三聚氰胺可以和富含胸腺嘧啶的DNA形成特殊的三個(gè)氫鍵作用，從而 使DNA由單鏈轉(zhuǎn)變?yōu)槿?，由于[Ru (phen) 2dppZ-idz0]2+對三鏈DNA的強(qiáng)插入作用，造成的 熒光增強(qiáng)幅度明顯強(qiáng)于單鏈DNA。根據(jù)三聚氰胺的濃度與熒光響應(yīng)值的關(guān)系，確定線性關(guān) 系。
[0006] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種基于金屬釕多吡啶配合物的三聚氰胺熒光光譜檢測方法，包括以下步驟：
[0008] (1)制作三聚氰胺濃度與熒光強(qiáng)度響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線：
[0009] (I. 1)在不同梯度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液中，分別加入富含胸腺嘧啶的DNA(簡稱富T DNA)，用緩沖液稀釋后，在室溫下孵化一段時(shí)間；
[0010] (1. 2)將金屬釕多吡啶配合物加入步驟（I. 1)所得混合物中，室溫下培養(yǎng)；
[0011] (1. 3)將步驟（1. 2)所得混合液震蕩，混合均勻后，移入比色皿中進(jìn)行熒光測定；
[0012] (I. 4)做出三聚氰胺濃度與熒光強(qiáng)度響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0013] (2)待測樣品三聚氰胺濃度的測定：
[0014] (2. 1)在待測樣品中，加入富含胸腺嘧啶的DNA，用緩沖液稀釋后，在室溫下孵化 一段時(shí)間；
[0015] (2. 2)將金屬釕多吡啶配合物加入步驟（2. 1)所得混合物中，室溫下培養(yǎng)；
[0016] (2. 3)將步驟（2. 2)所得混合液震蕩，混合均勻后，移入比色皿中進(jìn)行熒光測定；
[0017] (2.4)根據(jù)測得的熒光強(qiáng)度以及步驟（1.4)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測樣品中三 聚氰胺濃度。
[0018] 優(yōu)選地，所述的富含胸腺嘧啶的DNA序列從5' -3'為 ττττττττττττττττττττττττττττττ，命名為 Τ3〇。
[0019] 優(yōu)選地，所述的富含胸腺嘧啶的DNA在加入三聚氰胺后的終濃度為1. 5 μ mol/L。
[0020] 優(yōu)選地，所述的緩沖液為lOmmol/L Tris-HCl，pH為7· 0。
[0021] 所述的金屬釕多吡啶配合物化學(xué)式為[Ru(phen)2dppz_idzo] 2+，其中，phen為 1，10-鄰菲羅啉，dppz為雙吡啶并吩嗪，idzo為咪唑啉酮。
[0022] 優(yōu)選地，所述的金屬釕多吡啶配合物最終濃度為3. 0 μ mol/L。
[0023] 優(yōu)選地，步驟（I. 1)中，三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液的濃度依次為0,1.0, 2.0, 3.0,4.0, 5.0， 6· 0,7· 0,8· 0,9· 0,10. 0,11. 0,12. 0,14. 0 和 16. 0 ymol/L〇
[0024] 步驟（1.3)與步驟（2.3)中，進(jìn)行熒光測定的條件相同，優(yōu)選為：測量類型為 Wavelength scan，激發(fā)波長為405nm，掃描范圍為500-800nm，數(shù)據(jù)點(diǎn)采集間隔lnm，激發(fā)和 發(fā)射狹縫均為IOnm。
[0025] 優(yōu)選地，室溫下孵化或培養(yǎng)的時(shí)間為15分鐘。
[0026] 優(yōu)選地，進(jìn)行焚光測定前，樣品總體體積為lmL，比色皿橫截面為10_X 10_。
[0027] 由于金屬釕多吡啶配合物具有良好的光化學(xué)、光物理性能和豐富的譜學(xué)性質(zhì)，以 及獨(dú)特的DNA鍵合能力，在DNA分子光開關(guān)、DNA結(jié)構(gòu)探針、DNA介導(dǎo)的電荷轉(zhuǎn)移、DNA足跡 試劑、DNA斷裂試劑及抗癌藥物等方面有著廣泛的應(yīng)用，在生物無機(jī)化學(xué)、材料化學(xué)、分析化 學(xué)，及理論化學(xué)等領(lǐng)域中引起了極大關(guān)注，成為十分活躍的前沿與交叉研宄領(lǐng)域。
[0028] 本發(fā)明利用的金屬釕多吡啶配合物具有很優(yōu)異的DNA分子光開關(guān)效應(yīng)。關(guān)于其分 子光開關(guān)效應(yīng)機(jī)制目前認(rèn)可度較高的觀點(diǎn)認(rèn)為，此類釕配合物的光開關(guān)效應(yīng)得益于其自身 存在的兩個(gè)不同的電荷迀移躍迀(MLCT)能態(tài)。在非質(zhì)子溶劑中，最低能態(tài)是"明態(tài)"(bright state, BS)，主要和配體的phen部分有關(guān)（包括dppz中的雙吡啶部分），此時(shí)在激發(fā)光存在 的條件下通常能夠觀察到熒光或磷光，因?yàn)榧ぐl(fā)態(tài)電子從BS迀回基態(tài)時(shí)以光輻射的形式 放出能量。在質(zhì)子溶劑中，配體吩嘆（phenazine，phz)部分的N原子與溶劑發(fā)生氫鍵作用 使得"暗態(tài)"（dark state，DS)的能量下降至低于BS的能量，此時(shí)配合物將不再發(fā)光，激發(fā) 態(tài)電子將以振動(dòng)弛豫的形式返回基態(tài)。由于三聚氰胺可以和富T DNA序列形成特殊的三個(gè) 氫鍵作用，從而使DNA由單鏈轉(zhuǎn)變?yōu)槿?，由于[Ru (phen) 2dppZ-idz0]2+對三鏈DNA的強(qiáng)插 入作用，造成的熒光增強(qiáng)幅度明顯強(qiáng)于單鏈DNA，該配合物用于三聚氰胺的檢測。
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[0030] 1、本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了三聚氰胺檢測的步驟簡單、過程快速、反應(yīng)靈敏。
[0031] 2、本發(fā)明的方法為免標(biāo)記的熒光檢測，省去了 DNA熒光標(biāo)記標(biāo)記的復(fù)雜過程及昂 貴費(fèi)用，檢測成本低。
[0032] 3、本發(fā)明靈敏度高，選擇性好。
[0033] 4、本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了對實(shí)際純牛奶樣品的檢測，具有實(shí)際應(yīng)用意義。
[0034] 6、本發(fā)明的方法具有條件溫和、節(jié)能高效、易于控制等特點(diǎn)。
【附圖說明】
[0035] 圖1為三聚氰胺、富含胸腺喃啶的DNA及[Ru(phen)2dppz_idzo] 2+作用原理圖。
[0036] 圖2為實(shí)施例1中，室溫時(shí)在lOmmol/LTris-HCl (pH為7. 0)緩沖液里， [Ru (phen) 2dppz-idzo] 2+-T30 在不同的三聚氰胺濃度（0，1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7· 0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 14.0和16.0 ymol/L)存在下的熒光光譜圖（激發(fā)波長為 405nm)〇
[0037] 圖3為實(shí)施例1中，室溫時(shí)在lOmmol/L Tris-HCl (pH為7. 0)緩沖液里， [Ru(phen)2dppz-idzo]2+-T30在不同的三聚氰胺濃度（從下至上依次為0, L 0, 2. 0, 3. 0, 4 ? 0, 5. 0, 6. 0, 7. 0, 8. 0, 9. 0, 10. 0, 11. 0, 12. 0, 14. 0 和 16. 0 μmol/L)存在下的熒光強(qiáng)度曲線 (激發(fā)波長為405nm，發(fā)射波長為6IOnm) 〇
[0038] 圖4為實(shí)施例1中，室溫時(shí)在lOmmol/L Tris-HCl (pH為7. 0)緩沖液里， [Ru(phen)2dppZ-idz0] 2+-T30的熒光強(qiáng)度與三聚氰胺濃度的線性關(guān)系圖（激發(fā)波長為 405nm，發(fā)射波長為610nm)。
[0039] 圖5為實(shí)施例2中，室溫時(shí)在lOmmol/L Tris-HCl (pH為7.0)緩沖液里，不同干 擾物在[Ru(phen)2dppZ-id Z0]2+-T30體系中熒光強(qiáng)度圖（激發(fā)波長為405nm，發(fā)射波長為 610nm)。干擾物最終濃度為10 μ mol/L，三聚氰胺最終濃度為5 μ mol/L。Ftl為空白時(shí)的熒 光強(qiáng)度，F(xiàn)為干擾物的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)m為三聚氰胺的熒光強(qiáng)度。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0041] 實(shí)施例1
[0042] 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)待測液的熒光檢測
[0043] (1)富T DNA與三聚氰胺作用
[0044] 將待測的三聚氰胺溶于甲醇中，制成不同梯度的三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)待測液。用移液 槍在15個(gè)離心管（I. 5mL)中分別先加入15yL T30(濃度為100μ mol/L，序列從5'-3'為： ττττττττττττττττττττττττττττττ)，然后用移液槍依次加入不同濃度的三聚氰胺待測液， 用10mmol/LTris-HCl(pH為7. 0)緩沖液稀釋至985 yL?；旌衔镌谑覝叵路趸?5分鐘。富 T DNA能與三聚氰胺形成特殊的三個(gè)氫鍵作用，故形成三鏈結(jié)構(gòu)。富T DNA從單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變 為三鏈結(jié)構(gòu)。
[0045] (2) [Ru(phen)2dppz_idzo]2+插入三鏈結(jié)構(gòu)
[0046]將 15