一種用于蛋白同化激素免疫分析的酶標(biāo)抗原及分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于小分子化合物免疫化學(xué)和多殘留分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種用于蛋白同化激素免疫分析的酶標(biāo)抗原及分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白同化激素(anabolic steroid)亦稱同化激素，是甾體類激素。其主要包括諾龍(17 β -19-nortestosterone)，群勃龍(β -trenbolone)、丙酸諾龍(19-nortestosterone prop1nate)、雄諾龍(stanolone)、美雄諾龍(mestanolone)和替勃龍(tibolone)等。
[0003]蛋白同化激素過多在人體內(nèi)蓄積會(huì)對(duì)機(jī)體多方面造成不良影響。例如，在人的肝功能異常中，蛋白同化激素作用會(huì)使谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶酶、膽紅素、和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性提高，對(duì)肝臟產(chǎn)生毒副作用，形成肝充血性囊腫，甚至癌癥的。而據(jù)可靠相關(guān)報(bào)道表明，心血管病中的冠心病是由蛋白同化激素中低密度脂蛋白膽固醇過高而引起。此外，蛋白同化激素中的類固醇能夠極大影響生殖系統(tǒng)發(fā)育。兒童或少年食用過多蛋白同化激素會(huì)出現(xiàn)不良發(fā)育的現(xiàn)行。常見的表現(xiàn)有身材矮小，肌肉不自主抽搐等。
[0004]然而，由于蛋白同化激素經(jīng)常被非法添加到動(dòng)物食用的飼料當(dāng)中，用以促進(jìn)動(dòng)物增長(zhǎng)，造成我國食品中此類藥物殘留現(xiàn)象大量存在，嚴(yán)重?cái)_亂了食品市場(chǎng)，影響了食品安全。為打擊這種行為，我國已經(jīng)明確規(guī)定在食用動(dòng)物飼養(yǎng)中嚴(yán)禁使用蛋白同化激素。同時(shí)，在動(dòng)物源性食品及功能食品中不得檢出。
[0005]目前，比較常見的高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)都有被用來檢測(cè)蛋白同化激素。傳統(tǒng)儀器方法存在前處理復(fù)雜，儀器和相應(yīng)配套費(fèi)用昂貴，無法大規(guī)模進(jìn)行平行樣同時(shí)檢測(cè)等缺點(diǎn)。而酶聯(lián)免疫的最低檢出限往往無法達(dá)到我國對(duì)于此類物質(zhì)的檢出限要求。因此迫切需要開發(fā)更加簡(jiǎn)便、快速、靈敏的分析技術(shù)。
[0006]化學(xué)發(fā)光免疫分析方法(chemiluminescence immunoassay, CLIA)結(jié)合了傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫法在大批量樣品快速檢測(cè)方面和化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)高靈敏度兩方面優(yōu)勢(shì)，近年來在小分子有害化合物的免疫分析方法開發(fā)方面成為研宄熱點(diǎn)。
[0007]但是與大分子不同，小分子化合物免疫分析有自身特點(diǎn):
[0008](I)小分子化合物(MW ( 100dolton) 一般不具有免疫原性，不能直接免疫動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體、必須合成突出分子立體結(jié)構(gòu)特異性部位的半抗原，并與大分子載體連接構(gòu)成接合物，才能免疫動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)這一目標(biāo)小分子化合物的特異性抗體。這種半抗原與大分子載體的結(jié)合物稱為人工抗原。人工抗原的制備不是任意的，包括結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合方式、載體種類、以及半抗原與目標(biāo)分析物任何結(jié)構(gòu)上的差異如大小、形狀、成份、構(gòu)型、構(gòu)象、極性、電子云密度等等在內(nèi)的諸因素，都可能極大地影響著相應(yīng)抗體的性質(zhì)，因此它們是決定產(chǎn)生其特異性抗體和建立免疫分析方法的關(guān)鍵。
[0009](2)雖然小分子化合物不具有免疫原性，但具有反應(yīng)原性，即具有與相應(yīng)抗體發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)的能力，并可進(jìn)行體外定量，遵循質(zhì)量作用定律。
[0010]免疫分析技術(shù)被引入小分子殘留分折領(lǐng)域，成為一種最有發(fā)展和應(yīng)用潛力的定量分析技術(shù)之一，受到廣泛的重視。該技術(shù)研宄的關(guān)鍵是半抗原的分子設(shè)計(jì)、合成和人工全抗原及抗體的制備。因此，目標(biāo)分析物分子免疫學(xué)特性，以及如何通過化學(xué)或生化技術(shù)突出和利用這些特性，是該領(lǐng)域重要的研宄內(nèi)容。這一技術(shù)目前已成為微量分析研宄的一個(gè)嶄新領(lǐng)域，可與傳統(tǒng)分析方法并列作為一項(xiàng)新的分析途徑。
[0011](3)化學(xué)發(fā)光免疫分析法在免疫分析方法的基礎(chǔ)上，根據(jù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在某一時(shí)間點(diǎn)的發(fā)光強(qiáng)度(例如峰值強(qiáng)度)或發(fā)光總量來確定反應(yīng)中各組分含量。相比傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析方法，其靈敏度能夠大大提高。
[0012]目前文獻(xiàn)報(bào)道的蛋白同化激素免疫分析方法普遍廣譜性差，一般能同時(shí)檢測(cè)一至三種蛋白同化激素藥物，而針對(duì)三種以上蛋白同化激素藥物殘留化學(xué)發(fā)光免疫分析方法尚未見報(bào)道。蛋白同化激素藥物種類繁多，廣泛應(yīng)用并有一定療效的也有幾十種。如果采用現(xiàn)有的這些分析方法檢測(cè)實(shí)際樣品，往往造成一些蛋白同化激素藥物無法被檢出，檢測(cè)結(jié)果與樣品中真實(shí)的蛋白同化激素殘留量差別較大的情況。因此有必要提供一種能夠同時(shí)檢測(cè)出多種蛋白同化激素的分析方法，解決上述問題，提高免疫檢測(cè)準(zhǔn)確度和檢測(cè)效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]有鑒于此，本發(fā)明旨在提出一種用于蛋白同化激素免疫分析的酶標(biāo)抗原及分析方法，以克服傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫分析方法靈敏度低的缺點(diǎn)并解決當(dāng)前蛋白同化激素藥物多殘留檢測(cè)方法缺乏的問題，結(jié)合化學(xué)發(fā)光技術(shù)能夠同時(shí)檢測(cè)諾龍、群勃龍、丙酸諾龍、雄諾龍和美雄諾龍等五種蛋白同化激素的免疫分析方法。
[0014]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0015]一種用于蛋白同化激素免疫分析的酶標(biāo)抗原，由諾龍半抗原與辣根過氧化酶連接合成，其制備包括如下步驟；
[0016]I)諾龍半抗原的制備，稱取0.5?2.0g諾龍溶于10?25mL無水四氫呋喃中，并加入0.5?2.0g 丁二酸酐、0.6?2.0mL三乙胺和0.2?1.5g4_ 二甲氨基吡啶，在62?70°C溫度下持續(xù)反應(yīng)8?17h，隨后將溶劑旋干，生成物用體積比為1:2?5:6的石油醚與乙酸乙酯的混合液溶解；以體積比為1:2?5:6的石油醚與乙酸乙酯的混合液為展開劑，進(jìn)行純化得到白色晶體，即為諾龍半抗原；
[0017]2)通過活化酯法，以羥基CO = OH為橋梁，使諾龍人工半抗原連接到辣根過氧化酶上，即得到酶標(biāo)抗原。
[0018]優(yōu)選的，步驟I)中，稱取1.316g諾龍溶于14.50mL無水四氫呋喃中，并加入0.960g 丁二酸酐、1.32mL三乙胺和0.584g4_ 二甲氨基吡啶，在60°C溫度下持續(xù)反應(yīng)12h，隨后將溶劑旋干，生成物用體積比為1:1的石油醚與乙酸乙酯的混合液溶解；以體積比為1:1的石油醚與乙酸乙酯的混合液為展開劑，進(jìn)行純化得到白色晶體，即為諾龍半抗原。
[0019]優(yōu)選的，步驟2)中，酶標(biāo)抗原的制備包括如下步驟，
[0020]a)準(zhǔn)確稱量0.03?0.04mmol諾龍半抗原溶于250?350 μ LN-N 二甲基甲酰胺溶液中，分別加入3.5?5.5mgl-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和2?3mgN_羥基琥珀酰亞胺避光5?6°C攪拌反應(yīng)8?12h，得甲液；[0021 ] b)準(zhǔn)確稱量11?12mg辣根過氧化酶，加入到3?5mL的碳酸氫鈉緩沖液中，緩沖溶液的pH為6?8，待完全溶解，得乙液，在冰浴條件下將甲液緩慢加入到乙液中，待完全加入后，3?6°C避光攪拌8?12h，然后將反應(yīng)液在3?6°C、pH為6?8的磷酸鹽緩沖溶液中透析2?4天，即得到酶標(biāo)抗原溶液。
[0022]優(yōu)選的，步驟2)中，酶標(biāo)抗原的制備包括如下步驟，
[0023]a)準(zhǔn)確稱量0.02mmol溶于300 μ LN-N 二甲基甲酰胺溶液中，分別加入4.78mgl-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和2.75mgN-羥基琥珀酰亞胺避光4°C攪拌反應(yīng)1h左右，得甲液；
[0024]b)準(zhǔn)確稱量10.0Omg辣根過氧化酶，加入到4mL的碳酸氫鈉緩沖液中，緩沖溶液的PH為7.4，待完全溶解，得乙液，在冰浴條件下將甲液緩慢地加入到乙液中，待完全加入后，4°C避光攪拌12h，然后將反應(yīng)液在4°C、pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中透析3天，即得到酶標(biāo)抗原溶液。
[0025]本發(fā)明中合成了小分子目標(biāo)分析物的半抗原，并與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)，制備有效的酶標(biāo)抗原。該技術(shù)研宄