專利名稱：兔抗犬細(xì)小病毒2a型多克隆抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種兔抗犬細(xì)小病毒加型多克隆抗體的制備方法，屬于病毒學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
犬細(xì)小病毒(canine parvovirus, CPV)為細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬貓細(xì)小病毒亞群的成員。從發(fā)現(xiàn)CPV-2至今，已有CPV-加，CPV-2b，CPV-2c (a)和CPV_2C(b)基因型。目前我國(guó)流行的犬細(xì)小病毒為CPV-加和CPV-2b，且以CPV-加占據(jù)主導(dǎo)地位。但是臨床上使用的疫苗還是CPV-2，對(duì)于預(yù)防CPV-加效力不高，這可能是導(dǎo)致犬細(xì)小病毒病免疫失敗的一大原因。但研究發(fā)現(xiàn)CPV-加型疫苗不能誘導(dǎo)犬產(chǎn)生高滴度抗體，不能抵抗CPV-加病毒的侵染。因此制備CPV-加型血清防治國(guó)內(nèi)犬細(xì)小病毒感染有一定意義。目前用犬細(xì)小病毒基因型免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生血清的報(bào)道很少，血清的制造只是通過疫苗或未知基因的毒株免疫犬只，其對(duì)變異株的防治效果不優(yōu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種兔抗犬細(xì)小病毒加型多克隆抗體的制備方法。兔抗犬細(xì)小病毒加型多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟Al，病毒擴(kuò)增F81細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后消化傳代，分于新瓶中3X 106-3X 107個(gè)細(xì)胞， 并按1 10將CPV-加毒株接于F81細(xì)胞上；37°C，5mL/L CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后換培養(yǎng)液，觀察5d，若無CPE，則按常規(guī)細(xì)胞傳代方法傳代，待出現(xiàn)CPE，反復(fù)凍融3次， 收取毒液，于_20°C存放。A2，抗原濃縮通過PEG6000方法將收集的CPV-加毒液進(jìn)行濃縮；步驟為 11000r/min 離心 30min,取上清液 11000r/min 離心 20min,上清液加入 100g/L PEG6000, 22g/L的NaCl，緩慢攪拌均勻，調(diào)PH為7. 4，于4°C沉淀過夜；次日，10000r/min離心40min， 取沉淀用少量PBS混懸，10000r/min離心15min，取上清液過濾，置_20°C保存；A3，抗原蛋白含量測(cè)定將提純的抗原通過核酸蛋白分析儀分析和血凝試驗(yàn)進(jìn)行蛋白含量測(cè)定；A4，免疫接種方法首次免疫，取CPV-加抗原4. 5mL與弗氏完全佐劑1 1乳化， 待形成油包水型后，乳化完全；將復(fù)合佐劑抗原分為三頭份免疫接種3只成年公兔，在腰背處分十點(diǎn)皮下注射；15d后，進(jìn)行二次免疫，取抗原3mL與弗氏不完全佐劑1 1充分乳化， 免疫方法與首免一致；此后，間隔一周免疫，抗原劑量和二免一致，共基礎(chǔ)免疫三次；每次免疫之前，耳緣靜脈采血測(cè)定效價(jià)；若三次免疫后效價(jià)結(jié)果不理想，則進(jìn)行加強(qiáng)免疫，取抗原3. 5mL與佐劑乳化進(jìn)行接種，間隔一周加免；當(dāng)抗體效價(jià)不再上升時(shí)，頸動(dòng)脈放血收集血清，-20°C保存；A5，血清提純向血清中各緩慢加入2-3倍體積0. 06mol/L的NaAc后，緩慢加入75g/L正辛酸攪拌均勻，于4°C靜置lh，10000r/min離心20min，取上清過濾加入IOOmL/ LPBS,緩慢攪拌加入500g/L硫酸銨，4°C靜置過夜。次日lOOOOr/min離心20min，用生理鹽水稀釋沉淀于原血清體積，再次緩慢攪拌加入330g/L硫酸銨，于4°C靜置池后，同上， 離心20min，生理鹽水稀釋沉淀于原血清體積，放于透析袋中透析；透析后8000r/min離心 lOmin，取上清過濾，置于-20°C保存。將CPV-加毒株純化后擴(kuò)增，所獲病毒液用PEG6000濃縮、弗氏佐劑乳化后分十點(diǎn)皮下免疫兔只，共基礎(chǔ)和加強(qiáng)免疫四次。所制多克隆抗體效價(jià)高，HI > 1 10240, SN ^ 1 51200，與CPV-2多抗相比中和CPV_2a的效力更強(qiáng)。


圖1為正常F81細(xì)胞；圖2為CPV分離株感染F81細(xì)胞產(chǎn)生的CPE。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料CPV-加毒株購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，CPV-2弱毒株來自于商業(yè)化疫苗株；F81貓腎細(xì)胞購于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取成年健康新西蘭長(zhǎng)白公兔6只， 體重2-3kg，實(shí)驗(yàn)前飼喂1周，并測(cè)定其血清中CPV抗體為陰性。1.2試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基系hvitrogen公司產(chǎn)品；無支原體胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司；谷氨酰胺購于Takara公司；PEG6000 (聚乙二醇6000)來自成都科龍化工試劑產(chǎn)品；弗氏佐劑Sigma公司產(chǎn)品。隔水式二氧化碳培養(yǎng)箱美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；超凈工作臺(tái)上海博訊實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)；_70°C超低溫冰箱美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；超高速臺(tái)式離心機(jī)美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；液氮罐樂山東亞有限公司生產(chǎn)。1. 3病毒擴(kuò)增F81細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后消化傳代，分于新瓶中3 X 106-3 X IO7個(gè)細(xì)胞，并按1 10同步將CPV-加毒株和CPV-2毒株接于F81細(xì)胞上。37°C，5mL/L CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后換培養(yǎng)液，觀察5d，若無CPE，則按常規(guī)細(xì)胞傳代方法傳代，待出現(xiàn)CPE，反復(fù)凍融3 次，收取毒液，于-20°C存放。1. 4抗原濃縮通過PEG6000方法將收集的CPV-加和CPV-2毒液分別進(jìn)行濃縮。步驟為11000r/ min 離心 30min，取上清液 11000r/min 離心 20min，上清液加入 100g/L PEG6000, 22g/L 的 NaCl，緩慢攪拌均勻，調(diào)PH為7. 4，于4°C沉淀過夜。次日，10000r/min離心40min，取沉淀用少量PBS混懸，10000r/min離心15min，取上清液過濾，置_20°C保存。1.5抗原蛋白含量測(cè)定將提純的抗原通過核酸蛋白分析儀分析和血凝試驗(yàn)(HA)進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。HA方法如下在96V孔血凝板每孔加入50 μ LPBS (ΡΗ7. 2)，取毒株50 μ L加入第1孔混合后， 吸取50 μ L移入第2孔，依次2倍稀釋至第11孔取50 μ L棄之。12孔做紅細(xì)胞對(duì)照。每孔加入50yL的10mL/L豬血細(xì)胞懸液。于4°C作用4h后，觀察結(jié)果。整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作保持環(huán)境溫度為4°C。1. 6免疫接種方法首次免疫，取CPV-加抗原4.5mL與弗氏完全佐劑1 1乳化，待形成油包水型后， 乳化完全。將復(fù)合佐劑抗原分為三頭份免疫接種3只成年公兔，在腰背處分十點(diǎn)皮下注射。 15d后，進(jìn)行二次免疫，取抗原3mL與弗氏不完全佐劑1 1充分乳化，免疫方法與首免一致。此后，間隔一周免疫，抗原劑量和二免一致，共基礎(chǔ)免疫三次。每次免疫之前，耳緣靜脈采血測(cè)定效價(jià)。若三次免疫后效價(jià)結(jié)果不理想，則進(jìn)行加強(qiáng)免疫，取抗原3. 5mL與佐劑乳化進(jìn)行接種，間隔一周加免。當(dāng)抗體效價(jià)不再上升時(shí)，頸動(dòng)脈放血收集血清，-20°C保存。CPV-2濃縮抗原則取3mL與弗氏佐劑1 1乳化，免疫另外3只成年公兔。此后每次免疫劑量不變，免疫方法與上述一致。1. 7血清提純分別向兩種血清中各緩慢加入2-3倍體積0. 06mol/L的NaAc后，緩慢加入75g/L 正辛酸攪拌均勻，于4°C靜置lh，10000r/min離心20min，取上清過濾加入100mL/L PBS，緩慢攪拌加入500g/L硫酸銨，4°C靜置過夜。次日lOOOOr/min離心20min，用生理鹽水稀釋沉淀于原血清體積，再次緩慢攪拌加入330g/L硫酸銨，于4°C靜置池后，同上，離心20min，生理鹽水稀釋沉淀于原血清體積，放于透析袋中透析。透析后8000r/min離心lOmin，取上清過濾，置于-20°C保存。1.8多抗質(zhì)量檢測(cè)效價(jià)檢測(cè)用HI和SN測(cè)定多抗的抗體。血凝抑制實(shí)驗(yàn)(HI)在96V孔血凝板每孔加入25 μ LPBS (ΡΗ7. 2)，向每排的第1孔中加入10倍稀釋的25 μ L多抗，混合后，分別取25 μ L移入第二孔，依次二倍稀釋至第10 孔取25 μ L棄之。每孔加入25 μ L8個(gè)血凝單位的毒液。第11孔做病毒對(duì)照，12孔做空白對(duì)照。在37°C作用Ih后，每孔加入50 μ L 10mL/L豬血細(xì)胞懸液。于4°C作用4h后，觀察結(jié)果。血清中和實(shí)驗(yàn)(SN)在96孔細(xì)胞板上加入用DMEM10倍稀釋的多克隆抗體 (CPV-2，CPV-h)，然后往下依次二倍稀釋。每孔加入50 μ 1毒液，37°C孵育Ih后，向每孔加 Λ IOOyL生長(zhǎng)液，其中含有2 X 104-3 X IO4個(gè)F81細(xì)胞，置于37°C，50mL/LC02培養(yǎng)箱內(nèi)，第 3d開始觀察病變，5d后取出_20/37°C反復(fù)凍融三次，用HA實(shí)驗(yàn)測(cè)定。用Reed-Muench法計(jì)算出抗體值。無菌檢測(cè)按照常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)進(jìn)行檢查。安全性檢測(cè)連續(xù)兩天分別按照lmL/kg，2mL/kg，4mL/kg對(duì)實(shí)驗(yàn)犬靜脈推注多抗， 推注后30min，lh, 2h，12h，24h,然后每天觀察，連續(xù)一周分別測(cè)定其體溫，觀察其吃食、皮毛、精神狀態(tài)以及有無全身或局部過敏反應(yīng)等。1. 9CPV_^i 與 CPV-2 多抗比較運(yùn)用HI和SN實(shí)驗(yàn)對(duì)兩者比較，將多克隆抗體分別用CPV-2毒株和CPV-加毒株進(jìn)行測(cè)定，觀察效價(jià)是否有差異，對(duì)同基因型病毒的中和率是否更高。
1. 10數(shù)據(jù)分析兩者比較之前先將每只兔作為獨(dú)立變量用SPSS軟件一般線型模式進(jìn)行分析，旨在避免兩者對(duì)病毒中和作用的差異與免疫動(dòng)物個(gè)體有關(guān)。毒株CPV-2，CPV-加交叉檢測(cè)CPV-2多抗和CPV-加多抗的SN結(jié)果先用HA反測(cè)定分析，再將所有數(shù)據(jù)底數(shù)2倍化處理后進(jìn)行一般線性模型分析，這樣可以使頻數(shù)分布等值化。2、結(jié)果2. 1病毒在F81上產(chǎn)生的病變F81貓腎細(xì)胞為上皮細(xì)胞，貼附于瓶面生長(zhǎng)(圖1)。當(dāng)病毒感染后，出現(xiàn)病變，則細(xì)胞形態(tài)變細(xì)長(zhǎng)，甚至破碎，成為拉網(wǎng)狀(圖2)。2. 2提純抗原檢測(cè)結(jié)果CPV-加和CPV-2毒株的濃縮抗原通過核酸蛋白分析儀檢測(cè)其蛋白含量分別為
0.27mg/mL和1. 30mg/mL,其血凝效價(jià)分別為217和212。根據(jù)得出的病毒含量和毒株強(qiáng)弱， CPV-加決定首次免疫1.5mL，蛋白含量為400 μ g，CPV-2毒株每只免疫lmL，蛋白含量為
1.30mgo2. 3多抗檢測(cè)結(jié)果將純化多抗稀釋10倍進(jìn)行HI和SN試驗(yàn)，檢測(cè)抗體效價(jià)。CPV-加多抗HI效價(jià)為 21CI，SN效價(jià)為1 5120 ;CPV-2多抗HI效價(jià)為28，SN效價(jià)為1 1024。CPV-加多抗抗體滴度高于CPV-2多抗。無菌及安全性檢測(cè)無菌檢測(cè)未見細(xì)菌生長(zhǎng)。靜脈推注后，犬只無異常。按時(shí)觀察犬只癥狀，連續(xù)一周未見異常。2. 4數(shù)據(jù)分析比較結(jié)果兔作為獨(dú)立變量分析結(jié)果P > 0. 05，差異不顯著抗體效價(jià)高低與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體無關(guān)。兩者多抗比較結(jié)果從表中可以看出，CPV-加多抗與CPV-2多抗中和CPV-加病毒， P值分別為0.003和0.001，差異極顯著(P <0.01)，同基因型之間中和更高。而CPV-加多抗與CPV-2多抗對(duì)CPV-2病毒的中和比較差異不顯著(P > 0. 05)，兩者對(duì)CPV-2病毒的中和作用沒有明顯差異(表1)。表1檢測(cè)不同基因型毒株的多抗抗體滴度結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一種兔抗犬細(xì)小病毒加型多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟Al，病毒擴(kuò)增F81細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后消化傳代，分于新瓶中3X 106-3X 107個(gè)細(xì)胞，并按 1 10將CPV-加毒株接于F81細(xì)胞上；37°C，5mL/L CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后換培養(yǎng)液，觀察5d，若無CPE，則按常規(guī)細(xì)胞傳代方法傳代，待出現(xiàn)CPE，反復(fù)凍融3次，收取毒液，于_20°C存放。A2，抗原濃縮通過PEG6000方法將收集的CPV-加毒液進(jìn)行濃縮；步驟為11000r/min 離心 30min，取上清液 11000r/min 離心 20min，上清液加入 100g/L PEG6000，22g/L 的 NaCl， 緩慢攪拌均勻，調(diào)PH為7. 4，于4°C沉淀過夜；次日，10000r/min離心40min，取沉淀用少量 PBS混懸，10000r/min離心15min，取上清液過濾，置_20°C保存；A3，抗原蛋白含量測(cè)定將提純的抗原通過核酸蛋白分析儀和血凝試驗(yàn)進(jìn)行蛋白含量測(cè)定；A4，免疫接種方法首次免疫，取CPV-加抗原4.5mL與弗氏完全佐劑1 1乳化，待形成油包水型后，乳化完全；將復(fù)合佐劑抗原分為三頭份免疫接種3只成年公兔，在腰背處分十點(diǎn)皮下注射；15d后，進(jìn)行二次免疫，取抗原3mL與弗氏不完全佐劑1 1充分乳化， 免疫方法與首免一致；此后，間隔一周免疫，抗原劑量和二免一致，共基礎(chǔ)免疫三次；每次免疫之前，耳緣靜脈采血測(cè)定效價(jià)；若三次免疫后效價(jià)結(jié)果不理想，則進(jìn)行加強(qiáng)免疫，取抗原3. 5mL與佐劑乳化進(jìn)行接種，間隔一周加免；當(dāng)抗體效價(jià)不再上升時(shí)，頸動(dòng)脈放血收集血清，-20°C保存；A5，血清提純向血清中緩慢加入2-3倍體積0. 06mol/L的NaAc后，緩慢加入75g/L正辛酸攪拌均勻，于4°C靜置lh，10000r/min離心20min，取上清過濾加入100mL/L PBS，緩慢攪拌加入500g/L硫酸銨，4°C靜置過夜。次日lOOOOr/min離心20min，用生理鹽水稀釋沉淀于原血清體積，再次緩慢攪拌加入330g/L硫酸銨，于4°C靜置池后，同上，離心20min，生理鹽水稀釋沉淀于原血清體積，放于透析袋中透析；透析后SOOOr/min離心lOmin，取上清過濾，置于_20°C保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了兔抗犬細(xì)小病毒2a型多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟A1，病毒擴(kuò)增；A2，抗原濃縮；A3，抗原含量測(cè)定；A4，免疫接種方法；A5，血清提純；將CPV-2a毒株純化后擴(kuò)增，所獲病毒液用PEG6000濃縮、弗氏佐劑乳化后分十點(diǎn)皮下免疫兔只，共基礎(chǔ)和加強(qiáng)免疫四次。所制多克隆抗體效價(jià)高，HI≥1∶10240，SN≥1∶51200，與CPV-2多抗相比中和CPV-2a的效力更強(qiáng)。
文檔編號(hào)C07K16/06GK102532308SQ20111044267
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者彭廣能, 李思琪, 梁璐琪, 石錦江, 符華林, 舒龍, 鐘志軍, 馬曉平 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)