多分析物試驗的制作方法
【專利說明】多分析物試驗
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本申請要求分別于2012年10月5日和2013年3月4日提交的美國臨時專利申 請No. 61/710, 651和61/772, 523的益處。將那些申請的每一篇的公開內(nèi)容全部按引用并 入本文中。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及利用固定于顆粒上的多價結(jié)合劑的結(jié)合試驗，尤其是免疫試驗。本發(fā) 明還涉及增大顆粒的大小提高了篩選的靈敏度這一令人驚訝的發(fā)現(xiàn)。
[0004] 發(fā)明背景
[0005]測試液體樣品的細菌污染是各種領(lǐng)域中的重要組成部分，如醫(yī)學(xué)（例如，測試用 于輸血的血樣）、環(huán)境安全（例如，測試用于人使用的水樣）和食品安全（例如，測試用于食 用的食品和飲料樣品）。細菌測試的重要性需要快速、靈敏和特異性足夠?qū)挿阂詸z測多種細 菌種和屬的測試。試驗中的實際限制，如檢測劑（例如，細菌抗原結(jié)合抗體）的量或"陽性" 結(jié)果的可視性可以控制目前的細菌測試方法滿足這些需求的能力。因此，需要用于快速、寬 泛和靈敏地檢測細菌的改良試劑、裝置和方法。
[0006] 發(fā)明簡述
[0007]在第一個方面中，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中的細菌的側(cè)向流動裝置，該裝 置包括用于樣品的流動通道，并且進一步包括對于一種或多種細菌抗原特異性的全類屬 (pan-generic)結(jié)合劑，其中所述全類屬結(jié)合劑固定于一群特定大小的可檢測顆粒上；和 捕獲結(jié)合細菌抗原的顆粒群的捕獲結(jié)合劑，其中捕獲結(jié)合劑固定于流動通道上，并且其中 可檢測顆粒群沿著流動通道排列，使得樣品在接觸捕獲結(jié)合劑之前接觸可檢測顆粒群。在 一些實施方案中，可檢測顆粒是化學(xué)發(fā)光、發(fā)光、熒光、磁或有色顆粒。為了方便，將使用術(shù) 語"有色顆粒"，但本發(fā)明考慮了使用其他形式的可檢測顆粒的實施方案。在利用有色顆 粒的實施方案中，顆?？梢允墙?、銀或鉑顆粒。在一些實施方案中，顆粒直徑為約60至約 120nm。在一些實施方案中，顆粒直徑為約80nm。
[0008] 在一些實施方案中，全類屬結(jié)合劑特異性地結(jié)合革蘭氏陽性細菌抗原。在一些這 樣的實施方案中，全類屬多克隆抗體結(jié)合脂磷壁酸（LTA)。在一些實施方案中，全類屬結(jié)合 劑特異性地結(jié)合革蘭氏陰性細菌抗原。在一些這樣的實施方案中，全類屬多克隆抗體結(jié)合 細菌脂多糖結(jié)構(gòu)（LPS)。在一些實施方案中，至少一種全類屬結(jié)合劑特異性地結(jié)合革蘭氏陽 性細菌抗原而至少一種全類屬結(jié)合劑特異性地結(jié)合革蘭氏陰性細菌抗原。在一些實施方案 中，全類屬結(jié)合劑能夠結(jié)合三個或更多個屬的細菌。在一些實施方案中，全類屬結(jié)合劑通過 銜接物固定于可檢測顆粒上。在一些實施方案中，銜接物是蛋白A、蛋白G或蛋白L。
[0009]在一些實施方案中，全類屬結(jié)合劑是抗體。在一些實施方案中，全類屬結(jié)合劑包括 兩種或更多種全類屬抗體，其中每種全類屬抗體特異性地結(jié)合一種或多種細菌抗原。在各 種實施方案中，每種全類屬抗體固定于有色顆粒的分開亞群上或相同的亞群上。根據(jù)本發(fā) 明，至少一種全類屬抗體固定于一群特定大小的有色顆粒上。在一些實施方案中，可以將全 類屬結(jié)合劑與一種或多種非全類屬的結(jié)合劑組合。例如，不是全類屬的結(jié)合劑可以結(jié)合細 菌的一個或多個種或菌株，但不是結(jié)合到多個屬上。
[0010] 在一些實施方案中，全類屬抗體選自多克隆抗體、單克隆抗體以及多克隆和單克 隆抗體的組合。在一些實施方案中，全類屬抗體是多克隆的，并且結(jié)合多種細菌抗原。在一 些實施方案中，全類屬抗體是多克隆的并且結(jié)合多種革蘭氏陽性細菌抗原。在一些實施方 案中，全類屬抗體是多克隆的并且結(jié)合多種革蘭氏陰性細菌抗原。在一些實施方案中，全類 屬抗體是多克隆的，并且結(jié)合多種革蘭氏陰性細菌抗原和革蘭氏陽性細菌抗原。在一些實 施方案中，至少一種全類屬抗體是單克隆全類屬抗體而至少一種全類屬抗體是多克隆全類 屬抗體。
[0011] 在一些實施方案中，全類屬抗體特異性地結(jié)合革蘭氏陽性細菌抗原。在一些實施 方案中，全類屬抗體特異性地結(jié)合革蘭氏陰性細菌抗原。在一些實施方案中，至少一種全類 屬抗體特異性地結(jié)合革蘭氏陽性細菌抗原而至少一種全類屬抗體特異性地結(jié)合革蘭氏陰 性細菌抗原。在一些實施方案中，全類屬抗體能夠結(jié)合三個或多個屬的細菌。在一些實施 方案中，全類屬結(jié)合抗體通過銜接物固定于有色顆粒上。
[0012] 在一些實施方案中，裝置包括至少三種特異性地結(jié)合革蘭氏陽性細菌抗原的全類 屬結(jié)合劑，每種全類屬結(jié)合劑固定于有色顆粒的分開亞群上；以及至少三種特異性地結(jié)合 革蘭氏陰性細菌抗原的全類屬結(jié)合劑，每種全類屬結(jié)合劑固定于有色顆粒的分開亞群上。 在一些實施方案中，至少一種全類屬結(jié)合劑是抗體。在一些實施方案中，至少一種全類屬抗 體是單克隆抗體。在一些實施方案中，顆粒的亞群是不同大小的。在一些實施方案中，顆粒 是金、銀或鉑。在一些實施方案中，至少一些顆粒的直徑為約60nm至約120nm。在一些實施 方案中，至少一些顆粒是直徑約60nm至約120nm的金顆粒。在一些實施方案中，至少一個 顆粒群（例如，金顆粒群）包括80nm顆粒。在一些實施方案中，至少一個顆粒群（例如，金 顆粒群）包括40nm顆粒。
[0013] 在一些實施方案中，捕獲結(jié)合劑是特異性地結(jié)合細菌抗原的全類屬抗體。在一些 實施方案中，捕獲結(jié)合劑與全類屬結(jié)合劑相同。在一些實施方案中，捕獲抗體固定于樣品流 動通道上的一個或多個位置中。在一些實施方案中，樣品流動通道是吸收膜。在一些實施 方案中，吸收膜是硝基纖維素。
[0014] 在一些實施方案中，將有色顆粒在安置在吸收膜上方并且與膜的上表面接觸的固 體支持物表面內(nèi)干燥。
[0015] 在第二個方面中，本發(fā)明提供了檢測樣品中存在或不存在細菌的方法，包括將樣 品與細菌抗原特異性的全類屬結(jié)合劑接觸，其中全類屬結(jié)合劑固定于特定大小的有色顆粒 上，并且其中樣品在允許全類屬結(jié)合劑和細菌抗原之間結(jié)合形成結(jié)合劑-細菌抗原復(fù)合物 的條件下與全類屬結(jié)合劑接觸，并且進一步包括將固定的細菌抗原特異性的捕獲結(jié)合劑在 允許固定的捕獲結(jié)合劑和顆粒-全類屬結(jié)合劑-細菌抗原復(fù)合物之間結(jié)合的條件下與特定 大小的有色顆粒接觸，其中通過捕獲結(jié)合劑捕獲帶有全類屬結(jié)合劑的有色顆粒表明樣品中 存在細菌。在一些實施方案中，在試驗進行前，將少量可溶性全類屬結(jié)合劑添加到樣品中。 如此少量是足以提高系統(tǒng)信號的量。
[0016] 在一些實施方案中，該方法包括將根據(jù)本發(fā)明第一個方面的裝置在允許捕獲抗體 結(jié)合帶有全類屬抗體的有色顆粒的條件下與全類屬抗體接觸，其中通過捕獲抗體捕獲顆粒 表明樣品中存在細菌。
[0017] 在一些實施方案中，樣品已經(jīng)經(jīng)過預(yù)處理。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明，樣品可以是懷疑含有細菌的任何液體樣品。在一些實施方案中，樣品 是生物流體，包括尿液、痰液、脊髓液、腹水、血液和血液制品。在一些實施方案中，樣品是懷 疑含有細菌的任何樣品。在一些實施方案中，樣品是血液或血液制品。在一些實施方案中， 血液或血液制品選自：全血、白細胞、造血干細胞、血小板、紅細胞、血漿、骨髓和血清。
[0019] 在一些實施方案中，血液或血液制品，如血小板，來自用于輸血給接受者的捐獻 者。在一些實施方案中，樣品是透析樣品。在一些實施方案中，透析樣品選自血液透析流體 和腹膜透析流體。在一些實施方案中，樣品是其中已經(jīng)保存了組織（如來自用于輸血給接 受者的捐獻者的組織）的流體樣品。在一些實施方案中，組織選自：血細胞培養(yǎng)物、干細胞 培養(yǎng)物、皮膚和骨和軟骨移植物材料。在一些實施方案中，樣品是來自肺、支氣管肺泡、腹膜 或關(guān)節(jié)內(nèi)窺鏡檢查灌洗。在一些實施方案中，樣品是環(huán)境樣品，如水和土壤。在一些實施方 案中，樣品是食物或飲料。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到在其中樣品來源是固體形式的情況中， 如土壤或固體食物，樣品可以是從固體性質(zhì)提取的液體或已經(jīng)與固體形式接觸的液體。在 一些實施方案中，樣品是生物樣品，例如，尿液、淚液、痰液或腦脊髓液。
[0020] 在第三個方面中，本發(fā)明提供了用于結(jié)合試驗中的試劑，包括選自金顆粒、銀顆粒 和鉑顆粒的顆粒，其中顆粒大小為約60nm至約120nm，并且其中顆粒結(jié)合到多特異性全類 屬結(jié)合劑上。在一些實施方案中，顆粒大小約80nm。在一些實施方案中，全類屬結(jié)合劑通過 銜接物結(jié)合到顆粒上。在一些實施方案中，銜接物選自蛋白A、蛋白G和蛋白L。在一些實 施方案中，銜接物是蛋白A。在一些實施方案中，顆粒是金。
[0021] 在第四個方面中，本發(fā)明提供了檢測樣品中的物質(zhì)的方法，包括將樣品與根據(jù)本 發(fā)明第三個方面的試劑混合，其中物質(zhì)與試劑的結(jié)合形成可檢測的復(fù)合物；并且檢測復(fù)合 物。
[0022] 附圖簡述
[0023] 圖1A是說明了使用較大的膠態(tài)金顆粒在每個反應(yīng)不同數(shù)量的顆粒下導(dǎo)致捕獲線 上較高的信號強度的圖。圖1B是來自模型側(cè)向流動系統(tǒng)中50%稀釋系列的40nm( "通用 的"）金顆粒的照片，其中在兔子IgG捕獲線上捕獲了葡萄球菌蛋白A覆蓋的顆粒。圖1C 是來自模型側(cè)向流動系統(tǒng)中50%稀釋系列的80nm( "增強的"）金顆粒的一組照片，其中在 兔子IgG捕獲線上捕獲了葡萄球菌蛋白A覆蓋的顆粒。
[0024] 圖2是取自模型側(cè)向流動條帶的照片。這些結(jié)果從8種不同的細菌裂解產(chǎn)物的十 倍稀釋獲得，并且從1〇8儲液開始產(chǎn)生，并且將所得到的樣品在側(cè)向流