專利名稱：D-乳酸診斷/測定試劑盒及d-乳酸的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種D-乳酸診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定D-乳酸濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景L-乳酸是近年來人們十分關(guān)注并發(fā)展較快的有機(jī)酸。同時L-乳酸具有 在食品、詞料、醫(yī)藥、塑料、飼料、農(nóng)藥、日用化工、造紙及電子工業(yè)等 多領(lǐng)域應(yīng)用前景。L-乳酸是大多數(shù)生物體代謝作用的終產(chǎn)物。僅少數(shù)微生物(例乳酸菌屬、 明串珠菌屬)能形成D-乳酸。生產(chǎn)酸奶時非常注意檢測乳酸鹽，以評估微 生物是否產(chǎn)生L-乳酸，D-乳酸或二者兼有。若有D-乳酸存在，則可能是微 生物造成了污染。乳酸鹽濃度的異常升高與多種疾病如糖尿病、酸毒癥等疾病有密切的關(guān) 系。L(+)-Lactate是人體中乳酸鹽代謝的主要中間產(chǎn)物，并且存在于血液 中。D(-)-Lactate也存在，但含量很低，只有L(+)-Lactate的1_5%。血乳酸測試作為一個監(jiān)護(hù)、監(jiān)測運(yùn)動員訓(xùn)練能力的手段，把血乳酸值作 為衡量運(yùn)動員有氧耐力水平、無氧訓(xùn)練能力、身體疲勞恢復(fù)等方面的一個 重要數(shù)據(jù)，供安排訓(xùn)練時參考。酶法分析是國際上公認(rèn)的分析方法，己被多個國際權(quán)威組織或機(jī)構(gòu)采 納如IFU (國際果汁生產(chǎn)者協(xié)會),AIJN (歐盟果蔬汁及飲料生產(chǎn)者聯(lián)盟), 及MEBAK， OICC, VDLUFA等組織廣為推崇，并確定為標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用具有D-乳酸特異牲的酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技術(shù)，計量/連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺 輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定D-乳酸濃度 的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的D-乳酸診斷/測定試劑盒， 采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進(jìn)行 D-乳酸濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推廣 應(yīng)用。本發(fā)明D-乳酸濃度測定方法原理如下D-乳酸+輔酶D-乳酸脫氫酶丙酮酸+還原型輔酶這種方法應(yīng)用D-乳酸脫氫酶(D-lactic acid dehydrogenase; EC 1.1.1.28) 酶促反應(yīng)速率比色法/終點(diǎn)法。D-乳酸脫氫酶酶解D-乳酸，并將輔酶(在 340nrn處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從 而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過測量 340nm處吸光度上升的程度/速度，可以測算D-乳酸的濃度大小。實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明D-乳酸診斷/測定試劑盒較為理 想緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/LD-乳酸脫氫酶 12000 U/L本發(fā)明的D-乳酸診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、D-乳酸脫氫酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、D-乳酸脫氫酶。 輔酶、D-乳酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以 是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使 用。無論是單劑、雙劑，本發(fā)明測定D-乳酸濃度的方法，其輔酶可以是 NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的 一種。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實施例一本實施例的D-乳酸診斷/測定試劑為單試劑，包括甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 100 mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/LD-乳酸脫氫酶 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光 度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測D-乳酸樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0 分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出D-乳酸的 濃度大小。 實施例二本實施例的D-乳酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑l甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 穩(wěn)定劑綱mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L試劑2甘氨酸_氫氧化鈉緩沖液 穩(wěn)定劑D-乳酸脫氫酶100mmol/L 500醒ol/L 12000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光 度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測D-乳酸樣品與試 劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲 時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nrn吸光度上升的程度/速度，從而測算出D-乳酸的 濃度大小。申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉?？傊?，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種具有D-乳酸特異性的酶比色法D-乳酸濃度測定方法，其方法原理如下D-乳酸+輔酶D-乳酸脫氫酶丙酮酸+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，測算出D-乳酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種D-乳酸診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——4000 mmol/L輔酶 1- 6 mmol/LD-乳酸脫氫酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述D-乳酸診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、D-乳酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述D-乳酸診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、D-乳酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩 沖液、穩(wěn)定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、D-乳酸脫氫酶 組成。輔酶、D-乳酸脫氫酶在試劑l或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述D-乳酸診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙:醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種,
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用具有D-乳酸特異性的酶比色法技術(shù)的D-乳酸診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定D-乳酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、D-乳酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測算出D-乳酸的濃度大小。
文檔編號G01N33/50GK101324555SQ20071002322
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司