專利名稱：一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗體的制備方法，特別涉及一種水體和土壤沉積物中環(huán)境激素多氯聯(lián)苯的免疫檢測的抗體的制備方法
背景技術：
多氯聯(lián)苯(PCBs)作為一種具有持久性危害的痕量有機污染物，得到了世界性的廣泛關注。據(jù)估計，全世界已生產和應用的多氯聯(lián)苯近100萬t，其在各類環(huán)境中的累積量估計達25萬-30萬t。PCBs具有較低的水溶解性和高的辛醇-水體系分配系數(shù)，因此很容易就進入生態(tài)循環(huán)，通過食物鏈的被富集，對人類產生毒害作用。同時由于其化學降解過程和生物降解過程相當緩慢，使得此類物質對環(huán)境造成長期的污染，以致多次出現(xiàn)二次污染。多氯聯(lián)苯(PCBs)作為一種受到世界各國環(huán)境工作者廣泛關注的環(huán)境激素類污染物，其檢測方法的研究成為一個研究熱點。當前，以酶聯(lián)免疫法(ELISA)為代表的免疫檢測方法作為一種快速，特異性強、靈敏度高、簡便、快速等優(yōu)點，近年來備受人們的關注。國外的研究機構已經(jīng)成功的合成出了多種多氯聯(lián)苯類污染物的多克隆和單克隆抗體。并應用于多種多氯聯(lián)苯類污染物的免疫檢測方法中。美國國家環(huán)保局(EPA)也已經(jīng)在2003年就把此類方法作為標準方法公布出來，應用于土壤沉積物中多氯聯(lián)苯的檢測。當前市場上已經(jīng)有多氯聯(lián)苯免疫檢測試劑盒的產品。但是經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，當前市場上銷售的多氯聯(lián)苯試劑盒，以及文獻報道的多氯聯(lián)苯的多克隆抗體或者單克隆抗體，其制備方法具有很大的差異性。這是由于多氯聯(lián)苯在理論上有209種同系物，氯原子的個數(shù)和位置的不同，使得其在環(huán)境中的毒性，降解以及生理活性都有很大不同，因此，目前對于多氯聯(lián)苯的免疫檢測研究所用的抗體，根據(jù)各個研究機關的研究目的不同，其制備抗體所需要的多氯聯(lián)苯單體免疫原有很大的不同，從而使制備出的抗體對環(huán)境中的多氯聯(lián)苯的免疫特異性也有很大的差別。Jane C. Chuang采用6_[ (2，2’，4'，5'-四氯-4-苯基)-己酸做半抗原制備免疫原得到了一種多克隆抗體，用4-(2，4，5-三氯苯氧基)-丁酸與牛血清蛋白的偶聯(lián)物做包被原，用來測定環(huán)境中的多氯聯(lián)苯總量。這個方法也是美國EPA標準的方法。Tomoaki Tsutsumi采用做免疫原,得到了一種可以測定環(huán)境中具有共平面結構多氯聯(lián)苯單體的單克隆抗體，測定了魚肉中的PCB118. ThomasR. Glass等用3，3’，4’-三氯聯(lián)苯-4-苯基己酸，3，3’，4’，5’-四氯聯(lián)苯-4-苯基己酸，3，3’，4’, 5, 5’-氯聯(lián)苯-4-苯基己酸等三種多氯聯(lián)苯單體的半抗原衍生物,制備了三種測定公平面多氯聯(lián)苯PCB77，126，169的單克隆抗體。這個制備技術已獲得日本的發(fā)明專利。其他的像Milan Frdnek采用PCB77，126的半抗原衍生物制備出抗共平面多氯聯(lián)苯單體PCB77，126，169的多克隆抗體，Ya-Wen Chiu等采用PCB35，52，77，126等單體的半抗原衍生物制備出的免疫原，然后制備出相應的單克隆抗體，用來建立ELISA法測定環(huán)境樣品中的共平面多氯聯(lián)苯。綜合這些研究發(fā)現(xiàn)，當前制備出的多氯聯(lián)苯抗體，不論是多克隆還是單克隆抗體，均是采用一種多氯聯(lián)苯單體的半抗原衍生物制成相應的免疫原，對動物進行免疫得到的。由于使用的免疫原的不同，得到的抗體的特異性也有很大差別。
在對環(huán)境中多氯聯(lián)苯的檢測研究中，對樣品中多氯聯(lián)苯類污染物的總量測定和單個有代表性的毒性較強的單體的檢測具有同樣重要的意義。而由于不同抗原得到的抗體對相應免疫原特異性的差別，建立了不同的免疫檢測方法。在對多氯聯(lián)苯總量測定的研究過程中，對抗體的需求特點是其對多氯聯(lián)苯同系物的親和性越高越好，這樣測定的數(shù)據(jù)才會更準確的反應環(huán)境中多氯聯(lián)苯的污染狀況。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術存在的缺陷而提供一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，提高抗體對多氯聯(lián)苯單體的親和性，為滿足多氯聯(lián)苯類污染物的免疫檢測技術發(fā)展的需要提供技術支持。本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現(xiàn) 一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，該方法首先通過半抗原合成免疫原，然后采用動物免疫方法制備得到抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體。所述的通過半抗原合成免疫原具體包括以下步驟(I)稱取半抗原置于潔凈干燥的小錐形瓶中，加入DMF使其溶解，控制半抗原的濃度為 O. lmmol/ΙΟΟμ L DMF ；(2)按重量比為64-65 38-39稱取DCC與NHS，并將其溶于DMF中，DCC的濃度為64-65mg/200-300 μ L DMF，在磁力攪拌下將制備得到的混合溶液逐滴加到小錐形瓶中，混合溶液與步驟(I)制備得到的半抗原溶液的體積比為2-3 4，室溫攪拌反應8h，4°C過夜；(3)將步驟(2)制備得到的產物置于低溫高速離心機9000r/min,經(jīng)15min分離出
上清液；(4)稱取160mg BSA溶于濃度為O. 02mol/L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中，BSA在磷酸鹽緩沖溶液中的濃度為160mg/10mL，然后逐滴加入上清液，上清液加入量為磷酸鹽緩沖溶液的6V/V%，再于冰浴條件下反應4h ；(5)反應結束后，將得到的溶液裝入透析袋，自來水沖洗48h，0. 9%生理鹽水透析3d，離心分出上清液，即得PCB-BSA，經(jīng)紫外可見分光光度計掃描鑒定后，分裝于5mL離心管中冷凍保存。所述的半抗原為二氯聯(lián)苯半抗原、三氯聯(lián)苯半抗原及四氯聯(lián)苯半抗原，分子式分
權利要求
1.一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，該方法首先通過半抗原合成免疫原，然后采用動物免疫方法制備得到抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的通過半抗原合成免疫原具體包括以下步驟 (1)稱取半抗原置于潔凈干燥的小錐形瓶中，加入DMF使其溶解，控制半抗原的濃度為O.Immol/100 μ LDMF ； (2)按重量比為64-65 38-39稱取DCC與NHS，并將其溶于DMF中，DCC的濃度為64-65mg/200-300 μ LDMF，在磁力攪拌下將制備得到的混合溶液逐滴加到小錐形瓶中，混合溶液與步驟(I)制備得到的半抗原溶液的體積比為2-3 4，室溫攪拌反應8h，4°C過夜； (3)將步驟(2)制備得到的產物置于低溫高速離心機9000r/min，經(jīng)15min分離出上清液； (4)稱取160mgBSA溶于濃度為O. 02mol/L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中，BSA在磷酸鹽緩沖溶液中的濃度為160mg/10mL，然后逐滴加入上清液，上清液加入量為磷酸鹽緩沖溶液的6v/v%，再于冰浴條件下反應4h ； (5)反應結束后，將得到的溶液裝入透析袋，自來水沖洗48h，O.9%生理鹽水透析3d，離心分出上清液，即得PCB-BSA，經(jīng)紫外可見分光光度計掃描鑒定后，分裝于5mL離心管中冷凍保存。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的半抗原為二氯聯(lián)苯半抗原、三氯聯(lián)苯半抗原及四氯聯(lián)苯半抗原，分 子式分別為
4.根據(jù)權利要求3所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的動物免疫方法包括以下步驟用已純化的3，4- 二氯聯(lián)苯_BSA、3，4，4’-三氯聯(lián)苯-BSA及3，3’，4，4’_四氯聯(lián)苯-BSA免疫原按照體積比為I : I : I的比例混合后，取完全佐劑充分乳化，然后對哺乳動物或禽類進行首次免疫注射，然后再以不完全佐劑進行追加強化反應，待60-100天后哺育動物血清或禽類蛋黃中即含有抗多氯聯(lián)苯抗體，將血清或蛋黃收集，純化抗體，凍干保存即可。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的首次免疫注射采用等量的完全佐劑充分乳化，所用的免疫原的用量為O. 4-1. Omg/只，優(yōu)選 O. 5-1. Omg/ 只。
6.根據(jù)權利要求4所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的哺乳動物包括家兔、羊、馬、豚鼠、豬或猴，優(yōu)選兔或豚鼠，禽類包括雞、鴨、鵝或鶴鶉，優(yōu)選雞；上述動物為適齡、健壯、無感染的動物，優(yōu)選雄性動物，動物的年齡應是青壯年，兔優(yōu)選月齡3個月，體重2-3kg的成年新西蘭雄性大白兔，雞優(yōu)選蛋雞。
7.根據(jù)權利要求4所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，免疫注射的部位和方式包括靜脈內、腹腔內、肌肉內、皮內、皮下、淋巴結內注射,這些方法可以單獨使用或多種組合使用，優(yōu)選背部皮下多點注射、皮內多點注射、腿部肌肉注射單獨或多種組合使用。
8.根據(jù)權利要求4所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，追加強化反應時，第一次加強選擇首次免疫后2-4周，更優(yōu)選3周，以后的加強選擇2-4周，更優(yōu)選2-3周；所述的加強免疫反應所用的免疫原的用量為首次免疫原用量的O. 5-1. 5倍，優(yōu)選雄且寺里。
9.根據(jù)權利要求8所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，第二次加強免疫后2-3周，測定哺育動物血清或禽類的蛋黃中抗體效價，待效價符合要求后進行哺育動物采血或收集禽類的抗體蛋，純化抗體，凍干保存。
10.根據(jù)權利要求9所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，抗體效價的測定方法包括試管凝集試驗、雙向免疫擴散試驗、放射免疫分析、酶聯(lián)免疫吸附分析或熒光免疫分析，優(yōu)選雙向免疫擴散試驗、酶聯(lián)免疫吸附分析或熒光免疫分析。
11.根據(jù)權利要求4所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，抗體純化時采用硫酸銨鹽析法、辛酸鹽析法、DEAE纖維素離子交換層析法、QAE纖維素離子交換層析法或親和層析法，優(yōu)選硫酸銨鹽析法和DEAE纖維素離子交換層析法結合。
12.根據(jù)權利要求4所述的一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的佐劑包括有機佐劑或無機佐劑，所述的有機佐劑包括胞壁酸二膚、多糖類物質或弗氏佐劑；無機佐劑包括明礬，優(yōu)選弗氏佐劑，弗氏佐劑包括不完全弗氏佐劑和完全弗氏佐劑，不完全弗氏佐劑可用羊毛脂或甘露糖醇單油酸脂作為乳化劑；完全弗氏佐劑可在不完全弗氏佐劑中加入殺死的卡介苗制備而成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗多氯聯(lián)苯多克隆抗體的制備方法，三種多氯聯(lián)苯單體人工全抗原混合而成的全抗原作為免疫原，以哺育動物或禽類動物作為免疫反應器，用純化的三種多氯聯(lián)苯單體全抗原做為免疫原和弗氏完全佐劑充分乳化后，進行初次免疫注射，然后再以不完全佐劑進行追加強化反應，待60-100天后兔等哺育動物血清或雞等禽類蛋黃中即含有抗多氯聯(lián)苯抗體，將血清或蛋黃收集，純化抗體，凍干保存。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明抗體實用性強、穩(wěn)定性好、制備技術簡便可行整個制備過程無需特別的儀器設備，成本低廉，容易工業(yè)化生產。
文檔編號C07K1/113GK102653560SQ20121015356
公開日2012年9月5日 申請日期2012年5月15日 優(yōu)先權日2012年5月15日
發(fā)明者莊惠生, 陳寒玉 申請人:上海交通大學