GGGAGGCAGCCA TTGAGA CCCAGA TITITmTT-C6-SH-3'；一報告探針基因為： 5'-biotin-TCCTGC CCAACA GCAACC ACGTGG CCAGTG-3' ；另一組探針中的另一捕獲探針基 因為：5' -TCTGGG TCTCAA TGGCTG CCTCCC CGGCGC TTTTTTTTTT-C6-SH-3' ；另一報告探針基 因為：5' -biotin-GGCTGG GCACTA TCTCTTCAGAACTGCTGC-3'。
[0014] (1)根據帶巰基的捕獲探針在金電極表面能形成自組裝單分子膜的特性，將兩捕 獲探針分別固定在兩個不同通道上分別設置的兩個型號相同的金電極工作電極表面，每 個通道有一個金電極工作電極，對兩個金電極工作電極表面未結合的位點通過封閉劑進 行封閉，采用巰基己醇，巰基乙酸，牛血清白蛋白或酪蛋白封閉；（2)將兩報告探針提前混 于含有靶標dsDNA的雜交液中，通過高溫變性使雙鏈DNA解鏈成單鏈，并將變性后的雜交 液置于冰浴中保持雜交溶液中DNA單鏈狀態(tài)；（3)變性后的兩條單鏈靶標DNA的一端分別 與5'端標記有生物素的兩報告探針雜交，然后利用兩條長鏈靶標鏈的另一端分別與兩捕 獲探針通過堿基配對結合實現(xiàn)共雜交，將兩組探針新形成dsDNA片段固定在相應的金電 極工作電極上；(4)加入帶有辣根過氧化物酶的親和素，通過辣根過氧化物酶上的親和素， 根據親和素與生物素之間的親和作用，將辣根過氧化物酶結合到金電極工作電極表面，利 用辣根過氧化物酶的信號放大作用，將兩個修飾的金電極工作電極同時置于相同的底物 3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺中，利用電化學雙通道工作站同時采集電信號檢測。
[0015] 所述兩組2' -氟代RNA單體修飾的報告探針加入到靶標雙鏈DNA中一同變性后， 進行雜交，能夠有效的防止原有靶標兩條互補鏈之間的自身復性，提高雜交效率，且修飾了 2' -氟代RNA單體后的報告探針的解鏈溫度升高，有利于提高報告探針識別靶標DNA的專 一性，提尚檢測的特異性。
[0016] 兩組探針DNA加入后、探針DNA與靶標dsDNA雜交后需采用洗滌劑洗滌除去非特 異性吸附，以去除PBS、0. 2% SDS物質。
[0017] 將酶固定在修飾有生物素的金電極工作電極表面之前，需采用封閉劑防止電極表 面的非特異性吸附，以去除〇. 1% BSA。
[0018] 將辣根過氧化物酶固定在修飾有生物素的工作電極表面后，需采用洗脫液除去電 極表面的非特異性吸附，以去除0. 1% Tween-PBS、PBS。
[0019] 本發(fā)明所述的檢測急性早幼粒細胞白血病PML/RARα融合基因 dsDNA的方法，其 特征在于對探針的特異性及靈敏度進行測試，實現(xiàn)對急性早幼粒細胞白血病PML/RARa融 合基因 dsDNA的定量檢測。
[0020] 具體地說，本發(fā)明的一種基于2' -氟代RNA單體修飾雙探針同時檢測急性早幼粒 細胞白血病PML/RAR α融合基因雙鏈DNA的雙通道電化學傳感檢測方法，待檢測PML/RAR α 融合基因為L型、V型或S型，包括如下步驟：
[0021] (1)從NCBI基因數(shù)據庫中查找L型、V型及S型PML/RARa融合基因雙鏈DNA片 段的融合位點，選擇位點前后的堿基作為人工合成的兩組檢測探針使用，檢測探針長度為 30堿基，經過同源比對，同時利用相關生物學軟件對兩組檢測探針與其相應的靶標序列兩 兩間的解鏈溫度進行模擬，以確保探針的特異性，將對應序列作為APL的特異性序列進行 合成。其中，探針中修飾的2'-F RNA單體進行修飾位點設計，考慮到使用最少的2'-F RNA 單體，但能較好地保持探針鏈的剛性并提高其特異性。
[0022] (2)采用自組裝膜法固定捕獲探針，根據帶巰基（-SH)的不同捕獲探針在不同金 電極表面可以形成自組裝單分子膜的特性來固定，對金電極表面未結合的位點通過封閉劑 進行封閉，如巰基己醇，巰基乙酸，牛血清白蛋白，酪蛋白等。
[0023] (3)使靶標dsDNA中兩條長鏈靶標ssDNA鏈的一端能夠分別與其相應的5'端標記 有生物素（biotin)的報告探針雜交，然后利用長鏈靶標ssDNA鏈的另一端與捕獲探針通過 堿基配對結合實現(xiàn)共雜交，在不同電極表面形成相應的雙鏈DNA (dsDNA)片段固定化。
[0024] (4)通過辣根過氧化物酶（HRP)上的親和素（avidin)，根據親和素與生物素之 間的親和作用，將酶結合上去，利用酶的信號放大作用，在底物3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)中進行檢測。
[0025] (5)利用雙通道電化學工作站通過安培電流時間曲線法能夠實現(xiàn)對靶標dsDNA鏈 中兩條互補序列的同時檢測，將檢測所得信號結果進行計算疊加，可以得到靶標dsDNA的 檢測最終電流信號，比較雜交前后電信號的差異，可說明溶液中是否存在靶標dsDNA。
[0026] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比有以下優(yōu)點：本發(fā)明技術方案采用2' -氟代RNA單體修飾 探針技術、雙探針檢測技術與電化學酶聯(lián)放大技術構建了基于2' -氟代RNA單體修飾雙探 針同時檢測急性早幼粒細胞白血病PML/RAR α融合基因雙鏈DNA的雙通道電化學傳感檢測 方法，其中設計的2'-氟代RNA單體修飾探針熱穩(wěn)定性增強，其特殊的核苷酸結構也增加了 探針的剛性及特異性，而雙探針檢測模式能夠有效地避免DNA雙鏈片段自身復性對探針識 別靶標序列的干擾，提高傳感器的檢測性能，此外辣根過氧化物酶具有信號放大的功能，增 強檢測的靈敏度，所構成的三明治型電化學DNA傳感器有效地減少非特異性吸附，從而提 高雜交檢測的特異性。由于該技術的檢測周期相對較短，為臨床上快速診斷提供可能。
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明的基于2' -氟代RNA單體修飾探針的"三明治"構型雙通道電化學 DNA傳感器檢測人工合成PML/RARa融合基因 dsDNA的工作原理圖。
[0028] 圖2為本發(fā)明的基于2' -氟代RNA單體修飾探針的"三明治"構型雙通道電化學 DNA傳感器組裝過程表征圖。
[0029] 圖3為本發(fā)明的比較普通DNA雙探針與2 ' -氟代RNA單體修飾雙探針檢測PML/ RARa融合基因 dsDNA的不同靶標序列直方圖。
[0030] 圖4為本發(fā)明的2 ' -氟代RNA單體修飾雙探針檢測PML/RAR a融合基因 dsDNA的 電信號檢測圖、直方圖和標準曲線圖。
[0031] 圖2中：在0.1 M KOH的IOmM K3Fe (CN)6溶液中不同修飾電極的循環(huán)伏安圖（A)和 在IOmM Fe (CN) 63 /4溶液中的交流阻抗圖譜（B)，未做修飾的工作電極裸AuE (a)、經過MCH 封閉后的Cl/MCH/AuE(b)、完成捕獲探針組裝的Cl/AuE(c)、雜交后的RlSaCl/MCH/AuE(d) 和修飾有 HRP 的 HRP/RlSaCl/MCH/AuE(e)。
[0032] 圖3中：圖普通短直鏈DNA (白色）探針與2' -氟代RNA單體修飾探針（黑色）分別 與不同dsDNA雜交后電流信號直方圖：完全互補革El標dsDNA(b)、單堿基對錯配dsDNA(c)、三 堿基對錯配dsDNA (d)、五堿基對錯配dsDNA (e)、十堿基對錯配dsDNA (f)、正常人PML部分序 列dsDNA (g)、正常人RAR α序列dsDNA (h)以及未含有dsDNA的雜交體系完全互補DNA (a)。
[0033] 圖4中：基于2' -氟代RNA單體修飾探針的雙通道電化學DNA傳感器兩個通道分 別采集通道I : (A)和通道2 : (B)的時間電流曲線：濃度范圍從（a)到（g)分別為Omol/L， I X 10 13mol/L，I X 10 12mol/L，I X 10 nmol/L，I X 10 10mol/L，I X 10 9mol/L 和 I X 10 smol/L ; (C)比較雙通道電化學DNA傳感器上同時組裝兩組2'-氟代RNA單體修飾探針（黑色部分） 與組裝單組2'-氟代RNA單體修飾探針（檢測探針1 :白色部分，檢測探針2 :陰影部分）分 別與不同濃度靶標dsDNA進行雜交后所得的電流總和（Σ I)直方圖；(D)雙通道電流總和 (Σ I)與不同濃度靶標dsDNA的線性關系圖（濃度范圍5.0X1013mol/L~L5X1012mol/ L) 〇
【具體實施方式】
[0034] 為了使本發(fā)明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合 實施例和附圖，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以 解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0035] 如附圖所示，本發(fā)明所述的一種基于2' -氟代核糖核酸雙探針的雙通道電化學傳 感器，包含有兩組檢測探針，其特征在于每組探針各包含有一條3'端修飾巰基的捕獲探針 和一條5'端修飾有生物素的報告探針，兩組探針中的兩個捕獲探針分別簡稱（Cl和C2) 和兩個報告探針分別簡稱為（Rl和R2)，且這兩組探針中的一組探針（C1/R1)和另一組探 針（C2/R2)分別與靶標急性早幼粒細胞白血病PML/RARa融合基因 dsDNA中相應的兩條 ssDNA(Sa和Sb)部分基因序列存在互補；其中，兩個修飾有巰基的捕獲探針（Cl和C2)能 夠通過自組裝分別固定到不同通道上的兩個型號相同的金電極工作電極表面上，在兩個金 電極工作電極表面未結合的位點通過封閉劑進行封閉，而過量的報告探針Rl和報告探針 R2則提前加入到含有待測靶標dsDNA的雜交溶液中進行熱變性后置于冰浴中以確保雜交 液中的DNA序列均保持ssDNA狀態(tài)，并將一組中的修飾有巰基的一條捕獲探針Cl的金電極 工作電極和另一組中的修飾有巰基的另一條捕獲探針C2的金電極工作電極一同放入含 有一條5'端修飾有生物素的報告探針RU另一條5'端修飾有生物素的報告探針R2和靶 標急性早幼粒細胞白血病PML/RARa融合基因 dsDNA的待測溶液中進行雜交反應，通過雜 交反應，在兩個金電極工作電極表面形成了 "三明治"傳感模式，此時生物素已通過雜交修 飾到電極表面，加入親和素修飾的辣根過氧化物酶與生物素相互識別，將辣根過氧化物酶 結合到金電極工作電極上；所述的金電極工作電極置于由3,3'，5,5'_四甲基聯(lián)苯胺（TMB) 和H 2O2組成的檢測底液，通過辣根過氧化物酶HRP催化使得H 202氧化TMB產生電化學信號， 利用雙通道電化學工作站進行信號采集，當溶液中不含靶標dsDNA，則雜交反應無法進行， 金電極工作電極界面上無法形成"三明治"構型傳感模式，那么辣根過氧化物酶HRP也就無 法固定到金電極工作電極表面，金電極工作電極無法對檢測底液進行催化，所以雙通道電 化學工作站檢測到的電流信號很弱，通過對雙通道所采集到的電流信