的關(guān)鍵是半抗原的分子設(shè)計、合成和酶標(biāo)抗原的制備。其中半抗原的設(shè)計、合成是影響蛋白同化激素免疫分析成敗的關(guān)鍵。
[0026]諾龍結(jié)構(gòu)中不具有合適的基團(tuán)，因此要對諾龍的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，在諾龍的羥基上引入羧基，形成可以與載體蛋白連接的臂。因此，本發(fā)明在設(shè)計合成諾龍人工半抗原時，采用諾龍與丁二酸酐反應(yīng)，來引入活性側(cè)鏈，合成諾龍半抗原，這樣既保持了諾龍半抗原與諾龍、群勃龍、丙酸諾龍、雄諾龍和美雄諾龍等五種蛋白同化激素在結(jié)構(gòu)上的相似性，又使半抗原分子具有了與載體蛋白連接的合適結(jié)構(gòu)。
[0027]利用上述的諾龍人工半抗原與載體蛋白結(jié)合，制得人工抗原，免疫動物制備的抗體。使用protein A_sepharose4B親和層析柱對含有抗蛋白同化激素類藥物抗血清進(jìn)行純化。
[0028]所純化的諾龍抗體與諾龍、群勃龍、丙酸諾龍、雄諾龍和美雄諾龍的特異性結(jié)合率以抑制抗體最大結(jié)合率的50%所需諾龍的濃度即IC5tl值來表示，幾種蛋白同化激素類藥物對本發(fā)明的抗體的IC5tl值分別為，諾龍0.050ng/mL、群勃龍0.094ng/mL、丙酸諾龍0.66ng/mL、雄諾龍1.40ng/mL和美雄諾龍2.40ng/mL。將上述的IC5tl值與國內(nèi)外規(guī)定的蛋白同化激素類藥物最大殘留限量值比較，不難看出，上述五種磺胺藥物的IC5tl值均遠(yuǎn)低于規(guī)定的最大殘留限量值，說明本發(fā)明抗體用于化學(xué)發(fā)光免疫分析時，能夠特異性地同時檢測到五種蛋白同化激素藥物的殘留含量。
[0029]本發(fā)明還提供了一種使用如上所述的用于蛋白同化激素免疫分析的酶標(biāo)抗原的分析方法，包括如下步驟，
[0030]I)包被，先用磷酸鹽緩沖溶液稀釋待包被的諾龍抗體，把稀釋好的諾龍抗體稀釋液加入酶標(biāo)板的微孔中，每微孔添加80?120 μ L洗滌液PBST緩沖液，加完后把酶標(biāo)板置于20?35°C條件下反應(yīng)10?15h，棄去孔中液體，向酶標(biāo)板中加入200?300 μ L洗滌液PBST緩沖液，在震蕩器上震蕩I?4min，棄去洗滌液，即為洗板I次，重復(fù)洗板2?5次；優(yōu)選的，把稀釋好的諾龍抗體稀釋液加入酶標(biāo)板的微孔中，每微孔添加100 μ L洗滌液PBST緩沖液；加完后把酶標(biāo)板置于25°C條件下反應(yīng)10?15h，棄去孔中液體，向酶標(biāo)板中加入250 μ L的洗滌液PBST緩沖液，在震蕩器上震蕩I?4min ;棄去洗滌液，即為洗板I次，重復(fù)洗板2?5次，優(yōu)選的，重復(fù)洗板3次；
[0031]2)封閉:向酶標(biāo)板的每個微孔中加入150?250 μ L封閉液，加完后把酶標(biāo)板置于20?35°C條件下，0.5?1.5h后取出酶標(biāo)板棄去封閉液，重復(fù)洗板2?5次；優(yōu)選的，向酶標(biāo)板的每個微孔中加入200 μ L封閉液，加完后把酶標(biāo)板置于37°C條件下，Ih后取出酶標(biāo)板棄去封閉液，重復(fù)洗板4次；所述封閉液為含有質(zhì)量濃度為0.5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖溶液；
[0032]3)競爭反應(yīng):向酶標(biāo)板的每個微孔先加入50?150 μ L梯度稀釋好的待測物樣溶液或樣品提取液，然后再向其中加入50?150 μ L稀釋的酶標(biāo)抗原溶液，酶標(biāo)抗原是用磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行稀釋，酶標(biāo)板被置于20?35°C條件下孵育0.5?1.5h之后，重復(fù)洗板2?5次；優(yōu)選的，向酶標(biāo)板的每個微孔先加入50 μ L梯度稀釋好的待測物樣溶液或樣品提取液，然后再向其中加入50 μ L稀釋的酶標(biāo)抗原溶液；酶標(biāo)板被置于37°C條件下孵育Ih之后，重復(fù)洗板5次；
[0033]4)檢測發(fā)光值:將上一步洗好的酶標(biāo)板置于熒光化學(xué)發(fā)光分析儀中，設(shè)定好相應(yīng)程序，儀器自動向酶標(biāo)板的每個微孔中加入50?150 μ L化學(xué)發(fā)光底物，10?40s后儀器立即測定每個微孔的發(fā)光強(qiáng)度值；優(yōu)選的，向酶標(biāo)板的每個微孔中加入100 μ L化學(xué)發(fā)光底物，30s后儀器立即測定每個微孔的發(fā)光強(qiáng)度值。
[0034]優(yōu)選的，步驟I)中，所述諾龍抗體是經(jīng)過純化處理的，純化處理步驟如下所述，
[0035]I)平衡柱子:用pH6?9的磷酸鹽緩沖液沖洗管路，流速5?8mL/min，I?3min，裝柱后再用PH6?9的磷酸鹽緩沖液平衡柱子，流速0.5?2mL/min，直至基線水平；優(yōu)選的，用PH7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗管路，流速6.5mL/min，2min，裝柱后再用pH7.4的磷酸鹽緩沖液平衡柱子，流速lmL/min，直至基線水平；
[0036]2)上樣:待基線水平后，將三聚氰胺抗血清用等體積pH6?9的磷酸鹽緩沖液稀釋后上樣，優(yōu)選的，PH 7.4;
[0037]3)上柱，流速為0.2?0.8mL/min,上樣結(jié)束后，用pH6?9的磷酸鹽緩沖液沖柱子，流速0.5?2.0mL/min，諾龍抗體被特異性吸附在填料位點上，其他雜蛋白隨緩沖液流出，直至基線水平；優(yōu)選的，流速為0.5mL/min，上樣結(jié)束后，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液沖柱子，流速lmL/min，直至基線水平；
[0038]4)洗脫:用pH 1.5?3.5的洗脫緩沖液洗脫柱子上結(jié)合的抗體，洗出目的蛋白，流速為0.2?1.5mL/min ;優(yōu)選的，用pH2.7的洗脫緩沖液洗脫柱子上結(jié)合的抗體，洗出目的蛋白，流速為0.5mL/min ；
[0039]5)測定:在200?350nm紫外下檢測洗脫液蛋白濃度；當(dāng)吸光度大于0.1?0.3時，收集洗脫液，收集完畢后迅速用0.5?2.0moI/L Tris調(diào)pH至6.0?9.0 ;優(yōu)選的，在280nm紫外下檢測洗脫液蛋白濃度，當(dāng)吸光度大于0.2時，收集洗脫液，收集完畢后迅速用lmol/L Tris調(diào)pH至7.0 ;所述Tris為三輕甲基氨基甲燒；
[0040]6)抗體的透析與保存:用pH 6?9抗體透析液透析所得抗體，2?6°C透析2?4天，每天換2?4次透析，透析后取出，加入0.05?0.2% (W/V)的NaN3, 3?5°C儲存?zhèn)溆?；?yōu)選的，用PH7.4抗體透析液透析所得抗體，4°C透析3天，每天換3次透析；透析后取出，加入0.1% (W/V)的NaN3;4°C儲存?zhèn)溆茫凰隹贵w透析液為磷酸鹽緩沖液。
[0041]優(yōu)選的，步驟4)中，所述化學(xué)放光底物是將魯米諾鈉、增強(qiáng)劑吩噻嗪-10-基-丙基磺酸鈉鹽和4-嗎啉吡啶溶入Tris-HCl，在進(jìn)行檢測發(fā)光強(qiáng)度值之前，取出一部分和H2O2對應(yīng)比例混合，即可用于實驗；發(fā)光底物的儲存溫度為4°C。
[0042]如上所述的分析方法，其靈敏度(IC5tl)和檢測限(IC15)分別為:諾龍IC5tl =0.050 μ g/L，IC15= 0.00378 μ g/L、群勃龍 IC 50= 0.094 μ g/L，IC 15= 0.00330 μ g/L、丙酸諾龍 IC50= 0.66 μ g/L, IC 15= 0.259 μ g/L、雄諾龍 IC 50= 1.40 μ g/L, IC 15= 0.0398 μ g/L、美雄諾龍 IC50= 2.40 μ g/L, IC 15= 0.078 μ g/L。
[0043]本發(fā)明對化學(xué)發(fā)光免疫方法測定進(jìn)行了技術(shù)改進(jìn)，其測定包括:諾龍抗體純化；標(biāo)準(zhǔn)抗體包被量；進(jìn)行化學(xué)發(fā)光免疫反應(yīng)；用熒光化學(xué)發(fā)光分析儀對一定波長的波的吸收參數(shù)；作出蛋白同化激素標(biāo)準(zhǔn)品與熒光化學(xué)發(fā)光分析儀檢查參數(shù)圖；將樣品的熒光化學(xué)發(fā)光分析儀檢測參數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)品的熒光化學(xué)發(fā)光分析儀檢測參數(shù)圖比較而獲得樣品中諾龍、群勃龍、丙酸諾龍、雄諾龍、美雄諾龍的總量。
[0044]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所述的一種用于蛋白同化激素免疫分析的酶標(biāo)抗原及分析方法，具有以下優(yōu)勢:
[0045](I)本發(fā)明所述的分析方法針對多種蛋白同化激素藥物具有良好的特異性和廣譜性，與傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附分析方法相比，靈敏度提高了 5?8倍。
[0046](2)本發(fā)明所述的人工半抗原合成方法不僅簡便，且所用主要原料丁二酸酐價格較為低廉、容易獲得，在一般化學(xué)試劑公司都可