小鼠腦組織蛋白質(zhì)組分析的樣品制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白組學(xué)研宄領(lǐng)域，尤其涉及小鼠腦組織蛋白質(zhì)組分析的樣品制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生命科學(xué)研宄已經(jīng)進(jìn)入生命整體水平研宄的組學(xué)時(shí)代，隨著基因組學(xué)研宄的展開，研宄者發(fā)現(xiàn)，基因作為遺傳信息的載體只能決定生命體的基本形式，現(xiàn)在獲得的基因組知識(shí)還不能告訴我們基因在生命體中的作用和如何發(fā)揮作用，而基因表達(dá)的產(chǎn)物蛋白質(zhì)是生命功能的真正執(zhí)行體，因此要想深入了解基因及功能還需要從蛋白質(zhì)水平進(jìn)行詮釋和解讀。但基因和蛋白質(zhì)表達(dá)量并不存在嚴(yán)格的線性關(guān)系，蛋白質(zhì)的表達(dá)具有時(shí)間和空間的特殊性，其復(fù)雜程度和數(shù)量遠(yuǎn)高于基因。生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)的復(fù)雜性大大增加了蛋白質(zhì)樣品制備的難度，因此，蛋白組學(xué)研宄中以蛋白樣品制備最為關(guān)鍵，決定著蛋白質(zhì)組學(xué)研宄的成敗和結(jié)果的好壞。
[0003]小鼠是使用量最大、研宄最詳盡的哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，廣泛用于藥物毒性、藥物篩選和放射生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，因此，發(fā)現(xiàn)小鼠腦組織蛋白質(zhì)組表達(dá)的差異變化是研宄藥物和放射生物學(xué)效應(yīng)的分子機(jī)制的重要途徑，可為人類腦組織病變的藥物篩選、藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)、治療和輻射防護(hù)提供研宄基礎(chǔ)。
[0004]目前，小鼠采用勁椎脫臼的方法處死并分離腦組織，然后用生理鹽水清洗腦組織以去除血液對(duì)腦組織的污染。之后將腦組織與含有高濃度尿素的蛋白裂解液直接混合后進(jìn)行勾楽，離心后上清即為蛋白質(zhì)組樣品【Yi jian Zhanga, Y1-HsuanPanajQiuyuan Yinajet.al.Critical roles of mitochondria in brain activitiesof torpid Myotis ricketti bats revealed by a proteomic approach.Journal ofProteomicsj 2014,105(13):266-284.；Marla Angeles Peinadoaj Raquel HernandezajJuan Peragonbjet.al.Proteomic characterizat1n of nitrated cell targetsafter hypobaric hypoxia and reoxygenat1n in rat brain.Journal of Proteomics, 2014，109(23):309-321.】。但上述文獻(xiàn)公開的方法存在:
⑴無摘取腦組織前去除血液的步驟，樣品有血液污染。
[0005]上述文獻(xiàn)處死小鼠的方法為頸椎脫白法，然后摘取腦組織并用生理鹽水清洗腦組織表面血液，之后進(jìn)行腦組織蛋白質(zhì)組蛋白樣品的制備。這種方法即使經(jīng)過多次生理鹽水清洗，也只能沖洗腦組織表面的血液，并不能徹底去除腦組織內(nèi)部的血液。
[0006]由于血液中的白蛋白和免疫球蛋白也是蛋白，而且表達(dá)豐度非常高，如果不處理干凈血液，就會(huì)嚴(yán)重污染腦組織的蛋白樣品，進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析時(shí)，血液不僅會(huì)影響蛋白樣品的定量、分離，還會(huì)覆蓋腦組織中極為重要的低豐度蛋白。蛋白樣品制備過程中，也可采用去除血液中白蛋白和免疫球蛋白IgG的試劑盒，但試劑盒價(jià)格昂貴，可處理樣品體積小，而且處理過程中會(huì)造成蛋白丟失。
[0007]⑵無對(duì)蛋白樣品加熱增加溶解性的步驟，蛋白提取效率不佳。
[0008]蛋白樣品在100°C的高溫條件下與高濃度SDS緩沖液作用，會(huì)增加蛋白的溶解性。但含有尿素的蛋白裂解液的溫度卻不能超過37°C，否則尿素水解為異氰酸酯，異氰酸酯通過氨基甲酰化(carbamy I at i on )對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，造成人為的“斑點(diǎn)串聯(lián)”，影響蛋白質(zhì)樣品的分離和鑒定。因此按照該方法，無法對(duì)樣品進(jìn)行熱處理增溶。
[0009]⑶無專門去除腦組織中脂類物質(zhì)的步驟，導(dǎo)致脂類影響蛋白分離，蛋白質(zhì)點(diǎn)減少。
[0010]腦組織中含有大量脂類物質(zhì)，如果不去除脂類物質(zhì)，進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析時(shí)，粘稠的脂類物質(zhì)就會(huì)堵塞凝膠孔，阻止蛋白進(jìn)入，造成蛋白質(zhì)點(diǎn)減少，凝膠背景深等不佳效果。
[0011 ] ⑷無去除鹽離子的步驟，影響電泳電壓。
[0012]蛋白質(zhì)組分析，在等電聚焦電泳步驟，電壓最尚可達(dá)ΙΟΟΟΟν，要達(dá)到尚電壓，就要求溶液中鹽離子非常低，否則電壓上不去。較低電壓會(huì)延長等電聚焦時(shí)間，造成等電聚焦失敗或者降低蛋白分離效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種經(jīng)濟(jì)、高效去除小鼠腦組織血液、脂類影響，并增加蛋白樣品溶解性的小鼠腦組織蛋白質(zhì)組分析的樣品制備方法。
[0014]為解決上述問題，本發(fā)明所述的小鼠腦組織蛋白質(zhì)組分析的樣品制備方法，包括以下步驟:
⑴心尖灌流替換血液:取小鼠一只，固定四肢，并按照0.03ml/10g~0.05ml/10g腹腔注射質(zhì)量濃度為10%的水合氯醛；麻醉后剖開胸腔，迅速切開肋骨，剪去隔膜使心臟暴露；然后左心室進(jìn)針入心室，剪破右心耳，開啟蠕動(dòng)泵，用生理鹽水進(jìn)行緩慢心尖灌流，待肝臟呈灰白色時(shí)停止并取出腦組織；
⑵蛋白提取:將所述步驟⑴所得的腦組織放入盛有液氮的研缽中進(jìn)行研磨，直至腦組織被研磨成粉末狀；然后稱取0.2-0.5g腦組織粉末轉(zhuǎn)至1.5mlEP離心管中，按照300μ1:
0.1g的比例向所述EP離心管中加入4°C預(yù)冷的pH=8.l、50mM的Tris緩沖液；其次將所述EP離心管放在冰盒中進(jìn)行超聲處理，之后置于搖床上孵育l~2h，期間渦旋3~5次，最后經(jīng)離心得上清液A，該上清液A即為蛋白提取液I ;
⑶熱處理增加蛋白溶解性:將所述蛋白提取液I按照1:1的體積比與SDS濃度為10%的熱處理液混合后，在100°C處理5min，最后經(jīng)離心得上清液B，該上清液B即為蛋白提取液II ；
⑷沉淀去脂:將所述蛋白提取液II加入到其14倍體積的4°C預(yù)冷的去脂沉淀液CUS中，4°C沉淀90min，期間渦旋3~5次；然后離心得沉淀物，該沉淀物用4°C預(yù)冷的丙酮洗兩次；室溫下經(jīng)15min~30min吹干去除丙酮，即得純化蛋白粉末；
(5)蛋白重溶:將所述純化蛋白粉末按照1:3的質(zhì)量體積比加入到尿素蛋白裂解液中，置35°C溫箱搖晃lh，經(jīng)離心得上清液C，該上清液C經(jīng)蛋白定量后即為蛋白質(zhì)組樣品。
[0015]所述步驟⑵中Tris緩沖液是指10ml緩沖液中含有0.1g的十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.877g 的 NaClUmL 的 Triton X-100，并按照 40μ1/πι1 現(xiàn)加蛋白酶抑制劑(Proteaseinhibitor)。
[0016]所述步驟⑵中超聲處理?xiàng)l件是指功率130W，時(shí)間總計(jì)140s，其中每超聲4s，間歇10s，循環(huán)10次。
[0017]所述步驟⑵、所述步驟⑶和所述步驟(5)中離心條件均是指溫度為4°C，離心力為12000g，時(shí)間為 15min。
[0018]所述步驟⑶中SDS濃度為10%的熱處理液是指100ml pH=8.l、50mM的Tris緩沖液溶液中含有1g十二烷基硫酸鈉(SDS)，并按照0.03g/ml現(xiàn)加二硫蘇糖醇(DTT)。
[0019]所述步驟⑷中離心條件是指溫度為4°C，離心力為8000g，時(shí)間為30min。
[0020]所述步驟⑷中去脂沉淀液QJS是由磷酸三丁醋(tr1-n-butylphosphate):丙酮(Acteon):甲醇(Methanol)按照體積比為I:12:1配制而成。
[0021]所述步驟(5)中尿素蛋白裂解液是指1ml溶液中含有4.2g的尿素(Urea)、1.52g的硫脲(Th1urea)、0.4g的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS);并按照 0.098g/ml 現(xiàn)加二硫蘇糖醇(DTT)，按照 5μ1/ηι1 分別現(xiàn)加 B1-Lyte ρΗ4_6 和 B1-LyteρΗ6_8，按照 40μ1/ηι1 現(xiàn)加蛋白酶抑制劑(Protease inhibitor)。
[0022]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明摘取小鼠腦組織前，經(jīng)過生理鹽水替換血液，徹底去除了腦皮層血管內(nèi)的血液，減少了高豐度白蛋白和免疫球蛋白對(duì)蛋白組樣品的影響，避免了勁椎脫臼法不能有效去除血管中血液中的弊端。
[0023]2、本發(fā)明在蛋白提取中，腦組織放入盛有液氮的研缽中進(jìn)行研磨，細(xì)胞破碎時(shí)會(huì)釋放出蛋白酶造成蛋白被降解，而液氮低溫速凍能有效抑制蛋白酶的活性，確保蛋白質(zhì)保持完整結(jié)構(gòu)。同時(shí)加入的Tris緩沖液使用低濃度SDS有效避免了細(xì)胞裂解過程中大量粘稠性的核酸的影響。
[0024]3、本發(fā)明在熱處理增加蛋白溶解性過程中，采用高濃度的SDS高溫處理蛋白提取液，SDS斷裂了蛋白分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，取消了蛋白的疏水作用，多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，極大地增加了蛋白的溶解性，同時(shí)又避免高溫處理后尿素對(duì)蛋白的修飾。
[0025]4、本發(fā)明去脂液沉淀蛋白不僅能有效去除脂類物質(zhì)，同時(shí)去除了鹽離子、多余SDS和其它影響電泳的雜質(zhì)，保證了蛋白樣品的純度和濃度。相比去除鹽離子和濃縮蛋白的TAC/aceton沉淀法需要12小時(shí)以上，去脂液沉淀只需1.5h，提高了效率，節(jié)省了時(shí)間。
[0026]5、本發(fā)明獲得的蛋白質(zhì)組樣品可用于蛋白質(zhì)組雙向電泳，且可以獲得分