一種乳酸脫氫酶同工酶1的檢測試劑及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及乳酸脫氫酶同工酶1的檢測領(lǐng)域，具體涉及一種利用化學(xué)抑制法來檢 測乳酸脫氫酶同工酶1的檢測試劑和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸脫氧酶有5種同工酶形式，即LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5,可用電泳法進(jìn)行 分離。人體心肌、腎、紅細(xì)胞以LDH1和LDH2為最多。肝和橫紋肌則以LDH4和LDH5為主。 脾、胰、甲狀腺、腎上腺中LDH3較多。乳酸脫氫酶同工酶是觀察心肌疾病、肝膽疾病等的指 標(biāo)之一。
[0003] 乳酸脫氫酶同工酶是指催化同一反應(yīng)（乳酸-丙酮酸）而結(jié)構(gòu)不同的一組酶類。 其廣泛分布于全身各組織，而LDH1絕大部分分布于心肌細(xì)胞中，所以當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生病變 或損傷時(shí)，LDH1急劇升高，因此測定LDH1對診斷心臟疾病具有較高的靈敏性。另外，檢測 LDH1的活力還可作為治療心肌梗死、心肌炎、心肌損傷新藥篩選的一項(xiàng)指標(biāo)。
[0004]目前用于同工酶的檢測方法主要有化學(xué)抑制法、免疫抑制法、熱變性法、電泳法、 親和層析法。用于乳酸脫氫酶同工酶的檢測方法主要有化學(xué)連續(xù)檢測法，可使用的化學(xué)抑 制劑主要有高氯酸鹽、羥基化合物和硫氰酸胍，這幾種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)，其中電泳法有點(diǎn)事 準(zhǔn)確可靠，能夠了解整個(gè)LDH同工酶譜的情況，信息全面，缺點(diǎn)是靈敏度差，操作時(shí)間長，而 且對儀器和操作人員的要求高，離子交換層析法的結(jié)果也非常的準(zhǔn)確，但是操作要求也非 常高并且操作時(shí)間也非常長，而使用化學(xué)抑制法和免疫法則操作簡單，使用時(shí)間短，非常適 合推廣，而相對于免疫法，則化學(xué)抑制法的價(jià)格更加的低廉，但是化學(xué)抑制法由于可選用的 抑制劑較多，由于抑制劑的種類不同和抑制劑的含量不同會(huì)導(dǎo)致檢測試劑的特異性較差， 容易受到其他乳酸脫氫酶同工酶的干擾，或者過度抑制的情況，本發(fā)明根據(jù)這一問題，在化 學(xué)抑制劑法的基礎(chǔ)上建立一種特異性強(qiáng)的化學(xué)抑制法檢測血清乳酸脫氫酶同工酶1的檢 測試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的問題是提供一種高準(zhǔn)確度的利用化學(xué)抑制法檢測血清乳酸脫 氫酶同工酶1的檢測試劑。
[0006] 同時(shí)還提供了一種利用本發(fā)明的檢測試劑檢測乳酸脫氫酶同工酶1的檢測方法。
[0007] 乳酸脫氫酶催化L-乳酸與NAD+反應(yīng)生成NADH，NADH在340nm處有特異吸收峰， 其生成的速率與血清中的LDH1的活性成正比。化學(xué)抑制劑為LDH的M亞基的特異抑制劑， 在340nm處測定NADH的生成速率，即可測出LDH1活性。
[0008]
[0009] 本發(fā)明的具體內(nèi)容如下：
[0010] 一種乳酸脫氫酶同工酶1的檢測試劑，包括試劑R1和試劑R2,其特征在于，所述試 劑R1包含：生物緩沖液其中溶質(zhì)在試劑R1中的濃度為50-150mmol/L，
[0011] L-乳酸鋰 1. 0-1. 5mmol/L，
[0012] 過氯酸鈉 1.5-2.5mol/L，
[0013] 羥基乙叉二膦酸l_5ml/L，
[0014] 十八烷基三甲基溴化銨0? 1-lg/L，
[0015] 聚氧乙烯烷基醚0? 1-lml/L，
[0016] 防腐劑 0? 5_5ml/L ;
[0017] 所述試劑R2包含：緩沖液其中溶質(zhì)在試劑R1中的濃度為50-150mmol/L，
[0018] NAD+ 8_12mmol/L,
[0019] 防腐劑 0.5_5ml/L。
[0020] 更為優(yōu)化的，所述試劑R1中還包括：抗壞血酸氧化酶1-5KU/L，和/或膽紅素氧化 酶 1-3KU/L。
[0021] 更為優(yōu)化的，所述試劑R2中還包括：明膠l-5g/L。
[0022] 優(yōu)選的，所述試劑R1中生物緩沖液為CAPS緩沖液，其溶質(zhì)在試劑R1中的濃度為 100mmol/L 的，在 25°C時(shí)，CAPS 緩沖液的 PH 為 9. 7。
[0023] 優(yōu)選的，所述試劑R2中緩沖液為酒石酸緩沖液，其溶質(zhì)在試劑R1中的濃度為 100mm 〇l/L，在25°C時(shí)，酒石酸緩沖液的pH為3. 5。
[0024] 優(yōu)選的，所述防腐劑為Proclin系列300型。
[0025] 優(yōu)選的，所述試劑R1與試劑R2的體積比為5:1。
[0026] -種上述檢測試劑用于檢測乳酸脫氫酶同工酶1的檢測方法，其特征在于，包含 如下步驟：
[0027] (1)量取試劑R1和試劑R2;
[0028] (2)將待測血清與試劑R1混合，測得波長為340nm時(shí)的吸光度A1;
[0029] (3)將試劑R2加入步驟⑵的混合溶液內(nèi)，3-8min后，測得波長為340nm時(shí)的吸 光度A2。
[0030] 上述檢測方法，更為又換為，步驟（3)中的反應(yīng)時(shí)間為5min。
[0031] 試劑R1和試劑R2的制備方法為在將各原料量取好，加入到容器中，混合均勻即 可。
[0032] Proclin 系列 300 型簡稱為 PC-300。
[0033] 本發(fā)明在試劑R1和R2中分別使用了 CAPS (3 -（環(huán)己氨基）一 1 一丙磺酸）緩沖 液和酒石酸緩沖液，在試劑中使用的CAPS(3 -（環(huán)己氨基）一 1 一丙磺酸）緩沖液是生物 緩沖液，對在保證緩沖能力的同時(shí)，不會(huì)對反應(yīng)體系產(chǎn)生負(fù)面影響；在試劑的R1中加入了 十八烷基三甲基溴化銨和聚氧乙烯烷基醚（即EMULGEN-707)兩種表面活性劑，這兩種表面 活性劑能有較好的提高試劑的乳化作用，從而提高試劑的準(zhǔn)確度和特異性；在R1生化試劑 中優(yōu)先選擇了過氯酸鈉作為化學(xué)抑制劑，能過較好的提高檢測試劑的特異性；在試劑R1中 加入了羥基乙叉二膦酸，能夠有效的螯合重金屬離子，并且能夠較好的提高試劑的準(zhǔn)確性； 本發(fā)明還在試劑中加入了抗化學(xué)酸氧化酶和膽紅素氧化酶，能夠有效的去除抗壞血酸和膽 紅素的干擾。
[0034] 本乳酸脫氫酶同工酶1的檢測試劑具有準(zhǔn)確度高、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，可廣泛的推 廣于乳酸脫氫酶同工酶1的檢測領(lǐng)域。
[0035] 本乳酸脫氫酶同工酶1的檢測方法，其原理就是，A2與A1的差值，與標(biāo)準(zhǔn)液的使 用同樣方法測得的數(shù)值的差值之比乘以標(biāo)準(zhǔn)液的LDH1的濃度，就是待測血清的濃度，具有 速度快，準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0036] 圖1為配方2和電泳法相關(guān)性曲線圖
[0037] 圖2為配方3和電泳法相關(guān)性曲線圖
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明：
[0039] (1)配方1 :試劑R1的組分為：
[0040] TRIS 緩沖液 100mmol/L，
[0041] L-乳酸裡 1. 3mmol/L，
[0042] 硫氰酸胍 2mol/L，
[0043] 疊氮鈉（防腐劑）0? 5ml/L ;
[0044] 試劑R2的組分為：
[0045] 磷酸鹽緩沖液100mmol/L，
[0046] NAD+ 10mmol/L,
[0047] 疊氮鈉（防腐劑）0? 5ml/L ;
[0048] (2)配方2 :