專利名稱：用于制備金黃色葡萄球菌血清型5和8莢膜多糖綴合物免疫原性組合物的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)血清型5和8莢膜多糖綴合物免疫原性組合物以及它們的制備和使用方法。
背景技術(shù)：
人是革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌的天然儲存宿主。例如，金黃色葡萄球菌 (S. aureus)可以永久或短暫定殖皮膚、鼻孔和咽喉而不引起疾病。金黃色葡萄球菌感染范圍從輕微的皮膚感染至心內(nèi)膜炎、骨髓炎、菌血癥和敗血癥。金黃色葡萄球菌還引起大多數(shù)醫(yī)院感染，并且其在社區(qū)發(fā)病感染中的流行程度增加。此外，在2005年，抗甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染估計為31. 8/100，000個體，包括2005年在美國的16，650例死亡 (Klevens et al. (2007) J. Am. Med. Assoc. 298 :1763-1771)。當(dāng)個體由于免疫屏障的破壞 (例如手術(shù)期間、放置留置導(dǎo)管或其他裝置、創(chuàng)傷或傷口)變?yōu)槊庖呤軗p時，隨后發(fā)生疾病。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生大量細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)抗原，包括許多毒素和酶。本文特別關(guān)注金黃色葡萄球菌的莢膜多糖血清型(參見，Karakawa & Vann, " Capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus," In ffeinstein & Fields,eds. Seminars in Infectious Disease. IV. Bacterial Vaccines. (New York, NY ；Thieme Stratton ； 1982. pp. 285293)，特別是血清型5和8莢膜多糖。對分離自個體的大量金黃色葡萄球菌菌株的流行病學(xué)研究顯示70%-80%是血清型5或8莢膜多糖(Arbeit et al. (1984)Diagn. Microbiol. Infect.Dis. 2 :85-91)。不幸的是，莢膜多糖本身是不良免疫原。在過去20年，由于使用血管內(nèi)裝置和侵入性操作，葡萄球菌感染和疾病急劇增力口。由于抗生素抗性的平行上升，疾病發(fā)生率的這種上升更令人不安；因此，對免疫原性組合物有迫切需要以預(yù)防葡萄球菌感染和疾病。發(fā)明概述本發(fā)明涉及免疫原性綴合物，其包含綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5 或8莢膜多糖，以及制備這類綴合物的方法。金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分離方法直接分離自細(xì)菌，可以利用合成方案制備，或者可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員還已知的基因工程方法重組產(chǎn)生。此外，本發(fā)明提供誘導(dǎo)針對葡萄球菌(Staphylococcus)細(xì)菌的免疫應(yīng)答的方法，預(yù)防葡萄球菌細(xì)菌所引起的疾病的方法，以及降低葡萄球菌細(xì)菌感染所引起的疾病的至少一種癥狀的嚴(yán)重程度的方法。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明包含免疫原性多糖-蛋白綴合物，其包含分離的綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖，其中所述多糖具有20kDa-1000kDa的分子量。在一些實(shí)施方案中，所述免疫原性綴合物具有200kDa-5000kDa的分子量。在一實(shí)施方案中，所述免疫原性綴合物的多糖部分具有70kDa-300kDa的分子量范圍。在一實(shí)施方案中，所述免疫原性綴合物具有500kDa-2500kDa的分子量范圍。在一實(shí)施方案中，所述血清型5或8莢膜多糖具有10-100%的0-乙?；潭取Ｔ谝粚?shí)施方案中，所述0-乙酰化程度為50-100%。在一實(shí)施方案中，所述0-乙?；潭葹?75-100%。在一實(shí)施方案中，所述免疫原性綴合物產(chǎn)生抗體，如通過在動物效力模型中殺死細(xì)菌或通過調(diào)理吞噬殺死測定所測量的，所述抗體是有功能的。在一實(shí)施方案中，所述免疫原性綴合物載體蛋白包含CRM197。在一實(shí)施方案中，所述CRM197通過氨基甲酸酯鍵、酰胺鍵或這兩者共價連接至所述多糖。在一實(shí)施方案中，綴合的賴氨酸比CRM197的摩爾比可以是約10 I-約25 I。在一實(shí)施方案中，所述綴合物在所述多糖的至少每5-10個糖重復(fù)單元包含一個CRM197和多糖之間的共價鍵。在一實(shí)施方案中，載體蛋白和多糖之間的鍵在所述多糖的每5個重復(fù)單元中存在一個。在一實(shí)施方案中，所述包含CRM197的免疫原性綴合物包含共價連接至所述多糖的 5-22個賴氨酸或8-15個賴氨酸。在一實(shí)施方案中，所述包含CRM197的免疫原性綴合物包含共價連接至所述多糖的5-23個賴氨酸或8-12個賴氨酸。在一實(shí)施方案中，所述免疫原性綴合物包含10-100% 0-乙?；?型或8型多糖。在一實(shí)施方案中，所述免疫原性綴合物包含50-100% 0-乙?；?型或8型多糖。在一實(shí)施方案中，所述免疫原性綴合物包含75-100% 0-乙?；?型或8型多糖。在一些實(shí)施方案中，所述免疫原性組合物可以用來產(chǎn)生在動物效力模型或調(diào)理吞噬殺死測定中有功能的抗體。在一實(shí)施方案中，與5型或8型多糖的總量相比，所述免疫原性綴合物包含少于約 30%游離5型或8型多糖。在一實(shí)施方案中，與5型或8型多糖的總量相比，所述免疫原性綴合物包含少于約 20%游離5型或8型多糖。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明包含免疫原性組合物，其包含如本文所述的免疫原性綴合物，以及包含佐劑、稀釋劑或載體中的至少一種。所述佐劑可以是基于鋁的佐劑，例如磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁中的一種或多種。 在一實(shí)施方案中，所述佐劑包含磷酸鋁。
在一實(shí)施方案中，與5型或8型多糖的總量相比，所述免疫原性組合物包含少于約 30%游離5型或8型多糖。在一實(shí)施方案中，與5型或8型多糖的總量相比，所述免疫原性組合物包含少于約 20%游離5型或8型多糖。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在對象中誘導(dǎo)對金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖綴合物的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給所述對象施用免疫學(xué)有效量的如本文所述的免疫原性組合物。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括產(chǎn)生包含分離的綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖的免疫原性多糖-蛋白綴合物的方法，所述方法包括以下步驟使分離的金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖與1，I-羰基-二-(1，2，4-三唑)(OTT)在有機(jī)溶劑中反應(yīng)來產(chǎn)生活化的血清型5或8多糖；以及使活化的血清型5或8多糖與載體蛋白在有機(jī)溶劑中反應(yīng)來產(chǎn)生血清型5或8多糖載體蛋白綴合物。
在一實(shí)施方案中，活化金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖的方法進(jìn)一步包括凍干所述分離的血清型5或8多糖，并且將所述凍干的多糖重懸在有機(jī)溶劑。在一實(shí)施方案中，將所述重懸的多糖活化，然后使其與所述載體蛋白直接反應(yīng)。在一實(shí)施方案中，在與所述載體蛋白反應(yīng)之前分離所述活化的分離的血清型5或8多糖。在一實(shí)施方案中，將所述活化的分離的血清型5或8多糖凍干，以便在使所述多糖與載體蛋白反應(yīng)之前產(chǎn)生凍干的活化的分離的血清型5或8多糖。在一實(shí)施方案中，產(chǎn)生分離的多糖-載體蛋白綴合物的方法包括將所述載體蛋白凍干的步驟，以便在使所述載體蛋白與所述多糖反應(yīng)之前產(chǎn)生凍干的載體蛋白。在一實(shí)施方案中，產(chǎn)生分離的多糖-載體蛋白綴合物的方法包括將凍干的活化的分離的血清型5或8多糖以及凍干的載體蛋白重懸在有機(jī)溶劑中的步驟，作為所述活化的分離的血清型5或8多糖與載體蛋白的反應(yīng)的部分。
在一實(shí)施方案中，產(chǎn)生分離的金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法包括稀釋活化的多糖與載體蛋白的反應(yīng)混合物并在約20°C -約26°C下維持約 8. 8-約9. 2的pH至少4小時的步驟。在一實(shí)施方案中，將所述活化的金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖與載體蛋白的反應(yīng)混合物在約23°C下維持約9. 0的pH至少4小時。在一實(shí)施方案中，產(chǎn)生分離的金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖-載體蛋白的方法包括在產(chǎn)生之后分離所述分離的血清型5或8多糖-蛋白綴合物的步驟。在一實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生分離的金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法的有機(jī)溶劑是極性非質(zhì)子溶劑。在一實(shí)施方案中，所述極性非質(zhì)子溶劑選自二甲基亞砜(DMSO)。在一實(shí)施方案中，產(chǎn)生分離的多糖-載體蛋白綴合物的方法，所述有機(jī)溶劑為DMSO。在一實(shí)施方案中，產(chǎn)生分離的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法包括將有機(jī)溶劑中的包含5型莢膜多糖與CDT的反應(yīng)混合物的水濃度調(diào)整至約 0. 1-0. 3%。在一實(shí)施方案中，將有機(jī)溶劑中的包含5型莢膜多糖與⑶T的反應(yīng)混合物的水濃度調(diào)整至約0.2%。在一實(shí)施方案中，活化分離的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖的步驟包括使所述多糖與CDT反應(yīng)，所述CDT的量約超過存在于有機(jī)溶劑中的包含5型莢膜多糖和CDT的反應(yīng)混合物中的多糖的量20摩爾。在一實(shí)施方案中，產(chǎn)生分離的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖載體蛋白綴合物的方法包括測定包含8型莢膜多糖的反應(yīng)混合物的水濃度的步驟。在一實(shí)施方案中，加入所述反應(yīng)混合物以活化所述多糖的CDT的量以約與存在于有機(jī)溶劑中的包含8型莢膜多糖和 CDT的反應(yīng)混合物中的水的量等摩爾的CDT的量提供。在一實(shí)施方案中，加入所述反應(yīng)混合物以活化所述多糖的CDT的量以約與存在于有機(jī)溶劑中的包含8型莢膜多糖和CDT的反應(yīng)混合物中的水的量相比約0. 5 : I的摩爾比的CDT的量提供。在一實(shí)施方案中，加入所述反應(yīng)混合物以活化所述多糖的CDT的量以約與存在于有機(jī)溶劑中的包含8型莢膜多糖和⑶T的反應(yīng)混合物中的水的量相比0. 75 : I 的摩爾比的CDT的量提供。在一實(shí)施方案中，包括分離所述活化的多糖的步驟的方法包括滲濾的步驟。在一實(shí)施方案中，包括凍干所述載體蛋白的方法，在凍干之前，將所述載體蛋白對NaCl滲濾，并且將NaCl/蛋白載體蛋白的w/w比例調(diào)整至約0. 5_約I. 5。在一實(shí)施方案中， NaCl比載體蛋白的比例約為I。在一實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生分離的金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法的載體蛋白包含crm197。在一實(shí)施方案中，使用于產(chǎn)生分離的金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法的CRM197與所述活化的血清型5或8多糖以約I : I的重量比例反應(yīng)。在一實(shí)施方案中，產(chǎn)生分離的金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法包括在與CDT在有機(jī)溶劑中混合之前將所述5型或8型莢膜多糖與咪唑或三唑混合的步驟。在一實(shí)施方案中，產(chǎn)生分離的金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖載體蛋白綴合物的方法包括水解所述血清型5或8多糖-載體蛋白綴合物以去除未反應(yīng)的活化基團(tuán)的步驟。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生包含分離的綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖的免疫原性綴合物的方法，所述方法包括以下步驟使金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖與3- (2-吡啶二硫代)-丙酰肼(PDPH)和碳二亞胺在有機(jī)溶劑中反應(yīng)以產(chǎn)生I3DPH連接的多糖；使所述I3DPH連接的多糖與還原劑反應(yīng)以產(chǎn)生活化的多糖； 分離所述活化的血清型5或8多糖以產(chǎn)生分離的活化的血清型5或8多糖；提供活化的載體蛋白；使所述分離的活化的血清型5或8多糖與所述活化的載體蛋白反應(yīng)以產(chǎn)生血清型 5或8多糖-載體蛋白綴合物；由此產(chǎn)生包含分離的綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖的免疫原性綴合物。在一實(shí)施方案中，在使所述活化的載體蛋白與所述活化的多糖反應(yīng)之前分離所述活化的載體蛋白。在一實(shí)施方案中，分離所述活化的載體蛋白的步驟進(jìn)一步包括凍干所述分離的活化的血清型5或8多糖以產(chǎn)生凍干的活化的血清型5或8多糖。在一實(shí)施方案中，所述溴乙酸為溴乙酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯(BAANS)。在一實(shí)施方案中，利用I3DPH產(chǎn)生血清型8莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法包括使用有機(jī)溶劑，所述有機(jī)溶劑為極性非質(zhì)子溶劑。在一實(shí)施方案中，所述極性非質(zhì)子溶劑選自二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺、N-甲基_2_吡咯烷酮和六甲基磷酰胺(HMPA)。在一實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑為二甲基亞砜(DMSO)。在一實(shí)施方案中，用于利用I3DPH產(chǎn)生血清型5或8莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法的碳二亞胺是I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDAC)。在一實(shí)施方案中，利用I3DPH產(chǎn)生血清型5或8莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法包括使所述血清型5或8莢膜多糖與TOPH和EDAC在有機(jī)中以約I : 5 : 3的多糖PDPH EDAC重量比例反應(yīng)的步驟。在一實(shí)施方案中，用于利用I3DPH和EDAC產(chǎn)生血清型5或8莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法的還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)。
在一實(shí)施方案中，在利用I3DPH和EDAC產(chǎn)生血清型5或8莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法中活化所述載體蛋白包括使所述載體蛋白與溴乙酸反應(yīng)。在一實(shí)施方案中，利用roPH和EDAC產(chǎn)生血清型5或8莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法中的分離所述活化的血清型5或8多糖的步驟包括滲濾。
在一實(shí)施方案中，利用roPH和EDAC產(chǎn)生血清型5或8莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法包括水解所述血清型5或8多糖-載體蛋白綴合物以去除未反應(yīng)的活化基團(tuán)的步驟。在一實(shí)施方案中，水解所述血清型5或8多糖-載體蛋白綴合物的步驟包括添加半胱胺鹽酸鹽。在一實(shí)施方案中，利用I3DPH和EDAC產(chǎn)生血清型5或8莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法進(jìn)一步包括分離免疫原性綴合物，所述免疫原性綴合物包含分離的綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖。在一實(shí)施方案中，所述血清型5或8多糖-載體蛋白綴合物的分離包括滲濾。在一實(shí)施方案中，用于利用I3DPH和EDAC產(chǎn)生血清型5或8莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法的載體蛋白包括crm197。在一實(shí)施方案中，利用I3DPH和EDAC產(chǎn)生血清型5或8莢膜多糖-CRM197綴合物的方法中的CRM197以約I : ICRM197 :莢膜多糖分子的重量比例添加。 在一實(shí)施方案中，用于利用roPH和EDAC產(chǎn)生血清型5或8莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法的活化的5型或8型莢膜多糖具有約50kd-約500kd的大小。在一實(shí)施方案中，在利用roPH和EDAC產(chǎn)生血清型5或8莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法中制備的免疫原性綴合物具有約400kd-約5000kd的大小。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供免疫原性組合物，其包含通過本文所述的任何方法產(chǎn)生的5型或8型莢膜多糖-載體蛋白綴合物。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供免疫原性組合物，其包含通過本文所述的任何方法產(chǎn)生的5型或8型莢膜多糖-載體蛋白綴合物以及包含佐劑、稀釋劑或載體中的至少一種。 在一實(shí)施方案中，所述免疫原性組合物包含基于鋁的佐劑，其可以選自磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁。在一實(shí)施方案中，本文所述的免疫原性組合物包含佐劑磷酸鋁。本文所述的免疫原性組合物與5型或8型多糖的總量相比可以包含少于30%以及少于20%的游離5型或8型多糖?？梢詫⒈疚乃龅拿庖咴越M合物儲存在水或低離子強(qiáng)度的中性pH緩沖液中。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供減少或預(yù)防對象中的葡萄球菌感染、與葡萄球菌細(xì)菌相關(guān)的疾病或疾病狀況的方法，所述方法包括向所述對象施用治療或預(yù)防量的如本文所述的免疫原性組合物的步驟。在一實(shí)施方案中，所述感染、疾病或疾病狀況選自侵襲性金黃色葡萄球菌、敗血癥和攜帶。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供減少或預(yù)防接受外科手術(shù)的對象中的葡萄球菌感染的方法，所述方法包括在所述外科手術(shù)之前向所述對象施用預(yù)防有效量的如本文所述的免疫原性組合物的步驟。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括用⑶T取代⑶I。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有50kDa_800kDa的分子量的金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖，其共價結(jié)合至載體蛋白；其中共價結(jié)合至所述載體蛋白的多糖的組合分子量為約 400kDa-5000kDa。在一實(shí)施方案中，共價結(jié)合至載體蛋白的多糖包含具有70kDa_300kDa的分子量范圍的多糖部分。在一實(shí)施方案中，共價結(jié)合至載體蛋白的多糖具有500kDa-2500kDa的分
子量范圍。
在一實(shí)施方案中，共價結(jié)合至載體蛋白的多糖的載體蛋白部分包含CRM197。在一實(shí)施方案中，將所述CRM197通過氨基甲酸酯鍵、酰胺鍵或這兩者共價連接至所述多糖。在一些實(shí)施方案中，綴合的賴氨酸比CRM197的摩爾比為約10 I-約25 I。在一些實(shí)施方案中，共價結(jié)合至載體蛋白的多糖至少在所述多糖的每5-10個糖重復(fù)單元包含至少一個與 CRM197之間的共價鍵。在一些實(shí)施方案中，共價結(jié)合至載體蛋白的多糖包含存在于所述多糖的每5個糖重復(fù)單元的至少一個CRM197和多糖之間的鍵。在一些實(shí)施方案中，共價結(jié)合至所述CRM197的多糖的CRM197部分包含5-22個共價連接至所述多糖的賴氨酸。在一些實(shí)施方案中，共價結(jié)合至所述CRM197的多糖的CRM197部分包含5-23個共價連接至所述多糖的賴氨酸。在一些實(shí)施方案中，共價結(jié)合至載體蛋白的多糖的CRM197部分包含8-15個共價連接至所述多糖的賴氨酸。在一些實(shí)施方案中，共價結(jié)合至載體蛋白的多糖的CRM197部分包含 8-12個共價連接至所述多糖的賴氨酸。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供免疫原性組合物，其包含如本文所述共價結(jié)合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌5型或8型多糖以及包含佐劑、稀釋劑或載體中的至少一種。 在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供向?qū)ο笫┯冒绫疚乃龉矁r連接至載體蛋白的金黃色葡萄球菌5型或8型多糖的免疫原性組合物以產(chǎn)生如本文所述的免疫應(yīng)答的方法。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離具有20kDa_1000kDa的分子量的多糖的方法。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過本發(fā)明的莢膜多糖、免疫原性綴合物或免疫原性組合物產(chǎn)生的抗體。


基于以下發(fā)明詳述，會更好地理解本發(fā)明除了上文所列之外的特征、方面和優(yōu)勢。 這樣的發(fā)明詳述參考以下附圖，其中圖I示出金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖的重復(fù)多糖結(jié)構(gòu)(N-乙酰氨基甘露醇醛酸為ManNAca，N-乙酰L-巖藻糖胺為L-FucNAc，并且N-乙酰D-巖藻糖胺為D-FucNAc)。圖2A示出來自金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖(0-乙?；鶞y定)和磷壁酸(磷酸鹽測定)的離子交換層析(Q-瓊脂糖)級分的分析；圖2B示出通過雙向免疫擴(kuò)散測定的來自金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖的離子交換層析(Q-瓊脂糖)級分的分析。圖3A示出在加熱處理中，pH(3. 5、4或5)在95°C下對于降低金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖分子量的效果；圖38示出在加熱處理中，溫度(55°C、75°C或95°C)在pH 3.5 下對于降低金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖分子量的效果。圖4示出分別在pH 3. 5和4.5下于95°C下加熱處理期間，隨著時間的推移與血清型5莢膜多糖相比的純化的金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖的分子量。圖5示出與AlPO4處理的對照(圓形)相比，在接受血清型8莢膜多糖-CRM197綴合物的小鼠(菱形)中存活率提高。圖6示出金黃色葡萄球菌血清型5多糖的重復(fù)多糖結(jié)構(gòu)(N-乙酰氨基甘露醇醛酸為ManNAcA，N-乙酰L-巖藻糖胺為L-FucNAc，并且N-乙酰D-巖藻糖胺為D-FucNAcA)。圖7A示出來自金黃色葡萄球菌血清型5多糖(0-乙?；鶞y定)和磷壁酸(磷酸鹽測定)的離子交換層析(Q-瓊脂糖)級分的分析；圖7B示出通過雙向免疫擴(kuò)散測定的來自金黃色葡萄球菌血清型5多糖的離子交換層析(Q-瓊脂糖)級分的分析。
圖8A示出在加入處理中，pH(3. 5、4或5)在95°C下對于降低金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多糖分子量的效果；圖88示出在加熱處理中，溫度(55°C、75°C或95°C)在pH 3.5 下對于降低金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多糖分子量的效果。圖9示出與PBS處理的對照(陰影區(qū)為處理的小鼠)相比，在接受血清型5多糖-CRM197綴合物的小鼠中腎盂腎炎減少。圖10示出在用高分子量(HMW)CP5-CRM、低 分子量(LMW)CP5-CRM或PP5-CRM對照免疫接種的小鼠中用金黃色葡萄球菌PFESA0266攻擊之后，腎中回收的菌落形成單位 (CFU)o圖11示出來自血清的OPA效價(幾何平均數(shù))的比較，所述血清獲得自用多糖綴合物的不同制劑(高分子量(HMW)CP5-CRM、低分子量(LMW)CP5-CRM)免疫接種的小鼠。組由5-9只小鼠組成。發(fā)明詳述綜述本發(fā)明涉及包含綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖的免疫原性綴合物以及它們的制備和使用方法。本發(fā)明的免疫原性綴合物的新特征包括所述多糖和所得的綴合物的分子量譜，每個CRM197載體蛋白綴合的賴氨酸的比例和共價連接至所述多糖的賴氨酸的數(shù)目，作為所述多糖的重復(fù)單元的函數(shù)的所述載體蛋白與所述多糖之間的共價鍵的數(shù)目，以及與總多糖相比的游離多糖的相對量。在本文中使用時，術(shù)語“游離多糖” 表示未綴合至所述載體蛋白但是仍然存在于所述綴合物組合物中的多糖。制備本發(fā)明的免疫原性綴合物的方法包括利用包括⑶I (I, I-羰基二咪唑)、 ⑶T (I, I-羰基-二 -I，2，4-三唑)或TOPH(3-(2-吡啶二硫代)-丙酰肼)的綴合化學(xué)使所述莢膜多糖與所述載體蛋白共價綴合。CDI僅對CP8綴合具有特異性。使用CDI/CDT導(dǎo)致莢膜多糖和載體蛋白之間的I-碳或0-碳接頭，而使用I3DPH導(dǎo)致莢膜多糖和載體蛋白之間的共價硫醚鍵。用于_SH(硫醇化CP)至-NH2鍵的其他交聯(lián)劑包括但不限于磺基-LC-SMPT ;磺基-LC-SMPT(4-磺基琥珀酰亞胺基-6-甲基-a-(2-吡啶二硫代)甲苯甲酰氨基]己酸酯))；磺基-KMUS(N-[k-馬來酰亞胺基i^一?；趸鵠磺基琥珀酰亞胺酯)；切割巰基的磺基-LC-STOP(磺基琥珀酰亞胺基6-(3' -[2-吡啶二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)；磺基-SMPB (磺基琥珀酰亞胺基4-[對-馬來酰亞胺基苯基]丁酸酯)；磺基-SIAB (N-磺基琥珀酰亞胺基[4-碘乙?；鵠氨基苯甲酸酯)；磺基-EMCS([N-e-馬來酰亞胺基己酰基氧基]磺基琥珀酰亞胺酯)；EMCA(N-e-馬來酰亞胺基己酸)；磺基-SMCC (磺基琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-I-羧酸酯)；磺基_MBS(間-馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯)；磺基-GMBS(N-[g-馬來酰亞胺基丁酰氧基]磺基琥珀酰亞胺酯)；BMPA(N-0 -馬來酰亞胺基丙酸)；2_亞氨基硫燒鹽酸鹽(2-immunothiolane hydrochloride) ;3_ (2-卩比唳二硫代)丙酸N-琥拍酰亞胺基酯；3-馬來酰亞胺基 (malemido)丙酸N-琥珀酰亞胺基酯；4_馬來酰亞胺基丁酸N-琥珀酰亞胺基酯；SMPT(4_琥珀酰亞胺基氧基羰基-甲基-a-[2-吡啶二硫代]甲苯)；LC-SMCC(琥珀酰亞胺基-4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-I-羧基-[6-酰氨基己酸酯]);KMUA(N-k-馬來酰亞胺基i^一酸)山(-3^^(琥珀酰亞胺基6-(3-[2-吡啶二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)；SMPH(琥珀酰亞胺基-6_
己酸酯)；SMPB(琥珀酰亞胺基4-[對-馬來酰亞胺基苯基]丁酸酯)；SIAB(N-琥珀酰亞胺基[4-碘乙?；鵠氨基苯甲酸酯)；EMCS([N-e-馬來酰亞胺基己?；趸鵠琥珀酰亞胺酯)；SMCC(琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺基甲基] 環(huán)己烷-I-羧酸酯)；MBS(間-馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯)；SBAP(琥珀酰亞胺基3-[溴乙酰氨基]丙酸酯)；BMPS (N-[ P -馬來酰亞胺基丙基氧基]琥珀酰亞胺酯)；AMAS N-(a-馬來酰亞胺基乙酰氧基)琥珀酰亞胺酯)；SIA(N_琥珀酰亞胺基碘乙酸酯)；以及N-琥珀酰亞胺基(4-碘乙?；?-氨基苯甲酸酯。
還可以利用-SH至-OH基團(tuán)的交聯(lián)劑將所述物質(zhì)交聯(lián)。這類交聯(lián)劑包括但不限于 PMPI (N-[對-馬來酰亞胺基苯基]異氰酸酯)。本文所述的組合物和方法在各種應(yīng)用中有用。例如，所述綴合物可以用于產(chǎn)生綴合物免疫原性組合物以保護(hù)受體免受金黃色葡萄球菌感染?；蛘撸龈鞣N綴合物可以用于產(chǎn)生針對細(xì)菌莢膜多糖的抗體，隨后所述抗體可以用于研究和臨床實(shí)驗(yàn)室測定，例如細(xì)菌檢測和血清分型。這類抗體還可以用來賦予對象被動免疫。在一些實(shí)施方案中，所制備的針對細(xì)菌多糖的抗體在動物效力模型或調(diào)理吞噬殺死測定中有功能。除非另有說明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所涉及的領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。雖然與本文所述的方法和材料相似或相當(dāng)?shù)娜魏畏椒ê筒牧峡梢杂糜诒景l(fā)明的實(shí)施或測試，但是本文描述優(yōu)選方法和材料。在描述實(shí)施方案和要求本發(fā)明中，某些術(shù)語會按照下文所示的定義使用。在本文中使用時，除非上下文明確另有規(guī)定，單數(shù)形式“一個(a)”、“一個(an)”和 “這個”包括復(fù)數(shù)參考物。因此，例如，提及“這個方法”包括本文所述類型的一種或多種方法和/或步驟，和/或在閱讀本公開等時對本領(lǐng)域技術(shù)人員會變得清楚的一種或多種方法和/或步驟。在本文中使用時，“約”表示在值(例如所述濃度范圍、時限、分子量、溫度或pH)的統(tǒng)計上有意義的范圍內(nèi)。這樣的范圍可以在一個數(shù)量級內(nèi)，典型地在給定值或范圍的20% 內(nèi)，更典型地仍在10%內(nèi)，并且甚至更典型地在5%內(nèi)。術(shù)語“約”所涵蓋的允許偏差取決于研究下的特定系統(tǒng)，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易判斷。在本申請內(nèi)無論何時提到范圍，所述范圍內(nèi)的每個整數(shù)也預(yù)期為本發(fā)明的實(shí)施方案。注意到在這個公開中，諸如“包含(comprises) ”、“包含(comprised) ”、“包含 (comprising) ”、“含有(contains) ”、“含有(containing)”等的術(shù)語可以具有符合美國專利法的含義；例如，它們可以表示“包括(includes) ”、“包括(included) ”、“包括 (including) ”等。這類術(shù)語指包括特定成分或成分的組而不排除任何其他成分。諸如 “基本上由...組成(consisting essentially of) ” 和“基本上由 組成(consists essentially of) ”的術(shù)語具有符合美國專利法的含義，例如，它們允許包括不偏離本發(fā)明的新特征或基本特征的額外的成分或步驟，即，它們排除偏離本發(fā)明的新特征或基本特征的額外的未列舉的成分或步驟，并且它們排除現(xiàn)有技術(shù)(例如本文所引用或援引加入本文的文件，特別是該文件的目的是限定實(shí)施方案可授權(quán)，如對于現(xiàn)有技術(shù)如本文所引用的文件或援引加入本文的文件是新的、非顯而易見的、具有創(chuàng)造性的)的成分或步驟。并且，術(shù)語“由...組成(consists of)”和“由...組成(consisting of) ”具有符合美國專利法的含義；即這些術(shù)語是封閉的。因此，這些術(shù)語指包括特定成分或成分的組，并且排除所有其他成分。免疫原性綴合物
如上文所述，本發(fā)明涉及包含綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖的免疫原性綴合物。本發(fā)明的一實(shí)施方案提供包含綴合至載體分子或蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖的免疫原性綴合物，其具有一種或多種以下特征所述多糖具有50kDa-700kDa的分子量；所述免疫原性綴合物具有500kDa_2500KDa的分子量；并且相對于總多糖，所述綴合物包含少于約30%游離多糖。在一些實(shí)施方案中，所述多糖具有 20kDa-1000kDa的分子量。在一些實(shí)施方案中，所述免疫原性綴合物具有200kDa_5000kDa 的分子量。在其他實(shí)施方案中，相對于總多糖，所述綴合物包含少于約25%、約20%、約 15%、約10%或約5%游離多糖。在本文中使用時，“綴合物”包含通常具有期望范圍的分子量的莢膜多糖和載體蛋白，其中所述莢膜多糖綴合至所述載體蛋白。綴合物可以含有或可以不含一定量的游離莢膜多糖。在本文中使用時，“游離莢膜多糖”指與綴合的莢膜多糖-載體蛋白非共價關(guān)聯(lián) (即，非共價結(jié)合、吸附或包埋)的莢膜多糖。術(shù)語“游離莢膜多糖”、“游離多糖”和“游離糖”可以交換使用，并且旨在表達(dá)相同含義。無論所述載體分子的性質(zhì)如何，其可以直接或通過接頭綴合至所述莢膜多糖。在本文中使用時，“待綴合”、“已綴合”和“正在綴合”指將細(xì)菌莢膜多糖共價連接至所述載體分子的過程。綴合增強(qiáng)所述細(xì)菌莢膜多糖的免疫原性。綴合可以根據(jù)下文所述的方法或通過本領(lǐng)域已知的其他方法進(jìn)行。所述金黃色葡萄球菌莢膜多糖的分子量是用于免疫原性組合物的考慮因素。由于在抗原表面存在較高價的表位，高分子量莢膜多糖能夠誘導(dǎo)某些抗體免疫應(yīng)答?！案叻肿恿壳v膜多糖”的分離考慮用于本發(fā)明的組合物和方法。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，可以分離和純化分子量范圍為20kDa-1000kDa的高分子量血清型5或8莢膜多糖。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，可以分離和純化分子量范圍為50kDa-700kDa的高分子量血清型5 或8莢膜多糖。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，可以分離和純化分子量范圍為50kDa-300kDa 的高分子量血清型5或8莢膜多糖。在一實(shí)施方案中，可以分離和純化分子量范圍為 70kDa-300kDa的高分子量血清型5或8莢膜多糖。在一實(shí)施方案中，可以分離和純化分子量范圍為90kDa-250kDa的高分子量血清型5或8莢膜多糖。在一實(shí)施方案中，可以分離和純化分子量范圍為90kDa-150kDa的高分子量血清型5或8莢膜多糖。在一實(shí)施方案中，可以分離和純化分子量范圍為90kDa-120kDa的高分子量血清型5或8莢膜多糖。 在一實(shí)施方案中，可以分離和純化分子量范圍為80kDa-120kDa的高分子量血清型5或8 莢膜多糖?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法分離和純化的其他范圍的高分子量血清型5或8莢膜多糖包括分子量70kDa-100kDa ;分子量70kDa_110kDa ;分子量70kDa_120kDa ;分子量 70kDa-130kDa ;分子量 70kDa_140kDa ;分子量 70kDa_150kDa ;分子量 70kDa_160kDa ;分子量 80kDa-110kDa ;分子量 80kDa_120kDa ;分子量 80kDa_130kDa ;分子量 80kDa_140kDa ;分子量 80kDa-150kDa ;分子量 80kDa_160kDa ;分子量 90kDa_lIOkDa ;分子量 90kDa_120kDa ； 分子量 90kDa-130kDa ;分子量 90kDa_140kDa ;分子量 90kDa_150kDa ;分子量 90kDa-160kDa ;分子量 100kDa_120kDa ;分子量 100kDa_130kDa ;分子量 100kDa_140kDa ;分子量100kDa_150kDa ;分子量100kDa_160kDa ;以及相似的期望的分子量范圍。在任何上述范圍內(nèi)的任何整數(shù)考慮為本發(fā)明的實(shí)施方案。在一實(shí)施方案中，所述綴合物具有約50kDa_約5000kDa的分子量。在一實(shí)施方案中，所述綴合物具有約200kDa-約5000kDa的分子量。在一實(shí)施方案中，所述免疫原性綴合物具有約500kDa-約2500kDa的分子量。在一實(shí)施方案中，所述免疫原性綴合物具有約 500kDa-約2500kDa的分子量。在一實(shí)施方案中，所述免疫原性綴合物具有約600kDa_約 2800kDa的分子量。在一實(shí)施方案中，所述免疫原性綴合物具有約700kDa-約2700kDa的分子量。在一實(shí)施方案中，所述免疫原性綴合物具有約IOOOkDa-約2000kDa ;約1800kDa_約 2500kDa ；約 IlOOkDa-約 2200kDa ；約 1900kDa_ 約 2700kDa ；約 1200kDa_ 約 2400kDa ；約 1700kDa-約 2600kDa ;約 1300kDa_ 約 2600kDa ;約 1600kDa_ 約 3000kDa 的分子量。在任何上述范圍內(nèi)的任何整數(shù)考慮為本發(fā)明的實(shí)施方案。
在本文中使用時，“免疫原性”表示抗原(或者所述抗原的表位)，如細(xì)菌莢膜多糖或包含所述抗原的綴合物免疫原性組合物引發(fā)諸如哺乳動物的宿主中的免疫應(yīng)答(體液或細(xì)胞介導(dǎo)的，或者兩者)的能力。相應(yīng)地，在本文中使用時，“免疫原性綴合物”或“綴合物”表示含有綴合至載體分子的細(xì)菌莢膜多糖的抗原或抗原決定簇(即，表位)的任何免疫原性綴合物，其可以用來引發(fā)免疫應(yīng)答。所述免疫原性綴合物可以有助于通過與細(xì)胞表面的MHC分子相關(guān)的抗原呈遞來敏化宿主。此外，可以產(chǎn)生抗原特異性T-細(xì)胞或抗體以允許未來保護(hù)已免疫的宿主。因此免疫原性綴合物可以保護(hù)宿主避免與細(xì)菌感染相關(guān)的一種或多種癥狀，或者可以保護(hù)宿主避免由于感染與所述莢膜多糖相關(guān)的細(xì)菌的死亡。免疫原性綴合物還可以用來產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體，其可以用來賦予對象被動免疫。免疫原性綴合物還可以用來產(chǎn)生抗體，如通過在動物效力模型中殺死細(xì)菌或通過調(diào)理吞噬殺死測定所測量的，所述抗體是有功能的。“抗體”是能夠通過位于免疫球蛋白分子的可變區(qū)中的至少一個抗原識別位點(diǎn)特異性結(jié)合至靶(諸如糖類、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等)的免疫球蛋白分子。在本文中使用時， 除非上下文另有說明，該術(shù)語不僅包括完整多克隆或單克隆抗體，還包括工程抗體(例如， 嵌合、人源化和/或衍生以改變效應(yīng)子功能、穩(wěn)定性和其他生物學(xué)活性)及其片段(如Fab、 Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(ScFv)和結(jié)構(gòu)域抗體，包括鯊魚和駱駝抗體)，以及包含抗體部分的融合蛋白、多價抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體，只要它們表現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性)和如本文所述的抗體片段，以及包含抗原識別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的任何其他修飾的構(gòu)型?？贵w包括任何類別的抗體，如IgG、IgA或IgM(或其亞類)，并且所述抗體不需要是任何特定類別的。根據(jù)其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的抗體氨基酸序列，免疫球蛋白可以分配至不同類別。有五大類的免疫球蛋白184、1§0、1§￡、1§6和1§11，并且這些類別中的幾類可以進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如，人中的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。對應(yīng)于不同類別的免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為a、S、e、Y和ii。不同類別的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是公知的?！翱贵w片段”僅包含完整抗體的部分，其中所述部分優(yōu)選保留至少一種，優(yōu)選大部分或全部的通常與存在于完整抗體中時的該片段相關(guān)的功能。術(shù)語“抗原”一般指生物分子，通常為免疫原性組合物中的蛋白、肽、多糖或綴合物，或者可以在動物中刺激產(chǎn)生抗體或T-細(xì)胞應(yīng)答或者兩者的免疫原性物質(zhì),包括注射或吸收入動物的組合物。可以對整個分子，或者對該分子的不同部分(例如，表位或半抗原)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。該術(shù)語可以用來指單個分子，或者指抗原分子的同質(zhì)或異質(zhì)群體?？乖豢贵w、T-細(xì)胞受體或者特異性體液和/或細(xì)胞免疫的其他元件識別?！翱乖边€包括所有相關(guān)的抗原表位。給定抗原的表位可以利用本領(lǐng)域公知的任何數(shù)量的表位作圖技術(shù)來鑒定。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol. 66(Glenn E. Morris, Ed. , 1996) Humana Press, Totowa, N.J.。例如，線性表位可以這樣測定，例如， 在固體支持物上同時合成大量肽，所述肽對應(yīng)于蛋白分子的部分，并且在所述肽仍然連接至所述支持體的同時使所述肽與抗體反應(yīng)。這類技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且如美國專利第 4，708，871 號；Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :3998-4002 ;Geysen et al. (1986)Molec. Immunol. 23 :709-715所述；每個整體援引加入本文。相似地，構(gòu)象表位可以通過例如X射線晶體分析法和二維核磁共振測定氨基酸的空間構(gòu)象來鑒定。參見，例如， 上文的Epitope Mapping Protocols。此外，為了本發(fā)明的目的，“抗原”還可以用來指包括對天然序列的修飾的蛋白，如缺失、添加和取代(一般在自然中保守，但是它們可以不保守)，只要所述蛋白保持引起免疫應(yīng)答的能力。這些修飾可以是故意的，如通過位點(diǎn)定向誘變，或者通過特定合成方法，或者通過基因工程方法，或者可以是偶然的，如通過宿主的突變，其產(chǎn)生抗原。此外，抗原可以來源于、獲得自或分離自微生物，例如細(xì)菌，或者可以是整個有機(jī)體。相似地，如在核酸免疫應(yīng)用中表達(dá)抗原的寡核苷酸或多核苷酸也包括在所述定義中。還包括合成抗原，例如，多表位、側(cè)翼表位以及其他重組或合成來源的抗原(Bergmann et al. (1993)Eur. J. Tmmuno1. 23 :2777 2781 ；Bergmann et al. (1996)J. Tmmuno1. 157 3242-3249 ；Suhrbier(1997)Immunol. Cell Biol. 75 :402 408 !Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva,Switzerland, Jun. 28to Jul. 3,1998)?！氨Ｗo(hù)性”免疫應(yīng)答指免疫原性組合物引起體液或細(xì)胞或者兩者介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力，所述免疫應(yīng)答有助于保護(hù)對象免受感染。所提供的保護(hù)不需要是絕對的，即，如果與對象的對照群體(例如未施用所述疫苗或免疫原性組合物的感染的動物)相比有統(tǒng)計上顯著的改善，所述感染不需要被完全阻止或根除。保護(hù)可以限于緩解所述感染癥狀發(fā)生的嚴(yán)重程度或速度。一般來說，“保護(hù)性免疫應(yīng)答”包括在至少50%的對象中誘導(dǎo)特定抗原的特異性抗體水平的提高，包括對每種抗原應(yīng)答的可測量的功能抗體的一些水平。在特定情況下，“保護(hù)性免疫應(yīng)答”可以包括在至少50%的對象中誘導(dǎo)特定抗原的特異性抗體水平的 2倍增加或4倍增加，包括對每種抗原應(yīng)答的可測量的功能抗體的一些水平。在某些實(shí)施方案中，調(diào)理抗體與保護(hù)性免疫應(yīng)答相關(guān)。因此，保護(hù)性免疫應(yīng)答可以通過測量調(diào)理吞噬測定中細(xì)菌計數(shù)減少的百分比來測定，例如下文所述。優(yōu)選地，細(xì)菌計數(shù)有至少10%、25%、 50%,65%,75%,80%,85%,90%,95%或更多的減少。組合物中特定綴合物的“免疫原性量”一般基于總多糖(對于該綴合物綴合或未綴合的)劑量施用。例如，含有20%游離多糖的血清型5或8莢膜多糖在IOOmcg劑量中會含有約80mcg綴合的多糖和約20mcg未綴合的多糖。在計算綴合物的劑量時，通常不考慮蛋白對所述綴合物的貢獻(xiàn)。綴合物的量可以根據(jù)葡萄球菌血清型變化。通常，每個劑量會包含0. I-IOOmcg多糖，特別是0. I-IOmcg, 并且更特別是l-10mcg。術(shù)語“對象”指哺乳動物、鳥、魚、爬行動物或任何其他動物。術(shù)語“對象”還包括人。術(shù)語“對象”還包括家庭寵物。家庭寵物的非限制性實(shí)例包括犬、貓、豬、兔、大鼠、小鼠、沙鼠、倉鼠、豚鼠、雪貂、鳥、蛇、蜥蜴、魚、海龜和蛙。術(shù)語“對象”還包括家畜。家畜的非限制性實(shí)例包括羊駝、野牛、駱駝、牛、鹿、豬、馬、美洲駝、騾、驢、綿羊、山羊、兔、馴鹿、牦牛、雞、鵝和火雞。如圖I所示，金黃色葡萄球菌血清型5和8莢膜多糖具有以下結(jié)構(gòu)血清型 5[ — 4) - P -D-ManNAcA- (I — 4) -3-0-Ac- a -L-FucNAc-(I — 3)-DFucNAc- (I — ]n.和血清型 8 [ — 3) -4-0-Ac- ^ -D-ManNAcA- (I — 3) - a -L-FucNAc-(I — 3) - P -DFucNAc-(I —] n.。參見，Jones (2005) Carbohydr. Res. 340 :1097_1106。血清型8莢膜多糖具有與血清型 5莢膜多糖相似的三糖重復(fù)單元；但是，它們在糖鍵和0-乙?；稽c(diǎn)不同，這產(chǎn)生血清學(xué)上不同的免疫反應(yīng)性模式(Fournier et al. (1984) Infect. Tmmun. 45 :87-93 ；and Moreau et al. (1990) Carbohydr. Res. 201 :285-297)。因此血清型8和5莢膜多糖是水溶性的相對復(fù)雜的糖類，通常為酸性，并且以前認(rèn)為其具有約25kDa的分子量(Fattom(1990) Infect. Immun. 58,2367-2374)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的血清型5和/或8莢膜多糖是0-乙酰化的。在一些實(shí)施方案中，5型莢膜多糖或寡糖的0-乙?；潭葹?0-100%、20-100%、30-100 %、 40-100%、50-10060-100%、70-10080-10090-100%、50-90% ,60-90%、70-90% 或者80-90%。在一些實(shí)施方案中，8型莢膜多糖或寡糖的0-乙?；潭葹?0-100%、 20-100 30-100 40-100 50-100 60-100 70-100 80-100 90-100 50-90 %、60-90%、70-90%或者80-90 %。在一些實(shí)施方案中，5型和8型莢膜多糖或寡糖的 0-乙?；潭葹?10-100 %、20-100 %、30-100 %、40-100 %、50-100 %、60-100 %、 70-10080-10090-100%、50-9060-90%、70-90%或者 80-90%。所述多糖或寡糖的0-乙?；潭瓤梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法測定，例如，通過質(zhì)子 NMR(Lemercinier and Jones 1996, Carbohydrate Research 296 ;83_96, Jones and Lemercinier 2002, J Pharmaceutical and Biomedical analysis 30 ；1233-1247,WO 05/033148 或 WO 00/56357)。另一常用的方法如 Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180 ;249_261 所述。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的血清型5和/或8莢膜多糖用來產(chǎn)生抗體，如通過在動物效力模型中殺死細(xì)菌或通過證實(shí)所述抗體殺死細(xì)菌的調(diào)理吞噬殺死測定所測量的，所述抗體是有功能的。利用單獨(dú)監(jiān)測抗體的產(chǎn)生的測定可能未證實(shí)這樣的殺死功能性，其未顯示0-乙?；谛Яχ械闹匾?。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分離方法，諸如血清型5或8的莢膜多糖可以直接獲得自細(xì)菌。參見，例如，上文的Fournier et al. (1984) ；Fournier et al. (1987) Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 138 :561-567 ;美國專利申請公開第2007/0141077號；以及國際專利申請公開第WO 00/56357 ;每個整體援引加入本文。此外，它們可以利用合成方案來制備。 而且，血清型5或8莢膜多糖可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員還已知的基因工程方法重組產(chǎn)生 (參見，Sau et al. (1997)Microbiology 143 :2395-2405 ;以及美國專利第 6，027，925 號， 每個整體援引加入本文)?？梢杂脕慝@得分離的血清型8莢膜多糖的一種金黃色葡萄球菌菌株是金黃色葡萄球菌R2 PFESA0286。將金黃色葡萄球菌PFESA0286 (美國典型培養(yǎng)物保藏中心； Manassas, VA ；ATCC登錄號49525 ；)在改良的Frantz肉湯中培養(yǎng)之后，用兔抗血清型8多糖抗體通過流式細(xì)胞術(shù)選擇這種菌株。流式細(xì)胞術(shù)期間觀察到兩個群體Rl和R2。將Rl和R2純化和重新培養(yǎng)。R2產(chǎn)生血清型8莢膜多糖。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示同質(zhì)熒光強(qiáng)度。因此，選擇R2用于血清型8莢膜多糖制備?？梢杂脕慝@得分離的血清型5莢膜多糖的一種金黃色葡萄球菌是金黃色葡萄球菌PFESA0266。這種菌株在生長期間產(chǎn)生血清型5莢膜多糖，并且在細(xì)胞處于穩(wěn)定期時生產(chǎn)達(dá)到高峰。其他金黃色葡萄球菌5型或8型菌株可以用來制備獲得自建立的培養(yǎng)物收藏或臨床標(biāo)本的各自的多糖。本發(fā)明的免疫原性綴合物的另一組分是綴合所述細(xì)菌莢膜多糖的載體分子或蛋白。術(shù)語“蛋白載體”或“載體蛋白”指可以綴合至抗原(如所述莢膜多糖)的任何蛋白分子， 針對所述抗原的免疫應(yīng)答是期望的。綴合至載體可以增強(qiáng)所述抗原的免疫原性?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行綴合。所述抗原的優(yōu)選的蛋白載體為毒素，類毒素或者來自破傷風(fēng)、白喉、百日咳、假單胞菌(Pseudomonas)、大腸桿菌(E. coli)、葡萄球菌和鏈球菌(Streptococcus) 的毒素的任何突變交叉反應(yīng)性物質(zhì)(CRM)。在一實(shí)施方案中，特別優(yōu)選的載體為白喉類毒素 CRM197,其來源于產(chǎn)生CRM197蛋白的白喉棒桿菌(C. diphtheriae)菌株C7 ( ^ 197)。這種菌株具有ATCC登錄號53281。用于制備CRM197的方法如美國專利第5，614，382號所述，其整體援引加入本文?；蛘?，可以使用所述蛋白載體或其他免疫原性蛋白的片段或表位。例如，可以將半抗原偶聯(lián)至細(xì)菌毒素、類毒素或CRM的T-細(xì)胞表位。參見，1988年2月I日提交的題目為"Synthetic Peptides Representing a T-Cell Epitope as a Carrier Molecule For Conjugate Vaccines"的美國專利申請第150，688號；其整體援引加入本文。其他合適的載體蛋白包括滅活的細(xì)菌毒素，如霍亂類毒素(例如，如國際專利申請第W02004/083251 號所述)、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST以及來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A。還可以使用細(xì)菌外膜蛋白，如外膜蛋白復(fù)合物c(OMPC)、孔蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)或流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)蛋白D。其他蛋白也可以用作載體蛋白，如卵白蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PH))。因此，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性綴合物內(nèi)的載體蛋白為CRM197，并且所述CRM197通過氨基甲酸酯鍵、酰胺鍵或兩者共價連接至所述莢膜多糖。在一些實(shí)施方案中， 本發(fā)明的免疫原性綴合物內(nèi)的載體蛋白為CRM197,并且所述CRM197通過硫醚鍵共價連接至所述莢膜多糖。所述載體蛋白中綴合至莢膜多糖的賴氨酸殘基的數(shù)目可以表征為綴合的賴氨酸的范圍。例如，在給定的免疫原性組合物中，所述CRM197在39個賴氨酸中可以包含5-15個賴氨酸共價連接至所述莢膜多糖。表達(dá)這個參數(shù)另一方式是12% -40%的CRM197賴氨酸共價連接至所述莢膜多糖。例如，在給定的免疫原性組合物中，所述CRM197在39個賴氨酸中可以包含18-22個賴氨酸共價連接至所述莢膜多糖。表達(dá)這個參數(shù)的另一方式是40% -60% 的CRM197賴氨酸共價連接至所述莢膜多糖。在一些實(shí)施方案中，所述CRM197在39個賴氨酸中包含5-15個賴氨酸共價連接至CP8。表達(dá)這個參數(shù)的另一方式是12 % -40 %的CRM197賴氨酸共價連接至CP8。在一些實(shí)施方案中，所述CRM197在39個賴氨酸中包含18-22個賴氨酸共價連接至CP5。表達(dá)這個參數(shù)的另一方式是40% -60%的CRM197賴氨酸共價連接至CP5。
如上文所討論，所述載體蛋白中綴合至所述莢膜多糖的賴氨酸殘基的數(shù)目可以表征為綴合的賴氨酸的范圍，其可以表達(dá)為摩爾比。例如，所述CP8免疫原性綴合物中綴合的賴氨酸比CRM197的摩爾比可以為約18 I-約22 I。在一實(shí)施方案中，所述CP8免疫原性綴合物中綴合的賴氨酸比CRM197的摩爾比的范圍可以為約15 I-約25 I。在一些實(shí)施方案中，所述CP8免疫原性綴合物中綴合的賴氨酸比CRM197的摩爾比的范圍可以為約 14 I-約 20 I ;約 12 I-約 18 I ;約 10 I-約 16 I;約 8 I-約 14 I ;約
6 I-約 12 : I;約 4 : I-約 10 I;約 20 I-約 26 I ;約 22 I-約 28 I ;約 24 : I-約 30 : I ;約 26 : I-約 32 : I ;約 28 I-約 34 : I ;約 30 I-約 36 : I ;約 5 : I-約 10 : I ;約 5 : I-約 20 I ;約 10 I-約 20 I ;或者約 10 I-約 30 I。 而且，所述CP5免疫原性綴合物中綴合的賴氨酸比CRM197的摩爾比可以為約3 1-25 I。 一實(shí)施方案中，所述CP5免疫原性綴合物中綴合的賴氨酸比CRM197的摩爾比的范圍可以為約5 I-約20 I。在一實(shí)施方案中，所述CP5免疫原性綴合物中綴合的賴氨酸比CRM197 的摩爾比的范圍可以為約4 I-約20 I;約6 I-約20 : I;約7 : I-約20 I ;約 8 I-約 20 I ;約 10 I-約 20 I ;約 11 I-約 20 I ;約 12 I-約 20 I ;約 13 I-約 20 I ;約 14 I-約 20 I ;約 15 I-約 20 I ;約 16 I-約 20 I ;約 17 I-約 20 I ;約 18 I-約 20 : I;約 5 : I-約 18 I ;約 7 I-約 16 I ;或者約 9 I-約 14 I表達(dá)所述載體蛋白中綴合至所述莢膜多糖的賴氨酸殘基的數(shù)目的另一方式可以為綴合的賴氨酸的范圍。例如，在給定的CP8免疫原性綴合物中，所述CRM197在39個賴氨酸中可以包含5-15個賴氨酸共價連接至所述莢膜多糖?；蛘?，這個參數(shù)可以表達(dá)為百分比。 例如，在給定的CP8免疫原性綴合物中，綴合的賴氨酸的百分比可以為10% -50%。在一些實(shí)施方案中，20% -50%的賴氨酸可以共價連接至CP8。或者，30% -50%的CRM197賴氨酸可以共價連接至CP8 ；10% -40%的CRM197賴氨酸、10% -30%的CRM197賴氨酸、20% -40%的 CRM197 賴氨酸、25% -40% 的 CRM197 賴氨酸、30% -40% 的 CRM197 賴氨酸、10% -30% 的 CRM197 賴氨酸、15% -30%的CRM197賴氨酸、20% -30%的CRM197賴氨酸、25% -30%的CRM197賴氨酸、10 % -15 %的CRM197賴氨酸、或者10 % -12 %的CRM197賴氨酸共價連接至CP8。而且，在給定的CP5免疫原性綴合物中，所述CRM197在39個賴氨酸中可以包含18-22個賴氨酸共價連接至所述莢膜多糖?；蛘?，這個參數(shù)可以表達(dá)為百分比。例如，在給定的CP5免疫原性綴合物中，綴合的賴氨酸的百分比可以為40% -60%。在一些實(shí)施方案中，40% -60%的賴氨酸可以共價連接至CP5。或者，30% -50%的CRM197賴氨酸可以共價連接至CP5 ；20% -40%的 CRM197 賴氨酸、10% -30% 的 CRM197 賴氨酸、50% -70% 的 CRM197 賴氨酸、35% -65% 的 CRM197 賴氨酸、30% -60%的CRM197賴氨酸、25% -55%的CRM197賴氨酸、20% -50%的CRM197賴氨酸、15% -45% 的 CRM197 賴氨酸、10% -40% 的 CRM197 賴氨酸、40% -70% 的 CRM197 賴氨酸、或者45% -75%的CRM197賴氨酸共價連接至CP5。莢膜多糖鏈附著至所述載體分子上的賴氨酸的頻率是表征莢膜多糖綴合物的另一參數(shù)。例如，在一實(shí)施方案中，對于所述莢膜多糖的至少每5-10個糖重復(fù)單元，存在至少一個CRM197和多糖之間的共價鍵。在另一實(shí)施方案中，對于所述莢膜多糖的每5-10個糖重復(fù)單元,每2-7個糖重復(fù)單元，每3-8個糖重復(fù)單元，每4-9個糖重復(fù)單元，每6-11個糖重復(fù)單元,每7-12個糖重復(fù)單元，每8-13個糖重復(fù)單元，每9-14個糖重復(fù)單元，每10-15個糖重復(fù)單元，每2-6個糖重復(fù)單元，每3-7個糖重復(fù)單元，每4-8個糖重復(fù)單元，每6-10個糖重復(fù)單元，每7-11個糖重復(fù)單元，每8-12個糖重復(fù)單元，每9-13個糖重復(fù)單元，每10-14 個糖重復(fù)單元，每10-20個糖重復(fù)單元，或者每5-10個糖重復(fù)單元，存在至少一個CRM197和莢膜多糖之間的共價鍵。在另一實(shí)施方案中，對于所述莢膜多糖的每2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個糖重復(fù)單元，存在至少一個CRM197和莢膜多糖之間的鍵。本發(fā)明的一實(shí)施方案提供包含任何免疫原性綴合物的免疫原性組合物，所述免疫原性綴合物包含綴合至上文所述的載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖。術(shù)語“免疫原性組合物”涉及含有抗原的任何藥物 組合物，例如微生物或者其組分，所述組合物可以用來引起對象中的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的免疫原性組合物可以用于通過全身性、透皮或粘膜途徑施用所述免疫原性組合物來保護(hù)或治療對金黃色葡萄球菌感染易感的人，或者用于產(chǎn)生可以用來賦予另一對象被動免疫的多克隆或單克隆抗體制品。這些施用可以包括通過肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮內(nèi)或皮下途徑注射；或者通過粘膜給至口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。在一實(shí)施方案中，鼻內(nèi)施用用于治療或預(yù)防金黃色葡萄球菌的鼻咽攜帶，從而在感染的最初階段減弱感染。免疫原性組合物還可以用來產(chǎn)生抗體，如通過在動物效力模型中殺死細(xì)菌或通過調(diào)理吞噬殺死測定所測量的，所述抗體是有功能的。特定免疫原性組合物的組分的最佳量可以通過標(biāo)準(zhǔn)研究來確定，包括觀察對象中的適當(dāng)免疫應(yīng)答。初始免疫接種之后，對象可以接受充分間隔的一次或多次加強(qiáng)免疫。本發(fā)明的免疫原性組合物還可以包括一種或多種以下抗原ClfA、ClfB, SdrC, SdrD> SdrE MntC/SitC/ 唾液結(jié)合蛋白、IsdB、IsdA、0pp3a、DltA、HtsA、LtaS、SdrH、 SrtA、SpA、SBI、a -溶血素(hla)、P -溶血素、纖連蛋白結(jié)合蛋白A(fnbA)、凝固酶、map、 Panton-Valentine殺白細(xì)胞素(pvl)、y-毒素(hlg)、ica、免疫顯性ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、RAP、自溶素、層粘連蛋白受體、IsaA/PisA、IsaB/PisB、SPOIIIE、SsaA、EbpS、SasF、SasH、EFB(FIB)、 FnbB、Npase、EBP、骨唾液酸結(jié)合蛋白 II (bone sialo binding protein II)、金黃色葡萄球菌金屬蛋白酶(aureolysin)前體(AUR)/Seppl、Can、TSST-1、mecA、dPNAG、GehD、EbhA、 EbhB、SSP-I、SSP-2 HBP、玻連蛋白結(jié)合蛋白、HarA、腸毒素A、腸毒素B、腸毒素Cl以及新自溶素。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物進(jìn)一步包含佐劑、緩沖劑、冷凍保護(hù)齊U、鹽、二價陽離子、非離子型去污劑、自由基氧化抑制劑、稀釋劑或載體中的至少一種。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物內(nèi)的佐劑是基于鋁的佐劑。在一實(shí)施方案中，所述佐劑是選自磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁的基于鋁的佐劑。在一實(shí)施方案中，所述佐劑為磷酸招。佐劑是在與免疫原或抗原一起施用時增強(qiáng)免疫應(yīng)答的物質(zhì)。據(jù)證實(shí)許多細(xì)胞因子或淋巴因子具有免疫調(diào)節(jié)活性，并且因此可以與佐劑相同或相似的方式有用，其包括但不限于白介素1-a 、2、4、5、6、7、8、10、12(參見，例如，美國專利第5，723，127號)、13、 14、15、16、17和18 (及其突變形式)；干擾素-a、0和Y ;粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)(參見，例如，美國專利第5，078, 996號和ATCC登錄號39900);巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF);粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF);以及腫瘤壞死因子a和P。有益于本文所述的免疫原性組合物的其他佐劑包括趨化因子，包括但不限于MCP-1、MIP-1 a、MIP-I ^和 RANTES ;粘附分子，例如選擇素，如L-選擇素、P-選擇素和E-選擇素；粘蛋白樣分子，例如， CD34、GlyCAM-l 和 MadCAM-I ;整聯(lián)蛋白家族成員，如 LFA-1、VLA-1、Mac-I 和 pl50. 95 ;免疫球蛋白超家族成員，例如PECAM，ICAM，如ICAM-I、ICAM-2和ICAM-3，CD2和LFA-3 ;共刺激分子，如B7-l、B7-2、⑶40和⑶40L ;生長因子，包括血管生長因子、神經(jīng)生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、PDGF, BL-I和血管內(nèi)皮生長因子；受體分子，包括Fas、TNF受體、 Fit、Apo-I、p55、WSL-I、DR3、TRAMP、Apo_3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、 TRICK2和DR6 ;以及半胱天冬蛋白酶，包括ICE。
用來增強(qiáng)免疫應(yīng)答的合適的佐劑可以進(jìn)一步包括但不限于美國專利第4，912，094 號所述的MPL (3-0-脫酰單磷酰脂質(zhì)A, Corixa ； Hami I ton, MT)。合成的脂質(zhì)A類似物或氨基烷基磷酸葡糖胺化合物(AGP)，或者其衍生物或類似物也適合用作佐劑，其可從 Corixa獲得，并且如美國專利第6，113,918號所述。一種這樣的AGP為2_[(R)_3_十四?；趸孽０被鵠乙基2-脫氧-4-0-膦?；?3-0-[(R)-3-四癸?；趸孽-2- [ (R) -3-十四酰氧十四酰-氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也稱為529 (以前稱為 RC529)。這種529佐劑配制為水性形式(AF)或者為穩(wěn)定的乳劑(SE)。其他佐劑包括胞壁酰肽，如N-乙?；?胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺 (訪1-1 )4-乙?；?降胞壁酰-1^丙氨酸-2-(1' -2' 二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-羥基磷?；趸?_乙胺(MTP-PE);水包油乳劑，如1 59(美國專利第6，299，884號)(含有5% 角鯊烯、0. 5%聚山梨酯80和0. 5%司盤85 (任選含有各種量的MTP-PE)，利用諸如Model IlOY微射流機(jī)(Microfluidics，Newton, MA)的微射流機(jī)配制為亞微粒子)和SAF(含有 10%角鯊烯、0. 4%聚山梨酯80、5%普流羅尼克-嵌段聚合物L(fēng)121和thr-MDP，微射流為亞微乳劑或者渦旋以產(chǎn)生較大粒徑的乳劑)；不完全弗氏佐劑(IFA);鋁鹽(明礬)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁；愛菲金；阿夫立定；L121/角鯊烯；D-丙交酯-聚交酯/苷；普流羅尼克多元醇；殺死的博德特氏菌(Bordetella);皂草苷，如美國專利第5，057，540號所述的 Stimu I on QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.)，美國專利第 5, 254, 339 號所述的 Iscomatrix (CSL Limited, Parkville, Australia)以及免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS);結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis);細(xì)菌脂多糖；合成的多核苷酸，如含有CpG基序的寡核苷酸(例如，美國專利第 6，207，646 號)；IC-31 (Intercell AG, Vienna, Austria), 如EP專利第1，296，713號和第1，326，634號所述；百日咳毒素(PT)或其變體、霍亂毒素或其變體(例如，美國專利號7，285，281,7, 332，174,7, 361，355和7，384，640);或者大腸桿菌不耐熱毒素(LT)或其變體，特別是LT-K63、LT-R72 (例如，美國專利號6，149,919、 7，115，730 和 7，291，588)。所述免疫原性組合物可以任選包含藥學(xué)可接受的載體。術(shù)語“藥學(xué)可接受的載體”表示聯(lián)邦管理機(jī)構(gòu)、州政府或其他管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的載體，或者美國藥典或用于動物 (包括人以及非人哺乳動物)的其他普遍公認(rèn)的藥典所列的載體。術(shù)語“載體”指與藥物組合物一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。水、鹽溶液以及水性葡萄糖和甘油溶液可以用作液體載體，特別是用于可注射的溶液。合適的藥物載體的實(shí)例如E.W. Martin 的"Remington' s Pharmaceutical Sciences"所述。制劑應(yīng)當(dāng)適合施用模式。本發(fā)明的免疫原性組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種額外的“免疫調(diào)節(jié)劑”，所述免疫調(diào)節(jié)劑是擾亂或改變免疫系統(tǒng)的物質(zhì)，從而觀察到體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的上調(diào)或下調(diào)。在一實(shí)施方案中，提供免疫系統(tǒng)的體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)的上調(diào)的手段。某些免疫調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括，例如，美國專利第5，254，339號等所述的佐劑或細(xì)胞因子，或者 Iscomatrix (C SL Limited ;Parkville, Australia)?？梢杂糜诒景l(fā)明的免疫原性組合物的佐劑的非限制性實(shí)例包括RIBI佐劑系統(tǒng)(Ribi Inc. ;Hamilton，MT)，明帆，諸如氫氧化鋁凝膠的礦物凝膠，水包油乳劑，油包水乳劑，例如弗氏完全和不完全佐劑，嵌段共聚物 (CytRx ；Atlanta, GA), QS-21(Cambridge Biotech Inc. ； Cambridge, MA), SAF-M(Chiron ；
Emeryville, CA) ,Amphigen 佐劑，阜草苷，Quil A或其他阜草苷組分,單磷酰脂質(zhì)A以及
阿夫立定脂質(zhì)-胺佐劑。在本發(fā)明的免疫原性組合物中有用的水包油乳劑的非限制性實(shí)例包括改良的SEAM62和SEAM 1/2制劑。改良的SEAM62是含有5% (v/v)角鯊烯(Sigma)、
1% (v/v) Span 85去污劑(ICI表面活性劑)、0. 7% (v/v)聚山梨酯80去污劑(ICI表面活性劑)、2.5% (v/v)乙醇、200mcg/ml Quil A、100mcg/ml 膽固醇以及 0. 5% (v/v)卵磷脂的水包油乳劑。改良的SEAM 1/2是包含5% (v/v)角鯊烯、1% (v/v) Span 85去污劑、 0. 7% (v/v)聚山梨酯 80 去污劑、2. 5% (v/v)乙醇、100mcg/ml Quil A 以及 50mcg/ml 膽固醇的水包油乳劑。可以包括在所述免疫原性組合物中的其他“免疫調(diào)節(jié)劑”包括，例如，一種或多種白介素、干擾素、或者其他已知的細(xì)胞因子或趨化因子。在一實(shí)施方案中，所述佐劑可以是環(huán)糊精衍生物或聚陰離子聚合物，分別如美國專利第6，165，995號和第6，610，310 號所述。應(yīng)當(dāng)理解待使用的免疫調(diào)節(jié)劑和/或佐劑取決于施用所述免疫原性組合物的對象、注射途徑以及待施用的注射的數(shù)量。除了多種葡萄球菌莢膜多糖-蛋白綴合物，本發(fā)明的免疫原性組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種防腐劑。FDA要求多個劑量(多劑量)小瓶中的生物制品含有防腐劑，僅有少數(shù)例外。含有防腐劑的疫苗產(chǎn)品包括含有芐索氯銨(炭疽)、2_苯氧乙醇(DTaP、HepA、 Lyme、脊髓灰質(zhì)炎(腸胃外))、苯酹(Pneumo、傷寒(腸胃外)、牛痘)和硫柳萊(DTaP、DT、 丁(1、11印8、11讓、流感、邛^61^1^、？1^111110、狂犬病)的疫苗。批準(zhǔn)用于可注射的藥物的防腐劑包括，例如，三氯叔丁醇、間甲苯酚、羥苯甲酯、羥苯丙酯、2-苯氧乙醇、芐索氯銨、苯扎氯銨、苯甲酸、苯甲醇、苯酚、硫柳汞以及硝酸苯汞。本發(fā)明的制劑可以進(jìn)一步包含緩沖劑、鹽、二價陽離子、非離子型去污劑、冷凍保護(hù)劑(諸如糖)以及抗氧化劑(諸如自由基清除劑或螯合劑)中的一種或多種，或者它們的任何多種組合。任何一種組分(例如，螯合劑)的選擇可以決定另一組分(例如，清除劑) 是否可取。為施用配制的最終組合物應(yīng)當(dāng)無菌和/或無熱原。技術(shù)人員可以根據(jù)各種因素， 例如所需的特定儲存和施用條件，憑經(jīng)驗(yàn)確定這些和其他組分的哪種組合包括在本發(fā)明的含有防腐劑的免疫原性組合物中是最佳的。在某些實(shí)施方案中，與腸胃外施用相容的本發(fā)明的制劑包含一種或多種生理可接受的緩沖劑，其選自但不限于Tris (trimethamine)、磷酸鹽、乙酸鹽、硼酸鹽、朽1檬酸鹽、甘氨酸、組氨酸和琥珀酸鹽。在某些實(shí)施方案中，將所述制劑緩沖至約6. 0-約9. 0的pH范圍內(nèi)，優(yōu)選約6. 4-約7. 4。在某些實(shí)施方案中，調(diào)整本發(fā)明的免疫原性組合物或制劑的pH是可取的?？梢岳帽绢I(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)調(diào)整本發(fā)明的制劑的pH?？梢詫⑺鲋苿┑膒H調(diào)整至3. 0-8. O。在某些實(shí)施方案中，所述制劑的pH可以是、或者可以調(diào)整至3. 0-6. 0,4. 0-6. 0或5. 0-8. O。在其他實(shí)施方案中，所述制劑的pH可以是、或者可以調(diào)整至約3. O、約3. 5、約4. O、約4. 5、約 5. O、約5. 5、約5. 8、約6. O、約6. 5、約7. O、約7. 5或約8. O。在某些實(shí)施方案中，pH可以是、或者可以調(diào)整至范圍為 4. 5-7. 5、或者 4. 5-6. 5,5. 0-5. 4,5. 4-5. 5,5. 5-5. 6,5. 6-5. 7、5. 7~5. 8、5. 8~5. 9、5. 9-6. 0、6. 0-6. 1、6. 1-6. 2、6. 2-6. 3、6. 3-6. 5、6. 5-7. 0、7. 0-7. 5 或 7. 5-8. 0。在特定實(shí)施方案中，所述制劑的pH為約5. 8。在某些實(shí)施方案中，與腸胃外施用相容的本發(fā)明的制劑包含一種或多種二價陽離子，包括但不限于MgCl2、CaCljP MnCl2，濃度范圍為約0. ImM-約10mM，優(yōu)選最多約5mM。
在某些實(shí)施方案中，與腸胃外施用相容的本發(fā)明的制劑包含一種或多種鹽，包括但不限于氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉和硫酸鉀，以腸胃外施用時對象生理可接受的離子強(qiáng)度存在，并且以在最終制劑中產(chǎn)生所選的離子強(qiáng)度或摩爾滲透壓濃度的終濃度包括在內(nèi)。所述制劑的最終離子強(qiáng)度或重量摩爾滲透壓濃度是由多種組分(例如，來自緩沖化合物和其他非緩沖鹽的離子)決定的。優(yōu)選的鹽NaCl以多達(dá)約250mM的范圍存在，選擇鹽濃度以補(bǔ)足其他組分(例如，糖)使得所述制劑的最終總摩爾滲透壓濃度與腸胃外施用(例如，肌肉內(nèi)或皮下注射)相容，并且會提高所述免疫原性組合物制劑的免疫原性組分在各種溫度范圍中的長期穩(wěn)定性。不含鹽的制劑會容忍增加的一種或多種所選冷凍保護(hù)劑的范圍以維持期望的最終摩爾滲透壓濃度水平。在某些實(shí)施方案中，與腸胃外施用相容的本發(fā)明的制劑包含一種或多種冷凍保護(hù)齊U，其選自但不限于二糖(例如，乳糖、麥芽糖、蔗糖或海藻糖)和多羥基烴(例如，衛(wèi)矛醇、 甘油、甘露醇和山梨醇)。在某些實(shí)施方案中，所述制劑的摩爾滲透壓濃度在約200m0s/L-約800m0s/L的范圍內(nèi)，優(yōu)選約250m0s/L-約500m0s/L或者約300m0s/L_約400m0s/L的范圍。不含鹽的制劑可以含有例如約5% -約25%蔗糖，并且優(yōu)選約7% -約15%或者約10% -約12%蔗糖。或者，不含鹽的制劑可以含有例如約3%-約12%山梨醇，并且優(yōu)選約4%-7%或者約 5%-約6%山梨醇。如果加入諸如氯化鈉的鹽,貝U鹿糖或山梨醇的有效范圍相對減少。這些和其他這樣的重量摩爾滲透壓濃度和摩爾滲透壓濃度考慮因素在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，與腸胃外施用相容的本發(fā)明的制劑包含一種或多種自由基氧化抑制劑和/或螯合劑。各種自由基清除劑和螯合劑是本領(lǐng)域已知的，并且應(yīng)用于本文所述的制劑和使用方法。實(shí)例包括但不限于乙醇、EDTA、EDTA/乙醇組合、三乙醇胺、甘露醇、 組氨酸、甘油、檸檬酸鈉、肌醇六磷酸酯、三聚磷酸鹽、抗壞血酸/抗壞血酸鹽、琥珀酸/琥珀酸鹽、蘋果酸/馬來酸鹽、得斯芬、EDDHA和DTPA，以及兩種或更多種以上物質(zhì)的各種組合。 在某些實(shí)施方案中，可以有效提高所述制劑的長期穩(wěn)定性的濃度加入至少一種非還原性自由基清除劑。還可以各種組合加入一種或多種自由基氧化抑制劑/螯合劑，例如清除劑與二價陽離子。螯合劑的選擇會決定是否需要加入清除劑。在某些實(shí)施方案中，與腸胃外施用的相容的本發(fā)明的制劑包含一種或多種非離子表面活性劑，包括但不限于聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯，聚山梨酯_80(吐溫80)、聚山梨酯-60 (吐溫60)、聚山梨酯-40 (吐溫40)和聚山梨酯-20 (吐溫20)，聚氧乙烯烷基醚，包括但不限于Brij 58, Brij 35，以及其他如曲通X-100 ;曲通X-114、NP40、司盤85和非離子表面活性劑的普流羅尼克系列(例如，普流羅尼克121)，優(yōu)選組分為約0. 001% -約2% (優(yōu)選最多約0.25% )濃度的聚山梨酯-80或約0.001% -1% (優(yōu)選最多約0.5% )濃度的聚山梨酯-40。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑包含一種或多種額外的適合腸胃外施用的穩(wěn)定齊U，例如，包含至少一個巰基(-SH)的還原劑(例如，半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、還原谷胱甘肽、巰基乙酸鈉、硫代硫酸鹽、硫代甘油，或者它們的混合物)?？蛇x地或任選地，可以通過從儲存容器去除氧、保護(hù)所述制劑免受光照(例如，通過使用琥珀色玻璃容器)來進(jìn)一步穩(wěn)定本發(fā)明的含有防腐劑的免疫原性組合物制劑。本發(fā)明的含有防腐劑的免疫原性組合物制劑可以包含一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑，其包括本身不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的任何賦形劑。合適的賦形劑包括但不限于大分子，例如蛋白、糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖(Paoletti et al,2001, Vaccine, 19 :2118)、海藻糖、乳糖和脂質(zhì)團(tuán)聚體(如油滴或脂質(zhì)體)。這類載體是技術(shù)人員公知的。藥學(xué)可接受的賦形劑如Gennaro, 2000, Remington :The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN :0683306472 所討論。本發(fā)明的組合物可 以是凍干的或水性形式，即溶液劑或混懸劑。液體制劑可以有利地直接從其包裝形式施用，因此對于注射是理想的，不需要如本發(fā)明的凍干組合物另有要求地重建于水性介質(zhì)中。將本發(fā)明的免疫原性組合物直接遞送至對象可以通過腸胃外施用(肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)或者至組織的胞間隙)來完成；或者通過直腸、口服、陰道、體表、透皮、鼻內(nèi)、眼部、耳部、肺部或其他粘膜施用。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，腸胃外施用通過肌肉內(nèi)注射，例如至對象的大腿或上臂。注射可以通過針(例如，皮下針)，但是可替代地使用無針注射。典型的肌肉內(nèi)劑量為0. 5mL。本發(fā)明的組合物可以制備為各種形式，例如，作為液體溶液劑或混懸劑用于注射。在某些實(shí)施方案中，所述組合物可以制備為粉劑或噴霧劑用于肺部施用，例如，在吸入器中。在其他實(shí)施方案中，所述組合物可以制備為栓劑或陰道栓劑， 或者對于鼻部、耳部、或眼部施用，例如，作為噴霧劑、滴劑、凝膠劑或粉劑。每個免疫原性組合物劑量中綴合物的量選擇為誘導(dǎo)沒有顯著副作用的免疫保護(hù)應(yīng)答的量。這樣的量可以根據(jù)葡萄球菌血清型變化。通常，每個劑量包含0. 1-lOOi! g多糖， 特別是0. 1-10 Ii g,并且更特別是1-5 u go特定免疫原性組合物的組分的最佳量可以通過標(biāo)準(zhǔn)研究來確定，包括觀察對象中的適當(dāng)免疫應(yīng)答。初始免疫接種之后，對象可以接受充分間隔的一次或多次加強(qiáng)免疫。包裝和劑型 本發(fā)明的免疫原性組合物可以包裝為單位劑量或多劑量形式(例如2個劑量、4個劑量或更多)。對于多劑量形式，小瓶相對于預(yù)灌裝注射器一般是優(yōu)選的但非必須優(yōu)選的。 合適的多劑量形式包括但不限于2-10劑量/容器，0. l_2mL/劑量。在某些實(shí)施方案中，所述劑量為0. 5mL劑量。參見，例如，國際專利申請W02007/127668，其援引加入本文。組合物可以存在于小瓶或其他合適的儲存容器中，或者可以存在于預(yù)灌裝的遞送裝置中，例如，單一組分或多組分注射器，其可以帶或不帶針頭供應(yīng)。雖然也設(shè)想多劑量、預(yù)灌裝注射器，但是注射器通常但不必須含有單劑量的本發(fā)明的含有防腐劑的免疫原性組合物。同樣地，小瓶可以包括單劑量，但是可替代地包括多劑量。有效劑量體積可以常規(guī)建立，但是注射用組合物的一般劑量具有0. 5mL的體積。 在某些實(shí)施方案中，將所述劑量配制為施用于人類對象。在某些實(shí)施方案中，將所述劑量配制為施用于成年、青年(teen)、少年(adolescent)、幼兒或嬰兒(即，不超過一歲)人類對象，并且在優(yōu)選實(shí)施方案中可以通過注射施用。本發(fā)明的液體免疫原性組合物還適合重建以凍干形式存在的其他免疫原性組合物。當(dāng)免疫原性組合物用于這種即時重建時，本發(fā)明提供試劑盒，其具有兩個或更多個小瓶，兩個或更多個已灌裝的注射器，或者每種一個或多個，所述注射器的內(nèi)容物用來在注射之前重建所述小瓶的內(nèi)容物，或者反之亦然?；蛘撸景l(fā)明的免疫原性組合物可以凍干和重建，例如，利用本領(lǐng)域公知的用于凍干的多種方法中的一種以形成干燥、規(guī)則形狀(例如，球形)的顆粒，例如微顆粒或微球體， 其具有諸如平均直徑大小的顆粒特征，所述平均直徑大小可以通過改變用于制備它們的確切方法來選擇和控制。所述免疫原性組合物可以進(jìn)一步包含佐劑，其可以任選與單獨(dú)的干燥、規(guī)則形狀(例如，球形)的顆粒(例如，微顆?；蛭⑶蝮w)制備，或者包含在單獨(dú)的干燥、 規(guī)則形狀(例如，球形)的顆粒(例如，微顆粒或微球體)中。在這類實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供免疫原性組合物試劑盒，其包含第一組分和第二組分，所述第一組分包括穩(wěn)定的干燥免疫原性組合物，任選進(jìn)一步包含本發(fā)明的一種或多種防腐劑，所述第二組分包含用于重建所述第一組分的無菌的水溶液。在某些實(shí)施方案中，所述水溶液包含一種或多種防腐劑，并且可以任選包含至少一種佐劑(參見，例如，W02009/109550 (援引加入本文)。在另一實(shí)施方案中，多劑量形式的容器選自由以下容器組成的組中的一種或多種，但是不限于一般實(shí)驗(yàn)室玻璃器皿、瓶、燒杯、量筒、發(fā)酵罐、生物反應(yīng)器、管(tubing)、管 (pipe)、袋、罐、小瓶、小瓶塞(例如，膠塞、螺帽)、安瓿、注射器、雙室或多室注射器、注射器塞、注射器柱塞、橡皮塞、塑料瓶蓋、玻璃瓶塞、藥筒和一次性筆等。本發(fā)明的容器不受制造材料限制，并且包括諸如玻璃、金屬(例如，鋼、不銹鋼、鋁等)和聚合物(例如，熱塑性塑料、彈性體、熱塑性塑料-彈性體)的材料。在特定實(shí)施方案中，所述形式的容器是具有丁基瓶塞的5mL Schott I型玻璃小瓶。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解上文所示的形式并不是詳盡的清單，而僅僅作為對技術(shù)人員的關(guān)于本發(fā)明可用的各種形式的指導(dǎo)?？紤]用于本發(fā)明的其他形式可以在來自諸如United States Plastic Corp. (Lima, OH), VWR的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備供應(yīng)商和制造商的出版的產(chǎn)品目錄中找到。制備免疫原性綴合物的方法本發(fā)明還包括制備本文所述的免疫原性綴合物的方法。制備本發(fā)明的免疫原性綴合物的方法包括利用綴合化學(xué)將所述莢膜多糖與所述載體蛋白共價綴合，所述綴合化學(xué)包括CDI (I, I-羰基二咪唑)、CDT(1,1-羰基-二 -I，2，4-三唑)或PDPH(3-(2-吡啶二硫代)_丙酰肼)。相應(yīng)地，本發(fā)明的一實(shí)施方案提供制備包含綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖的免疫原性綴合物的基于CDT的方法，所述方法包括以下步驟a)使金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖與咪唑或三唑復(fù)合以產(chǎn)生復(fù)合多糖；b)使所述多糖與 ⑶T在有機(jī)溶劑和約0. 1% -約0. 3% w/v水中反應(yīng)以產(chǎn)生活化的血清型5或8莢膜多糖； c)純化所述活化的血清型5或8莢膜多糖以產(chǎn)生純化的活化的血清型5或8莢膜多糖；d) 使所述純化的活化的血清型5或8莢膜多糖與載體蛋白在有機(jī)溶劑中反應(yīng)以產(chǎn)生血清型5 或8莢膜多糖載體蛋白綴合物；以及e)水解所述血清型5或8莢膜多糖載體蛋白綴合物以去除未反應(yīng)的活化基團(tuán)；從而產(chǎn)生包含綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5或 8莢膜多糖的免疫原性綴合物。在一實(shí)施方案中，在步驟(d)之前，將所述純化的活化的血清型5或8莢膜多糖與載體蛋白復(fù)合。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，提供制備包含綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖的免疫原性綴合物的另一基于CDT的方法，所述方法包括以下步驟a)將金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖與咪唑或三唑復(fù)合以產(chǎn)生復(fù)合多糖；b)使所述復(fù)合多糖與⑶T在有機(jī)溶劑和約0. 1% -約0. 3% w/v水中反應(yīng)以產(chǎn)生活化的血清型5或8莢膜多糖；c)使所述活化的血清型5或8莢膜多糖與載體蛋白在有機(jī)溶劑中反應(yīng)以產(chǎn)生血清型5或8莢膜多糖載體蛋白綴合物；以及d)水解所述血清型5或8莢膜多糖載體蛋白綴合物以去除未反應(yīng)的活化基團(tuán)；從而產(chǎn)生包含綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型 5或8莢膜多糖的免疫原性綴合物。在一實(shí)施方案中，制備免疫原性綴合物的基于CDT的方法內(nèi)的有機(jī)溶劑是極性非質(zhì)子溶劑。在一實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑是選自二甲基亞砜(DMS0)、二甲基甲酰胺 (DMF)、二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮 和六甲基磷酰胺(HMPA)的極性非質(zhì)子溶劑。在一實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑是DMS0。在一實(shí)施方案中，制備免疫原性綴合物的基于CDT的方法內(nèi)的使所述復(fù)合多糖與 CDT反應(yīng)的步驟包括提供與所述多糖相比約20倍摩爾過量的CDT。在一實(shí)施方案中，制備免疫原性綴合物的基于CDT的方法內(nèi)的純化所述活化的血清型5或8莢膜多糖的步驟包括滲濾。在一實(shí)施方案中，制備免疫原性綴合物的基于CDT的方法內(nèi)的載體蛋白是CRM197。 在一實(shí)施方案中，使制備免疫原性綴合物的方法內(nèi)的活化的血清型5或8莢膜多糖與所述 CRM197以約I : I的重量比反應(yīng)。在一實(shí)施方案中，制備免疫原性綴合物的基于CDT的方法內(nèi)的水解所述血清型5 或8多糖載體蛋白綴合物以去除未反應(yīng)的活化基團(tuán)的步驟包括稀釋入緩沖液，并且在約 200C -約26°C下維持約8. 8-約9. 2的pH至少4小時。在一實(shí)施方案中，水解所述血清型 5或8莢膜多糖載體蛋白綴合物的步驟包括稀釋入緩沖液，并且在約23°C下維持約9.0 的pH至少4小時。在一實(shí)施方案中，將根據(jù)制備免疫原性綴合物的基于CDT的方法制備的血清型5 或8莢膜多糖載體蛋白綴合物純化。在一實(shí)施方案中，所述血清型5或8莢膜多糖載體蛋白綴合物的純化包括滲濾。在一實(shí)施方案中，在制備免疫原性綴合物的基于CDT的方法內(nèi)使所述復(fù)合多糖與 CDT反應(yīng)之前，將所述復(fù)合血清型5或8多糖凍干并重懸。在一實(shí)施方案中，在使所述復(fù)合多糖與⑶T反應(yīng)之前，將所述復(fù)合多糖和所述載體蛋白分別凍干和重懸。在一實(shí)施方案中， 將凍干的復(fù)合多糖和/或凍干的載體蛋白重懸在有機(jī)溶劑中。在一實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑是DMSO。在一實(shí)施方案中，在制備免疫原性綴合物的基于CDT的方法內(nèi)使所述活化的復(fù)合血清型5或8莢膜多糖與載體蛋白反應(yīng)之前，將所述純化的活化的血清型5或8莢膜多糖和所述載體蛋白分別凍干和重懸。在一實(shí)施方案中，所述載體蛋白是CRM197,并且在凍干之前將所述CRM197對NaCl滲濾。在一實(shí)施方案中，凍干之前，將所述CRM197對NaCl滲濾，并且將NaCl/CRM的w/w比例調(diào)整至約0. 5-約I. 5。本發(fā)明的一實(shí)施方案提供制備包含綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5 或8莢膜多糖的免疫原性綴合物的基于TOPH的方法，所述方法包括以下步驟a)使金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖與TOPH和碳二亞胺在有機(jī)溶劑中反應(yīng)以產(chǎn)生I3DPH連接的多糖；b)使所述roPH連接的多糖與還原劑反應(yīng)以產(chǎn)生活化的多糖；c)純化所述活化的血清型5或8莢膜多糖以產(chǎn)生純化的活化的血清型5或8莢膜多糖；d)使載體蛋白與溴乙酸在有機(jī)溶劑中反應(yīng)以產(chǎn)生活化的載體蛋白；e)純化所述活化的載體蛋白以產(chǎn)生純化的活化的載體蛋白；f)使所述純化的活化的血清型5或8莢膜多糖與所述純化的活化的載體蛋白反應(yīng)以產(chǎn)生血清型5或8莢膜多糖載體蛋白綴合物；以及g)水解所述血清型5或8莢膜多糖載體蛋白綴合物以去除未反應(yīng)的活化基團(tuán)；從而產(chǎn)生包含綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5或8莢膜多糖的免疫原性綴合物。在一實(shí)施方案中，在制備免疫原性綴合物的基于I3DPH的方法內(nèi)使用的溴乙酸是溴乙酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯(BAANS)。在一實(shí)施方案中，在本發(fā)明的基于TOPH的方法內(nèi)使用的載體蛋白是CRM197， 并且以約I : 0.1-約I : 0.5的CRM197 BAANS重量比加入所述BAANS。在一實(shí)施方案中，制備免疫原性綴合物的基于I3DPH的方法內(nèi)的有機(jī)溶劑是極性非質(zhì)子溶劑。在一實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑是選自DMSO、DMF、二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮和HMPA的極性非質(zhì)子溶劑。在一實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑是DMS0。在一實(shí)施方案中，在制備免疫原性綴合物的基于I3DPH的方法內(nèi)使用的碳二亞胺是I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDAC)。在一實(shí)施方案中，使所述血清型5或8莢膜多糖與TOPH和EDAC在有機(jī)溶劑中反應(yīng)的步驟包括維持約I : 5 : 3的多糖PDPH EDAC重量比。在一實(shí)施方案中，在制備免疫原性綴合物的基于I3DPH的方法內(nèi)使用的還原劑是二硫蘇糖醇(DTT)。在一實(shí)施方案中，制備免疫原性綴合物的基于I3DPH的方法內(nèi)的純化所述活化的血清型5或8莢膜多糖和純化所述載體蛋白的步驟各自包括滲濾。在一實(shí)施方案中，制備免疫原性綴合物的基于I3DPH的方法內(nèi)的載體蛋白是 CRM197。在一實(shí)施方案中，使制備免疫原性綴合物的方法內(nèi)的活化的血清型5或8多糖與所述CRM197以約I : I的重量比反應(yīng)。在一實(shí)施方案中，制備免疫原性綴合物的基于PDPH的方法內(nèi)的水解所述血清型5 或8多糖載體蛋白綴合物以去除未反應(yīng)的活化基團(tuán)的步驟包括添加半胱胺鹽酸鹽。在一實(shí)施方案中，將根據(jù)制備免疫原性綴合物的基于PDPH的方法制備的血清型5 或8莢膜多糖載體蛋白綴合純化。在一實(shí)施方案中，所述血清型5或8莢膜多糖載體蛋白綴合物的純化包括滲濾。在一實(shí)施方案中，在制備免疫原性綴合物的基于I3DPH的方法內(nèi)使所述純化的活化的血清型5或8莢膜多糖與所述純化的活化的載體蛋白反應(yīng)之前，將所述分離的活化的多糖和所述純化的活化的載體蛋白分別凍干和重懸。在一實(shí)施方案中，將凍干的活化的多糖和/或凍干的活化的載體蛋白重懸在有機(jī)溶劑中。在一實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑是 DMSO。在本文中使用時，“凍干”表示脫水過程，其中將細(xì)菌莢膜多糖冷凍，同時在存在足夠熱量的情況下降低周圍壓力以允許冷凍水從固相直接升華至氣相?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的用于凍干多糖的任何方法。參見，例如，Harris & Angal (1989) " Protein Purification Methods, " In Kennedy & Cabral, eds. " Recovery Processes for BiologicalMaterials" (John Wiley & Sons ; 1993);美國專利第4，134，214號；以及國際專利申請公開第WO 2003/086471號；每個整體援引加入本文。任選地，凍干期間可以包括冷凍保護(hù)劑， 例如蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、山梨醇或甘露醇。在本文中使用時，“活化(activate) ”和“活化(activation) ”表示以這樣的方式修飾細(xì)菌莢膜多糖或載體蛋白，使其適合綴合(即，必須使至少一個部分能夠共價結(jié)合至載體分子)。例如，對于本發(fā)明的基于CDT的綴合方法，將所述多糖在低濕度環(huán)境中(例如，在DMSO中)活化以形成具有可用的羥基的三唑氨基甲酸酯部分和具有羧酸的酰基三唑部分。然后可以使活化的多糖與CRM197蛋白反應(yīng)，這導(dǎo)致三唑被CRM197內(nèi)的賴氨酸殘基親核置換，并且形成氨基甲酸酯鍵(活化的羥基)和酰胺鍵(活化的羧酸)。相比之下，對于本發(fā)明的基于TOPH的綴合方法，在綴合之前將所述載體蛋白和所述多糖活化1)CRM197的活化包括通過使胺基與溴乙酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)來將溴乙?；胨鯟RM197 蛋白；以及2) 多糖的活化包括將所述多糖中碳二亞胺活化的N-乙酰甘露糖氨基糖醛酸 (N-acetylmannosaminouronic acid)的羧酸酯基團(tuán)偶聯(lián)至巰基反應(yīng)性的酰肼異型雙功能接頭H)PH的酰肼基團(tuán)，然后用DTT還原。然后可以使活化的多糖與活化的載體蛋白反應(yīng)， 從而PDPH-硫醇化多糖的巰基與活化的載體蛋白的溴乙?；磻?yīng)，導(dǎo)致通過溴置換形成共價硫醚鍵。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以純化莢膜多糖、載體蛋白和/或多糖-蛋白綴合物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的用于純化多糖或蛋白的任何方法，如濃縮/滲濾、沉淀/洗脫、柱層析和深層過濾。參見，例如，F(xiàn)arr6s et al. (1996)Biotechnol. Tech. 10 :375-380 ;Gon9alves et al. In Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology(Antonio Mendez Vilas, ed. 1st ed. Badajoz, Espanha :Formatex ； 2007. pp. 450-457) ；Tanizaki et al. (1996) J. Microbiol. Methods 27 :19-23 ;以及美國專利第6，146, 902號；以及美國專利申請公開第2008/0286838號；每個整體援引加入本文。在本文中使用時，術(shù)語“分離的”或“純化的”表示物質(zhì)被從其原來的環(huán)境移出(例如，如果其是天然存在的，自然環(huán)境，或者如果其是重組實(shí)體，從其宿主生物，或者從一個環(huán)境移至不同環(huán)境)。例如，分離的多糖、肽或蛋白基本上不含來自細(xì)胞或組織來源的細(xì)胞物質(zhì)或其他污染蛋白，所述蛋白來源于所述細(xì)胞或組織來源，或者基本上不含化學(xué)合成時或以其他方式存在于作為化學(xué)反應(yīng)的部分的混合物中的化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)。在本發(fā)明中，所述蛋白或多糖可以分離自細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞碎片，從而以有益于制備免疫原性組合物的方式提供它們。術(shù)語“分離的(isolated)”或“分離(isolating) ”可以包括純化 (purifying)或純化(purification),包括例如,如本文所述的純化所述莢膜多糖的方法。 語言“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括多糖/多肽/蛋白制品，其中所述多糖/多肽/蛋白分離自細(xì)胞的細(xì)胞組分，所述多糖/多肽/蛋白從所述細(xì)胞分離或重組產(chǎn)生。因此，基本上不含細(xì)胞物質(zhì)或其他化合物的多肽/蛋白、多糖或綴合物包括含有少于約30%、20%、10%、 5%、2.5%或1% (干重)的污染蛋白、多糖或其他化合物的多肽/蛋白、多糖或綴合物制品。當(dāng)所述多肽/蛋白是重組產(chǎn)生的時，其還優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基占少于約
或1%的蛋白制品體積。當(dāng)多肽/蛋白或多糖是通過化學(xué)合成產(chǎn)生的時，其優(yōu)選基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)，即，其與所述蛋白或多糖合成所涉及的化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)分開。相應(yīng)地，這類多肽/蛋白或多糖制品含有少于約30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%或1% (干重)的除所關(guān)注的多肽/蛋白或多糖片段之外的化學(xué)前體或化合物。
可以將通過本文所述的任何方法制備的免疫原性綴合物儲存在水或低離子強(qiáng)度中性PH緩沖液中，或者凍干為干粉。誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和防范金黃色葡萄球菌感染的方法本發(fā)明還包括使用本文所述的免疫原性組合物的方法。例如，本發(fā)明的一實(shí)施方案提供誘導(dǎo)針對金黃色葡萄球菌的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯妹庖咴粤康娜魏伪疚乃龅拿庖咴越M合物。本發(fā)明的一實(shí)施方案提供保護(hù)對象免受金黃色葡萄球菌感染的方法，或者預(yù)防感染金黃色葡萄球菌的方法，或者降低與金黃色葡萄球菌所引起的感染相關(guān)的至少一種癥狀的嚴(yán)重程度或延遲與金黃色葡萄球菌所引起的感染相關(guān)的至少一種癥狀的發(fā)生的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯妹庖咴粤康娜魏伪疚乃龅拿庖咴越M合物。本發(fā)明的一實(shí)施方案提供治療或預(yù)防對象中葡萄球菌感染、與葡萄球菌 (Staphylococcus sp.)相關(guān)的疾病或疾病狀況的方法,所述方法包括向所述對象施用治療或預(yù)防有效量的本文所述的免疫原性組合物的步驟。在一些實(shí)施方案中，治療或預(yù)防葡萄球菌感染、疾病或疾病狀況的方法包括人、獸醫(yī)、動物或農(nóng)業(yè)治療。另一實(shí)施方案提供治療或預(yù)防對象中的葡萄球菌感染、與葡萄球菌相關(guān)的疾病或疾病狀況的方法，所述方法包括從本文所述的免疫原性組合物產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體制品，并且利用所述抗體制品賦予所述對象被動免疫。本發(fā)明的一實(shí)施方案提供預(yù)防接受外科手術(shù)的對象中的葡萄球菌感染的方法，所述方法包括在所述外科手術(shù)之前向所述對象施用預(yù)防有效量的本文所述的免疫原性組合物的步驟。對抗原或免疫原性組合物的“免疫應(yīng)答”是對象中針對存在于所關(guān)注的抗原或疫苗組合物中的分子的體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的發(fā)展。為了本發(fā)明的目的，“體液免疫應(yīng)答”是抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并且包括誘導(dǎo)和產(chǎn)生識別并親和性結(jié)合本發(fā)明的免疫原性組合物中的抗原的抗體，而“細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答”是T-細(xì)胞和/或其他白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答?！凹?xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答”是由與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的I類分子或II 類分子、CDl或者其他非經(jīng)典MHC樣分子相關(guān)的抗原表位的呈遞激發(fā)的。這激活抗原特異性⑶4+T輔助細(xì)胞或⑶8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞("CTL" )。CTL對與經(jīng)典或非經(jīng)典MHC 編碼并在細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白聯(lián)合呈遞的肽抗原具有特異性。CTL輔助誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)消滅細(xì)胞內(nèi)微生物，或者裂解感染這類微生物的細(xì)胞。細(xì)胞免疫的另一方面包括輔助 T-細(xì)胞的抗原特異性反應(yīng)。輔助T-細(xì)胞輔助刺激功能，并且集中于非特異性效應(yīng)細(xì)胞針對在細(xì)胞表面上與經(jīng)典或非經(jīng)典MHC分子聯(lián)合展示肽或其他抗原的細(xì)胞的活性?！凹?xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答”還指產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子以及活化的T-細(xì)胞和/或其他白細(xì)胞所產(chǎn)生的其他這類分子，包括來源于CD4+和CD8+T-細(xì)胞的分子。特定抗原或組合物刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力可以通過許多測定來確定，例如通過淋巴細(xì)胞增殖(淋巴細(xì)胞活化) 測定、CTL細(xì)胞毒性細(xì)胞測定，通過測定敏化對象中所述抗原的特異性T-淋巴細(xì)胞，或者通過測量對抗原重新刺激反應(yīng)的T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。這類測定是本領(lǐng)域公知的。參見，例如，Erickson et al. (1993) J. Tmmuno1. 151 :4189-4199 ;和 Doe et al. (1994)Eur. J. Immunol. 24 :2369_2376。在本文中使用時，“治療(treatment) ” (包括其變體，例如，“治療(treat) ”或“治療(treated)”)表示以下的任何一種或多種(i)如在傳統(tǒng)疫苗中，預(yù)防感染或再感染，
(ii)降低癥狀的嚴(yán)重程度，或者消除癥狀，以及(iii)基本上或完全消除有問題的病原體或病癥。因此，可以預(yù)防性(感染之前)或治療性(感染之后)地實(shí)現(xiàn)治療。在本發(fā)明中， 預(yù)防性治療是優(yōu)選模式。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，提供組合物和方法，其針對微生物感染(例如細(xì)菌，如葡萄球菌)治療宿主動物，包括預(yù)防性和/或治療性免疫。本發(fā)明的方法有益于賦予對象預(yù)防性和/或治療性免疫。本發(fā)明的方法還可以施用于生物醫(yī)學(xué)研究應(yīng)用的對象。在本文中使用時，“哺乳動物”表示人或非人動物。更特別地，哺乳動物指歸類為哺乳動物的任何動物，包括人，家畜和農(nóng)場動物，以及動物園、運(yùn)動和寵物伴侶動物，如家庭寵物，以及其他馴化動物，包括但不限于牛、綿羊、雪貂、豬、馬、兔、山羊、犬、貓等。優(yōu)選伴侶動物為犬和貓。優(yōu)選地，所述哺乳動物為人。 在本文中可交換使用的“免疫原性量”和“免疫學(xué)有效量”指如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)測定所測量的，足以引起免疫應(yīng)答的抗原或免疫原性組合物的量，所述免疫應(yīng)答為細(xì)胞(T-細(xì)胞)或體液(B-細(xì)胞或抗體)應(yīng)答。組合物中特定綴合物的量一般基于對所述綴合物綴合和非綴合的總多糖來計算。 例如，含有20%游離多糖的CP5綴合物在IOOmcg CP5多糖劑量中會含有約80mcg綴合的 CP5多糖和約20mcg非綴合的CP5多糖。在計算綴合物的劑量時通常不考慮蛋白對所述綴合物的貢獻(xiàn)。綴合物的量可以根據(jù)葡萄球菌血清型變化。通常，每個劑量會包含0. Ol-IOOmcg 多糖，特別地0. 1-lOmcg，并且更特別地1-lOmcg。所述免疫原性組合物中不同多糖組分的 “免疫原性量”可以不同，并且各自可以包含lmcg、2mcg、3mcg、4mcg、5mcg、6mcg、7mcg、8mcg、 9mcg、lOmcg、15mcg、20mcg、30mcg、40mcg、50mcg、60mcg、70mcg、80mcg、90mcg 或者約 IOOmcg 的任何特定多糖抗原。金黃色葡萄球菌“侵襲性疾病”是從正常無菌的部位分離細(xì)菌，其中有相關(guān)的疾病的臨床體征/癥狀。正常無菌的身體部位包括血液、CSF、胸膜液、心包液、腹膜液、關(guān)節(jié)/滑液、骨、內(nèi)部身體部位(淋巴結(jié)、腦、心臟、肝、脾、玻璃體液、腎、胰、卵巢)或者其他正常無菌的部位。特征為侵襲性疾病的臨床疾病狀況包括菌血癥、肺炎、蜂窩組織炎、骨髓炎、心內(nèi)膜炎、敗血性休克等。抗原作為免疫原的有效性可以通過增殖測定，通過細(xì)胞溶解測定(如鉻釋放測定以測量T細(xì)胞裂解其特異性靶細(xì)胞的能力)，或者通過測量B-細(xì)胞活性水平(通過測量血清中所述抗原的特異性循環(huán)抗體的水平來測量B-細(xì)胞活性水平)來測量。如本文所述，免疫應(yīng)答還可以通過測量施用所述抗原之后誘導(dǎo)的抗原特異性抗體的血清水平來檢測，并且更特別地，通過測量這樣誘導(dǎo)的抗體增強(qiáng)特定白細(xì)胞的調(diào)理吞噬能力的能力。所述免疫應(yīng)答的保護(hù)水平可以通過用已施用的抗原攻擊免疫的宿主來測量。例如，如果期望免疫應(yīng)答的抗原是細(xì)菌，免疫原性量的抗原所誘導(dǎo)的保護(hù)水平可以通過檢測用所述細(xì)菌細(xì)胞攻擊動物之后的存活百分比或死亡百分比來測量。在一實(shí)施方案中，保護(hù)量可以通過測量與細(xì)菌感染相關(guān)的至少一種癥狀來測量，例如，與感染相關(guān)的發(fā)熱。多抗原或多組分疫苗或免疫原性組合物中每種抗原的量會相對于每種其他組分變化，并且可以通過技術(shù)人員已知的方法來確定。這類方法包括測量免疫原性和/或體內(nèi)效力的方法。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語 “約”表示在20%內(nèi)，優(yōu)選在10%內(nèi)，并且更優(yōu)選在5%內(nèi)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供抗體和抗體組合物，其特異性和選擇性結(jié)合至本發(fā)明的血清型 5或8莢膜多糖或者免疫原性綴合物。在一些實(shí)施方案中，在向?qū)ο笫┯帽景l(fā)明的血清型5 或8莢膜多糖或者免疫原性綴合物時產(chǎn)生抗體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供針對本發(fā)明的血清型5或8莢膜多糖或者免疫原性綴合物中的一種或多種的純化或分離的抗體。在一些實(shí)施方案中，如通過在動物效力模型中殺死細(xì)菌或通過調(diào)理吞噬殺死測定所測量的， 本發(fā)明的抗體是有功能的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體賦予對象被動免疫。本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼本發(fā)明的抗體或抗體片段的多核苷酸，以及利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的抗體或抗體組合物的細(xì)胞、細(xì)胞系(例如雜交瘤細(xì)胞或者用于重組產(chǎn)生抗體的其他工程細(xì)胞系)或轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明的抗體或抗體組合物可以用于治療或預(yù)防與對象中的葡萄球菌感染、葡萄球菌相關(guān)的疾病或疾病狀況，所述方法包括產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體制品，并且利用所述抗體或抗體組合物賦予所述對象被動免疫。本發(fā)明的抗體還可以用于診斷方法，例如，檢測 CP5、CP8或其綴合物的存在或者定量CP5、CP8或其綴合物的水平。本領(lǐng)域已知的幾種動物模型可以用來評價本文所述的免疫原性組合物中的任何一種的效力。例如被動小鼠敗血癥模型:將小鼠用免疫IgG或單克隆抗體腹腔內(nèi)(i. p.)被動免疫。 24小時后將小鼠用致死劑量的金黃色葡萄球菌攻擊。靜脈內(nèi)(i.v.或i.p.)施用細(xì)菌攻擊，確保任何存活均可以歸因于抗體與細(xì)菌的特異性體內(nèi)相互作用。細(xì)菌攻擊劑量確定為達(dá)到約20%未免疫的對照小鼠的致死敗血癥所需的劑量。存活研究的統(tǒng)計評價可以通過 Kaplan-Meier分析來進(jìn)行。主動免疫和攻擊模型在這個模型中，將小鼠在第0、3和6周(或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的相似的時間表)用靶抗原皮下(s. c.)主動免疫，并且在第8周(或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他相似的時間表)通過靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)途徑用金黃色葡萄球菌攻擊。細(xì)菌攻擊劑量標(biāo)定為在14天的時間內(nèi)于對照組中達(dá)到約20%存活。存活研究的統(tǒng)計評價可以通過Kaplan-Meier分析來進(jìn)行。被動感染性心內(nèi)膜炎模型金黃色葡萄球菌所引起的感染性心內(nèi)膜炎(IE)的被動免疫模型先前已用來顯示ClfA可以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。參見，Vernachio et al. (2006) Antmicro. Agents & Chemo. 50 :511_518。在IE的這個模型中，兔或大鼠用來模擬臨床感染，包括中心靜脈導(dǎo)管、菌血癥以及血行接種(hematogenous seeding)至遠(yuǎn)端器官。向具有無菌的主動脈瓣贅生物的插入導(dǎo)管的兔或大鼠施用對靶抗原特異性的單克隆或多克隆抗體的單個靜脈內(nèi)注射。24小時后，將動物用異源葡萄球菌菌株或MRSA菌株i.v.攻擊。 然后，攻擊后48小時，將心臟贅生物、腎和血液收獲并培養(yǎng)。然后測量賁門瓣贅生物、腎和血液中葡萄球菌感染的頻率。在一研究中，當(dāng)用MRSE ATCC 35984或MRSA PFESA0003攻擊動物時，利用ClfA的多克隆抗體制品或單克隆抗體顯示出感染率的顯著減少。參見上文的 Vernachio et al.。被動感染性心內(nèi)膜炎模型還使感染性心內(nèi)膜炎模型適合主動免疫研究。將兔或大鼠用靶抗原肌肉內(nèi)(i.m.)免疫，并且2周后通過i.v.途徑用金黃色葡萄球菌攻擊。
置孟置炎撞型:在腎盂腎炎模型中，將小鼠在第0、3和6周(或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的相似的時間表)用靶抗原免疫。在第8周，通過例如i.p.注射例如1.7x 108cfu金黃色葡萄球菌PFESA0266來攻擊動物。48小時后，將腎和/或其他組織收獲并培養(yǎng)。最后， 在腎和/或組織中計數(shù)攻擊細(xì)菌的菌落形成單位。這個模型評價動物中的全身性散布。利用調(diào)理吞噬殺死測定監(jiān)測功能抗體
來自細(xì)胞系(例如HL60)或多形核細(xì)胞(PMN)的分化的效應(yīng)細(xì)胞可以用于本測定，所述多形核細(xì)胞(PMN)是利用LYMPHOLYTE -聚溶液(Cedarlane laboratories limited, Ontario, Canada)按照制造商的方案從供體人體血液分離的。將效應(yīng)細(xì)胞以約 2X107個細(xì)胞/ml的濃度重懸于測定緩沖液(含有I %牛血清白蛋白的改良伊格爾培養(yǎng)基) 中，并且放置在37 °C培養(yǎng)箱中直至準(zhǔn)備使用。使金黃色葡萄球菌菌株P(guān)FESA0266在胰胨豆胨瓊脂平板上生長過夜。將細(xì)菌細(xì)胞刮下，洗滌2次并重懸于含有5%甘油的測定緩沖液中至0D_ = 1，這等于約5X108cfu/ml的濃度。將Iml等分的細(xì)菌懸浮液冷凍并儲存在_40°C 下直至準(zhǔn)備使用。將冷凍的細(xì)菌懸浮液解凍，在測定緩沖液中調(diào)整至106CfU/ml的濃度并放置在冰上。利用無菌的96深孔Iml聚丙烯板進(jìn)行測定。制備2倍連續(xù)稀釋的抗體樣品 (50 u I)，然后將300 u I測定緩沖液加入抗體混合物。將細(xì)菌加入(50 u I)板，并且在4°C 下放置于旋轉(zhuǎn)振蕩器上30分鐘。調(diào)理步驟之后加入50 Ul人補(bǔ)體(I %終濃度)。最后，將 50 u I效應(yīng)細(xì)胞(IO7個細(xì)胞/ml的濃度)加入板，并且通過反復(fù)吹打?qū)腋∫夯旌暇鶆?。?50ul等分的懸浮液在無菌的I %皂苷溶液中10倍連續(xù)稀釋，渦旋以最小化細(xì)菌聚集，并且一式兩份平板接種在胰胨豆胨瓊脂上。將測定板在37°C下孵育I小時，利用電轉(zhuǎn)烤肉架風(fēng)格搖床連續(xù)混合。孵育結(jié)束時，將50iU等分的懸浮液在無菌的I %皂苷溶液中10倍連續(xù)稀釋，通過渦旋混合以最小化細(xì)菌聚集，并且一式兩份平板接種在胰胨豆胨瓊脂上。通過測定60分鐘時含有細(xì)菌、抗體、補(bǔ)體和效應(yīng)細(xì)胞的孔中存活的cfu的數(shù)量比缺少抗體但含有細(xì)菌、補(bǔ)體和效應(yīng)細(xì)胞的管中存活的cfu的數(shù)量的比例來計算百分比殺死。將含有細(xì)菌、補(bǔ)體和血清的對照包括在內(nèi)以便為歸因于聚集的cfu的任何減少調(diào)整。補(bǔ)體吸附對金黃色葡萄球菌菌株P(guān)FESA0266、PFESA0286和PFESA0270吸附的來自人供體的血清可以在測定中用作補(bǔ)體的來源。使金黃色葡萄球菌菌株在37°C下于TSA平板上生長過夜。將細(xì)胞從平板刮下并重懸在無菌的PBS中。將細(xì)菌細(xì)胞以10，OOOrpm在4°C下離心 10分鐘，并且將細(xì)胞沉淀重懸于人血清中用于吸附。將血清與細(xì)菌在4°C下于章動器上孵育30分鐘。將細(xì)胞離心，將血清轉(zhuǎn)移至含有細(xì)菌的另一管，并且將吸附步驟再次重復(fù)30分鐘。最后，將細(xì)胞離心，并且使血清通過0.2微米濾器，然后將0.5ml等分試樣在液氮中冷凍下來。方法II-利用HL-60細(xì)胞的OPA根據(jù)S. Romero-Steiner, et al. , Clin Diagn Lab TmmunoI 4(4)(1997), pp. 415-422使HL-60細(xì)胞分化。將收獲的HL-60細(xì)胞以約IO8個細(xì)胞/ml重懸于測定緩沖液(含有I %牛血清白蛋白的改良伊格爾培養(yǎng)基)中，并且放置在37°C培養(yǎng)箱中直至準(zhǔn)備使用。使金黃色葡萄球菌在胰胨豆胨瓊脂平板上生長過夜。將細(xì)菌細(xì)胞刮下，洗滌兩次并重懸于含有5%甘油的測定緩沖液中至0D_ = I，這等于約5X108cfu/ml。將Iml等分的細(xì)菌懸浮液冷凍并儲存在_40°C下直至準(zhǔn)備使用。將冷凍的細(xì)菌懸浮液解凍，在測定緩沖液中調(diào)整至106CfU/ml的濃度并放置在冰上。利用無菌的96深孔Iml聚丙烯板進(jìn)行測定。制備 2倍連續(xù)稀釋的單克隆抗體樣品(25 yl)，然后將150 Ul測定緩沖液加入抗體懸浮液。將細(xì)菌加入(25 yl)板，并且在4°C下放置于旋轉(zhuǎn)振蕩器上30分鐘，然后加入25 Ul人補(bǔ)體 (1%終濃度)。最后，將25iU HL-60細(xì)胞(IO7個細(xì)胞/ml)加入板，并且通過反復(fù)吹打?qū)腋∫夯旌暇鶆颉?5iU等分的懸浮液在無菌的I %皂苷溶液中10倍連續(xù)稀釋，通過渦旋混合以最小化細(xì)菌聚集，并且一式兩份平板接種在胰胨豆胨瓊脂上。將測定板在37°C下孵育I小時，利用電轉(zhuǎn)烤肉架風(fēng)格搖床連續(xù)混合。孵育結(jié)束時，將25 Ul等分的懸浮液在無菌的1%皂苷溶液中10倍連續(xù)稀釋，通過渦旋混合，并且一式兩份平板接種在胰胨豆胨瓊脂上。通過測定60分鐘時含有細(xì)菌、抗體、補(bǔ)體和HL-60細(xì)胞的孔中存活的cfu的數(shù)量比缺少抗體但含有細(xì)菌、補(bǔ)體和HL-60細(xì)胞的管中存活的cfu的數(shù)量的比例來計算百分比殺死。將含有細(xì)菌、補(bǔ)體和mAb的對照包括在內(nèi)以便為歸因于聚集的cfu的任何減少調(diào)整。以下實(shí)施例以說明方式而不是限制方式提供。
實(shí)施例 實(shí)施例I :金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖的制備。在這個實(shí)施例中，描述了各種大小范圍的金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖的制備。金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)如圖I所示。本文所述的方法在制備具有約20kDa-700kDa的分子量的血清型8莢膜多糖中是有效的。通過適當(dāng)選擇條件，可以分離和純化分子量范圍為50kDa-700kDa的高分子量血清型8莢膜多糖。為了用于免疫原性組合物，可以分離和純化分子量范圍為70kDa-300kDa和許多期望范圍的血清型8莢膜多糖?；谏L特征和所產(chǎn)生的莢膜的質(zhì)量，菌株P(guān)FESA0005或PFESA0286用于制備血清型8莢膜多糖。據(jù)證實(shí)分離自菌株P(guān)FESA0005或PFESA0286的莢膜是相同的。為了制備血清型8莢膜多糖，使所述菌株在主要由碳源(乳糖或蔗糖)、水解大豆粉(作為氮源)和痕量金屬組成的復(fù)雜培養(yǎng)基中生長。使所述菌株在生物反應(yīng)器中生長 2-5 天。高壓滅菌之前，取出樣品以檢測培養(yǎng)物中的葡萄球菌腸毒素B(SEB)水平。在 0. 05%聚山梨酯80存在的情況下，發(fā)酵液中SEB的濃度為15-20ng/ml。以前的實(shí)驗(yàn)顯示將培養(yǎng)物高壓滅菌I小時將SEB的水平降低至少于0. lng/ml，這低于TECRA試劑盒的檢測下限。如上文所述，將經(jīng)滲濾、乙醇分級分離的多糖裝上Q-瓊脂糖AEC柱，并且用線性梯度的NaCl洗脫。通過0-乙酰基測定、雙向免疫擴(kuò)散測試和磷酸鹽測定分析級分，其中0-乙酰基測定和雙向免疫擴(kuò)散測試用于檢測血清型5多糖的存在，磷酸鹽測定用于檢測磷壁酸 (TA)的存在。在級分35-95中檢測到血清型8多糖的存在(圖2A-B)。為了減少磷壁酸污染，將級分35-75集中，并且將任何殘余的磷壁酸用偏過碘酸鈉氧化以允許通過對diH20進(jìn)行3K滲濾來去除。用于制備綴合物的血清型8莢膜多糖的純化是通過兩種不同方法來進(jìn)行的，所述方法依靠升高的溫度和低PH以影響莢膜從細(xì)胞釋放并降低所述多糖的分子量。所得的分子量取決于水解步驟的時間、溫度和pH。利用表I所指定的技術(shù)進(jìn)行血清型8莢膜多糖的表征。表I :純化的金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖的表征測定。
權(quán)利要求
1.免疫原性多糖-蛋白綴合物，其包含分離的綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)血清型8莢膜多糖,其中 a)所述多糖具有20kDa_1000kDa的分子量。
2.權(quán)利要求I的免疫原性綴合物，其中所述免疫原性綴合物具有200kDa-5000kDa的分子量。
3.免疫原性多糖-蛋白綴合物，其包含分離的綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多糖，其中 a)所述多糖具有20kDa_1000kDa的分子量。
4.權(quán)利要求3的免疫原性綴合物，其中所述免疫原性綴合物具有200kDa-5000kDa的分子量。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的免疫原性綴合物，其中所述多糖具有70kDa-300kDa的分子量。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的免疫原性綴合物，其中所述綴合物具有500kDa-2500kDa的分子量。
7.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的免疫原性綴合物，其中所述多糖具有10-100%的O-乙酰化程度。
8.權(quán)利要求7的免疫原性綴合物，其中所述多糖具有50-100%的O-乙?；潭?。
9.權(quán)利要求7的免疫原性綴合物，其中所述多糖具有75-100%的O-乙?；潭取?br> 10.權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的免疫原性綴合物，其中所述免疫原性綴合物可以產(chǎn)生抗體，如通過在動物效力模型中殺死細(xì)菌或通過調(diào)理吞噬殺死測定所測量的，所述抗體是有功能的。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的免疫原性綴合物，其中所述載體蛋白為crm197。
12.權(quán)利要求11的免疫原性綴合物，其中所述CRM197通過氨基甲酸酯鍵、酰胺鍵或兩者共價連接至所述多糖。
13.權(quán)利要求11或12的免疫原性綴合物，其中綴合的賴氨酸比CRM197的摩爾比為約10 I-約 25 I。
14.權(quán)利要求13的免疫原性綴合物，其中在所述多糖的至少每5-10個糖重復(fù)單元存在至少一個CRM197和多糖之間的共價鍵。
15.權(quán)利要求13或14的免疫原性綴合物，其中在所述多糖的每5個糖重復(fù)單元存在至少一個CRM197和多糖之間的鍵。
16.權(quán)利要求11-15中任一項(xiàng)的免疫原性綴合物，其中所述CRM197包含5-22個共價連接至所述多糖的賴氨酸。
17.權(quán)利要求16的免疫原性綴合物，其中所述CRM197包含8-15個共價連接至所述多糖的賴氨酸。
18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的免疫原性綴合物，與5型或8型多糖的總量相比，其包含少于30%的游離5型或8型多糖。
19.權(quán)利要求18的免疫原性綴合物，與5型或8型多糖的總量相比，其包含少于20%的游離5型或8型多糖。
20.免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的免疫原性綴合物以及包含佐齊U、稀釋劑或載體中的至少一種。
21.權(quán)利要求20的免疫原性組合物，其中所述佐劑是基于鋁的佐劑。
22.權(quán)利要求21的免疫原性組合物，其中所述佐劑選自磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁。
23.權(quán)利要求21的免疫原性組合物，其中所述佐劑為磷酸鋁。
24.權(quán)利要求20-23中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，與5型或8型多糖的總量相比，其包含少于30%的游離5型或8型多糖。
25.權(quán)利要求24的免疫原性組合物，與5型或8型多糖的總量相比，其包含少于20%的游離5型或8型多糖。
26.一種誘導(dǎo)對象中對金黃色葡萄球菌血清型5或血清型8莢膜多糖綴合物的免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述對象施用免疫學(xué)有效量的權(quán)利要求20-25中任一項(xiàng)的免疫原性組合物。
27.一種產(chǎn)生包含分離的綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖的免疫原性多糖-蛋白綴合物的方法，所述方法包括以下步驟 a)使分離的金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖與羰基二三唑(CDT)在有機(jī)溶劑中反應(yīng)以產(chǎn)生活化的血清型8多糖；以及 b)使所述活化的血清型8多糖與載體蛋白在有機(jī)溶劑中反應(yīng)以產(chǎn)生血清型8多糖載體蛋白綴合物； 其中產(chǎn)生包含金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖-載體蛋白綴合物的免疫原性綴合物。
28.—種產(chǎn)生包含分離的綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多糖的免疫原性多糖-蛋白綴合物的方法，所述方法包括以下步驟 a)使分離的金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多糖與羰基二三唑(CDT)在有機(jī)溶劑中反應(yīng)以產(chǎn)生活化的血清型8多糖；以及 b)使所述活化的血清型5多糖與載體蛋白在有機(jī)溶劑中反應(yīng)以產(chǎn)生血清型5多糖載體蛋白綴合物； 其中產(chǎn)生包含金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多糖-載體蛋白綴合物的免疫原性綴合物。
29.權(quán)利要求27或28的方法，其進(jìn)一步包括 凍干所述分離的多糖；以及將所述凍干的多糖重懸于有機(jī)溶劑中。
30.權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)的方法，其中在與所述載體蛋白反應(yīng)之前將所述活化的分離的多糖從所述活化反應(yīng)。
31.權(quán)利要求30的方法，其中步驟b)包括 i)凍干所述分離的活化的分離的多糖以產(chǎn)生凍干的活化的分離的多糖； )凍干所述載體蛋白以產(chǎn)生凍干的載體蛋白；和 iii)將所述凍干的活化的分離的多糖和所述凍干的載體蛋白重懸于有機(jī)溶劑中以產(chǎn)生與載體蛋白混合的活化的分離的多糖。
32.權(quán)利要求27-31中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括將步驟b)的反應(yīng)混合物稀釋入緩沖液，并且在約20°C -約26°C下維持約8. 8-約9. 2的pH至少4小時。
33.權(quán)利要求27-31中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括將步驟b)的反應(yīng)混合物稀釋入緩沖液,并且在約23°C下維持約9. O的pH至少4小時。
34.權(quán)利要求27-33中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括分離所述金黃色葡萄球菌血清型莢膜多糖載體蛋白綴合物。
35.權(quán)利要求27-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述有機(jī)溶劑為極性非質(zhì)子溶劑。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述極性非質(zhì)子溶劑選自二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮和六甲基磷酰胺(HMPA)。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述有機(jī)溶劑為二甲基亞砜(DMSO)。
38.權(quán)利要求27和29-37中任一項(xiàng)的方法，其中使所述多糖與⑶T反應(yīng)的步驟包括測定存在于所述金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖中的水，并且在所述有機(jī)溶劑中將所述⑶T濃度調(diào)整至約I : I的⑶T :水的摩爾比。
39.權(quán)利要求27和29-38中任一項(xiàng)的方法，其中使所述多糖與⑶T反應(yīng)的步驟包括測定存在于所述金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖中的水，并且在所述有機(jī)溶劑中將所述⑶T濃度調(diào)整至約O. 5 I的⑶T 水的摩爾比。
40.權(quán)利要求27和29-38中任一項(xiàng)的方法，其中使所述多糖與⑶T反應(yīng)的步驟包括測定存在于所述金黃色葡萄球菌血清型莢膜8多糖中的水，并且在所述有機(jī)溶劑中將所述⑶T濃度調(diào)整至約O. 75 : I的⑶T 水的摩爾比。
41.權(quán)利要求28-37中任一項(xiàng)的方法，其中使所述血清型5多糖與CDT反應(yīng)的步驟包括提供與所述多糖相比約20倍摩爾過量的CDT。
42.權(quán)利要求28-37和41中任一項(xiàng)的方法，其中將有機(jī)溶劑混合物中的血清型5多糖CDT調(diào)整至水濃度為O. 1-0. 3%。
43.權(quán)利要求42的方法，其中將所述水濃度調(diào)整至O.2%。
44.權(quán)利要求29-43中任一項(xiàng)的方法，其中分離所述活化的血清型多糖的步驟包括滲濾。
45.權(quán)利要求27-44中任一項(xiàng)的方法，其中凍干之前將所述載體蛋白對NaCl滲濾，并且將NaCl/蛋白載體蛋白的w/w比例調(diào)整至約O. 5-約I. 5。
46.權(quán)利要求27-45中任一項(xiàng)的方法，其中所述載體蛋白為CRM197。
47.權(quán)利要求46的方法，其中使所述活化的血清型多糖與所述CRM197以約I: I的重量比反應(yīng)。
48.權(quán)利要求27-47中任一項(xiàng)的方法，其中在與CDT在有機(jī)溶劑中混合之前使所述分離的金黃色葡萄球菌血清型莢膜多糖與咪唑或三唑混合。
49.權(quán)利要求27-48中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括水解所述血清型多糖-載體蛋白綴合物以去除未反應(yīng)的活化基團(tuán)。
50.一種制備包含分離的綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖的免疫原性綴合物的方法，所述方法包括以下步驟 a)使金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖與3-(2-吡啶二硫代)-丙酰肼(PDPH)和碳二亞胺在有機(jī)溶劑中反應(yīng)以產(chǎn)生I3DPH連接的多糖； b)使所述I3DPH連接的多糖與還原劑反應(yīng)以產(chǎn)生活化的多糖； c)分離所述活化的血清型8多糖以產(chǎn)生分離的活化的血清型8多糖； d)提供活化的載體蛋白；e)使所述分離的活化的血清型8多糖與所述活化的載體蛋白反應(yīng)以產(chǎn)生血清型8多糖-載體蛋白綴合物；從而產(chǎn)生包含分離的綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型8莢膜多糖的免疫原性綴合物。
51.一種制備包含分離的綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多糖的免疫原性綴合物的方法，所述方法包括以下步驟 a)使金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多糖與3-(2-吡啶二硫代)-丙酰肼(PDPH)和碳二亞胺在有機(jī)溶劑中反應(yīng)以產(chǎn)生I3DPH連接的多糖； b)使所述I3DPH連接的多糖與還原劑反應(yīng)以產(chǎn)生活化的多糖； c)分離所述活化的血清型5多糖以產(chǎn)生分離的活化的血清型5多糖； d)提供活化的載體蛋白； e)使所述分離的活化的血清型5多糖與所述活化的載體蛋白反應(yīng)以產(chǎn)生血清型5多糖-載體蛋白綴合物；從而產(chǎn)生包含分離的綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5莢膜多糖的免疫原性綴合物。
52.權(quán)利要求50或51的方法，其中在使所述活化的載體蛋白與所述活化的多糖反應(yīng)之前分離所述活化的載體蛋白。
53.權(quán)利要求50-52中任一項(xiàng)的方法，其中 步驟c)進(jìn)一步包括凍干所述分離的活化的血清型8多糖以產(chǎn)生凍干的活化的血清型多糖。
54.權(quán)利要求50-53中任一項(xiàng)的方法，其中所述有機(jī)溶劑為極性非質(zhì)子溶劑。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述極性非質(zhì)子溶劑選自二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮和六甲基磷酰胺(HMPA)。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述極性非質(zhì)子溶劑為二甲基亞砜(DMSO)。
57.權(quán)利要求50-56中任一項(xiàng)的方法，其中所述碳二亞胺為I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)_碳二亞胺(EDAC)。
58.權(quán)利要求50-57中任一項(xiàng)的方法，其中使所述血清型莢膜多糖與I3DPH和EDAC在有機(jī)溶劑中反應(yīng)的步驟包括維持約I : 5 3的多糖TOPH EDAC重量比。
59.權(quán)利要求50-58中任一項(xiàng)的方法，其中所述還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)。
60.權(quán)利要求50-59中任一項(xiàng)的方法，其中所述載體蛋白的活化包括使所述載體蛋白與溴乙酸反應(yīng)。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述溴乙酸包括溴乙酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯(BAANS)。
62.權(quán)利要求50-61中任一項(xiàng)的方法，其中分離所述活化的血清型多糖的步驟包括滲濾。
63.權(quán)利要求50-62中任一項(xiàng)的方法，其中分離所述活化的載體蛋白的步驟包括滲濾。
64.權(quán)利要求50-63中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括水解所述血清型多糖-載體蛋白綴合物以去除未反應(yīng)的活化基團(tuán)的步驟。
65.權(quán)利要求64的方法，其中水解所述血清型多糖-載體蛋白綴合物的步驟包括加入半胱胺鹽酸鹽。
66.權(quán)利要求50-65中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括分離所述包含分離的綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型莢膜多糖的免疫原性綴合物。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述血清型多糖載體蛋白綴合物的分離包括滲濾。
68.權(quán)利要求50-67中任一項(xiàng)的方法，其中所述載體蛋白為CRM197。
69.權(quán)利要求68的方法，其中使所述活化的血清型多糖與所述CRM197以約I: I的重量比反應(yīng)。
70.權(quán)利要求27-69中任一項(xiàng)的方法，其中所述活化的多糖具有約20kDa-約IOOOkDa的大小。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述活化的多糖具有約50kDa-500kDa的大小。
72.權(quán)利要求27-71中任一項(xiàng)的方法，其中所述免疫原性多糖-蛋白綴合物具有400kDa-約 5000kDa 的大小。
73.通過權(quán)利要求27-72中任一項(xiàng)所述的方法制備的免疫原性綴合物。
74.權(quán)利要求73的免疫原性綴合物，其包含超過約I%的游離多糖和少于約30%的游離多糖。
75.權(quán)利要求73的免疫原性綴合物，其包含少于約20%的游離多糖。
76.免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求73-75中任一項(xiàng)的免疫原性綴合物以及包含佐齊U、稀釋劑或載體中的至少一種。
77.權(quán)利要求76的免疫原性組合物，其中所述佐劑是基于鋁的佐劑。
78.權(quán)利要求77的免疫原性組合物，其中所述佐劑選自磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁。
79.權(quán)利要求78的免疫原性組合物，其中所述佐劑為磷酸鋁。
80.權(quán)利要求76-79中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，與類型多糖的總量相比，其包含少于30%的游離型多糖。
81.權(quán)利要求80的免疫原性組合物，與類型多糖的總量相比，其包含少于20%的游離型多糖。
82.具有20kDa-1000kDa的分子量的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖，其共價結(jié)合至載體蛋白；其中共價結(jié)合至所述載體蛋白的多糖的組合分子量為約200kDa-5000kDa。
83.具有20kDa-1000kDa的分子量的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖其共價結(jié)合至載體蛋白；其中共價結(jié)合至所述載體蛋白的多糖的組合分子量為約200kDa-5000kDa。
84.權(quán)利要求82或83的共價結(jié)合至載體蛋白的多糖，其中所述多糖具有70kDa-300kDa的分子量范圍。
85.權(quán)利要求82或83的共價結(jié)合至載體蛋白的多糖，其具有500kDa-2500kDa的分子量范圍。
86.權(quán)利要求82或83的共價結(jié)合至載體蛋白的多糖，其中所述載體蛋白為CRM197。
87.權(quán)利要求86的共價結(jié)合至載體蛋白的多糖，其中所述CRM197通過氨基甲酸酯鍵、酰胺鍵或兩者共價連接至所述多糖。
88.權(quán)利要求86或87的共價結(jié)合至載體蛋白的多糖，其中綴合的賴氨酸比CRM197的摩爾比為約10 I-約25 I。
89.權(quán)利要求88的共價結(jié)合至載體蛋白的多糖，其中在所述多糖的至少每5-10個糖重復(fù)單元存在至少一個CRM197和多糖之間的共價鍵。
90.權(quán)利要求88或89的共價結(jié)合至載體蛋白的多糖，其中在所述多糖的至少每5個糖重復(fù)單元存在至少一個CRM197和多糖之間的鍵。
91.權(quán)利要求88-89中任一項(xiàng)的共價結(jié)合至載體蛋白的多糖，其中所述CRM197包含5-22個共價連接至所述多糖的賴氨酸。
92.權(quán)利要求91的共價結(jié)合至載體蛋白的多糖，其中所述CRM197包含8-15個共價連接至所述多糖的賴氨酸。
93.一種免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求82-92中任一項(xiàng)所述的共價結(jié)合至載體蛋白的多糖以及包含佐劑、稀釋劑或載體中的至少一種。
94.權(quán)利要求93的免疫原性組合物，其中所述佐劑是基于鋁的佐劑。
95.權(quán)利要求94的免疫原性組合物，其中所述佐劑選自磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁。
96.權(quán)利要求95的免疫原性組合物，其中所述佐劑為磷酸鋁。
97.一種減少或預(yù)防與對象中的葡萄球菌感染、葡萄球菌細(xì)菌相關(guān)的疾病或疾病狀況的方法，所述方法包括向所述對象施用免疫學(xué)有效量的權(quán)利要求20-25和76-81和93-96中任一項(xiàng)的免疫原性組合物的步驟。
98.權(quán)利要求97的方法，其中所述感染、疾病或疾病狀況選自侵襲性金黃色葡萄球菌、敗血癥和攜帶。
99.一種減少或預(yù)防接受外科手術(shù)的對象中的葡萄球菌感染的方法，所述方法包括在所述外科手術(shù)之前向所述對象施用免疫學(xué)有效量的權(quán)利要求20-25和76-81和93-96中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物的步驟。
100.權(quán)利要求97-99中任一項(xiàng)的方法，其中所述對象是人、家庭寵物或家畜。
101.分離具有20-1000kDa的分子量的金黃色葡萄球菌莢膜多糖的方法，所述方法包括使細(xì)菌細(xì)胞懸浮液接受酸加熱處理的步驟。
102.本發(fā)明的莢膜多糖、免疫原性綴合物或免疫原性組合物所產(chǎn)生的抗體。
103.權(quán)利要求102的抗體，其中如通過在動物效力模型中殺死細(xì)菌或通過調(diào)理吞噬殺死測定所測量的，所述抗體是有功能的。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含綴合至載體蛋白的金黃色葡萄球菌血清型5和8莢膜多糖的免疫原性綴合物以及它們的制備和使用方法。制備本發(fā)明的免疫原性綴合物的方法包括利用綴合化學(xué)將所述莢膜多糖與所述載體蛋白共價綴合，所述綴合化學(xué)包括1，1-羰基-二-1，2，4-三唑(CDT)或3-(2-吡啶二硫代)-丙酰肼(PDPH)。
文檔編號A61K39/085GK102625713SQ201080037276
公開日2012年8月1日 申請日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月22日
發(fā)明者A·K·普瑞薩德, A·安德森, B·A·格林, I·L·道奇, J·S·南拉, K·U·揚(yáng)森, S·J·弗雷澤, T·D·斯科特, V·帕夫利阿克 申請人:惠氏有限責(zé)任公司