一種納米熒光微球，其制備方法及在多重pcr產(chǎn)物的液相蛋白芯片檢測(cè)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用作多重PCR產(chǎn)物的液相蛋白芯片的納米熒光微球及其制備方 法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)是無需使用活生物體而酶促復(fù)制DNA的分子生物學(xué)技術(shù)。PCR在醫(yī)學(xué)和生物研究實(shí)驗(yàn)室中普遍用于多種任務(wù)，例如檢測(cè)遺傳疾病、鑒定基因指紋、診 斷感染性疾病、克隆基因、親子鑒定和DNA計(jì)算。由于其無與倫比的擴(kuò)增和準(zhǔn)確性能力，分 子生物學(xué)家已將PCR作為核酸檢測(cè)的首選方法。通常在PCR反應(yīng)的終點(diǎn)或平臺(tái)期進(jìn)行DNA 檢測(cè)，這使得難于定量起始模板。實(shí)時(shí)PCR或動(dòng)態(tài)PCR通過隨著反應(yīng)進(jìn)程而記錄擴(kuò)增子濃 度而提高了終點(diǎn)PCR分析的性能。擴(kuò)增子濃度最常通過與被擴(kuò)增靶標(biāo)相關(guān)的熒光信號(hào)變化 來記錄。
[0003] 液相芯片，也稱為微球體懸浮芯片（suspensionarray，liquidchip)，是基于xMAP(flexibleMultiAnalyteProfiling)技術(shù)的新型生物芯片技術(shù)平臺(tái)，它是在不同焚 光編碼的微球上進(jìn)行抗原抗體、酶底物、配體受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng)，通過紅、綠 兩束激光分別檢測(cè)微球編碼和報(bào)告熒光來達(dá)到定性和定量的目的，一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以完成 多達(dá)100種不同的生物學(xué)反應(yīng)，是一種新的高通量分子檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種粒徑穩(wěn)定、光譜適用于可見發(fā)射 光的納米熒光微球，采用該納米熒光微球和特異性抗體相結(jié)合，適用于多重PCR產(chǎn)物的液 相蛋白芯片檢測(cè)技術(shù)。
[0005] 本發(fā)明同時(shí)還要提供一種納米熒光微球的制備方法，該方法可獲得粒徑穩(wěn)定、光 譜適用于可見發(fā)射光的納米熒光微球，并且該方法簡(jiǎn)單。
[0006] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種納米熒光微球，具有核殼結(jié)構(gòu)， 該納米焚光微球的粒徑為300~600nm，其內(nèi)核為包含有焚光分子的聚合物微球，外殼具有 修飾在所述聚合物微球外表面上的一種或多種官能團(tuán)，該所述官能團(tuán)能夠直接與配體或生 物大分子反應(yīng)形成微球表面的共價(jià)鍵連接，或在激活后與配體或者生物大分子進(jìn)行共價(jià)標(biāo) 記；所述的聚合物微球?yàn)榫奂谆┧峒柞サ奈⑶蚧蚣谆┧峒柞ヅc其它單體共聚形成 的共聚物的微球或者它們的混合物，其中甲基丙烯酸甲酯單元的重量至少占所述納米熒光 微球總重量的50%，所述的熒光分子的重量占所占納米熒光微球總重量的0. 05%~5%。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明，所述甲基丙烯酸甲酯與其它單體共聚形成的共聚物中，甲基丙烯酸 甲酯與所述其它單體的結(jié)構(gòu)單元數(shù)均大于等于50。所述的其它單體為包括但不限于氟乙 稀、氯乙稀、溴乙稀、乙稀碘化、苯乙稀以及丙稀酸等。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明，所述的官能團(tuán)可以為選自羧基，乙醇胺基，羥基，胺基，氨基，亞胺基， 環(huán)氧基，異氰酸酯基，金屬醇鹽，及聚乙二醇基中的一種，其中優(yōu)選為羧基。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明，所述熒光分子指在適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)下可發(fā)射熒光的物質(zhì)。本發(fā)明中， 熒光分子優(yōu)選為熒光素及其衍生物、羅丹明、腎上腺素染料、氟硼瑩等。其中，更優(yōu)選采用羅 丹明例如羅丹明Red-X和羅丹明6G等作為熒光分子。熒光分子的重量?jī)?yōu)選為所述納米熒 光微球總重量的0. 2%~5%。
[0010] 優(yōu)選地，本發(fā)明的納米熒光微球的粒徑為350~400nm，更優(yōu)選為370~390nm。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明，納米熒光微球還可進(jìn)一步包含一種或者一種以上的通過所述官能團(tuán) 共價(jià)連接而覆蓋在所述微球表面的生物活性物種，從而成為具有生物活性的熒光微球。選 擇的生物活性物種可以參與特異性識(shí)別反應(yīng)，包括特異性結(jié)合、核酸雜交和酶反應(yīng)。生物活 性物種可通過一個(gè)具有明顯親水性的間隔區(qū)域來實(shí)現(xiàn)共價(jià)標(biāo)記。這種間隔區(qū)域可以是諸如 乙烯乙二醇低聚物的小分子間隔區(qū)域，也可以是諸如肽、蛋白質(zhì)、聚乙二醇、和多糖的大分 子實(shí)體。微球表面和生物活性種的結(jié)合包括氨基鍵結(jié)合，酯鍵結(jié)合，C-C鍵結(jié)合，C-N鍵結(jié)合 和包含電荷相互作用的結(jié)合。生物活性的例子包括：包含在特定的識(shí)別和結(jié)合中的分子實(shí) 體，諸如抗體、抗原、核酸、配體、受體、人工多肽、蛋白質(zhì)等。該生物活性物種一般都可以采 用多種眾所周知的技術(shù)中的任何一種附著在在表面具有官能團(tuán)的聚合物微球上。例如，可 以使用羧基、氨基、醛基、硫醛基、環(huán)氧基和其它活性或者鍵和功能基、以及剩余的自由基和 陽離子自由基將生物活性物種共價(jià)附著在微球上，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了蛋白的耦聯(lián)反應(yīng)。一個(gè)表 面官能團(tuán)可以作為官能共聚單體的一個(gè)組合，因?yàn)槲⑶虮砻婵梢园砻鏉舛认鄬?duì)較高的 極性基。此外該發(fā)明制備的微球也可以直接共價(jià)鍵連接蛋白質(zhì)，而不需要進(jìn)一步的修改，例 如用碳化二亞胺激活微球表面的羧基，而被激活的羧基與抗體的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵。激 活和抗體耦聯(lián)可以發(fā)生在諸如磷酸（鹽）緩沖液，或者2-(N-嗎啉）乙烷磺酸的緩沖液中， 由此可以形成微球結(jié)合物。
[0012] 本發(fā)明采取的又一技術(shù)方案是：一種上述的納米熒光微球的制備方法，其包括如 下步驟：
[0013] (1)、以所述聚合物的微粒和含有所述官能團(tuán)的烯烴單體為原料，通過微乳液聚合 法制備得到外表面上具有所述官能團(tuán)的聚合物微球；
[0014] (2)、向步驟（1)所得的外表面上具有所述官能團(tuán)的聚合物微球中緩慢注入含有 所述熒光分子的有機(jī)溶劑和水，聚合物微球發(fā)生溶脹，熒光分子進(jìn)入聚合物微球內(nèi)，然后 離心，除去上清液，清洗，加水懸浮，即得所述納米熒光微球，其中有機(jī)溶劑為丙酮或二氯甲 烷。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明，步驟（1)可采用常規(guī)的微乳液聚合法來實(shí)現(xiàn)，最后獲得的聚合物微 球?yàn)榫酆衔?、用于提供微球表面官能團(tuán)的含有官能團(tuán)的烯烴單體、表面活性劑、水以及有機(jī) 溶劑的乳液，這些均為本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所熟知。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的是表面具有羧基的納米熒光微球。在該情況下，用于提供微球 表面官能團(tuán)的含有官能團(tuán)的烯烴單體可以為例如甲基丙烯酸。
[0017] 此外，本發(fā)明還特別涉及上述的納米熒光微球在多重PCR產(chǎn)物的液相蛋白芯片檢 測(cè)中的應(yīng)用。
[0018] 由于上述技術(shù)方案的運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的納米 熒光微球采用基于甲基丙烯酸甲酯的聚合物作為封裝基體，其使用壽命長(zhǎng)，易于制造，制備 穩(wěn)定且具有良好的單分散性，可以很容易地用各種官能團(tuán)和生物物種對(duì)微球的表面進(jìn)行改 性，每個(gè)微球上都能夠被連接上大量的熒光分子，是非常好的熒光信號(hào)放大的載體，應(yīng)用于 多重PCR的液相蛋白芯片檢測(cè)中，可以大大提高檢測(cè)靈敏度，且納米熒光微球非常穩(wěn)定，受 外界影響小，熒光穩(wěn)定，這為通過熒光進(jìn)行定量檢測(cè)提供了良好的條件，因此，本發(fā)明納米 熒光微球是熒光檢測(cè)技術(shù)中高靈敏度分析檢測(cè)和定量測(cè)試中的理想標(biāo)記。此外，本發(fā)明納 米熒光微球可用可見光光源激發(fā)以及通過簡(jiǎn)單的方法獲得，降低檢測(cè)分析成本。
[0019] 本發(fā)明的納米熒光微球的方法簡(jiǎn)單，獲得的納米熒光微球中，熒光分子均勻地分 布在聚合物微球中，微球粒徑均勻、穩(wěn)定，根據(jù)熒光表達(dá)的不同梯度，可制備出一個(gè)光編碼 微球，可用于多重PCR產(chǎn)物的液相蛋白芯片檢測(cè)技術(shù)，適用于醫(yī)療診斷、生物檢測(cè)、環(huán)境檢 測(cè)和食品安全監(jiān)測(cè)以及不同物種的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域中，具有液相雜交特異性更高；操作時(shí)間 短，可具體分型，檢出結(jié)果直觀，成本低，污染小，易于推廣等優(yōu)勢(shì)。
【附圖說明】
[0020] 附圖1為實(shí)施例1制備的納米熒光微球的發(fā)射和激發(fā)光譜圖；
[0021] 附圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制備的納米熒光微球的掃描電鏡圖；
[0022] 附圖3~附圖6為本發(fā)明實(shí)施例3中在四種不同的波長(zhǎng)下，多重PCR的檢測(cè)情況 圖；
[0023] 附圖7為本發(fā)明納米熒光微球多重PCR產(chǎn)物的液相蛋白芯片的檢測(cè)與常見熒光物 的對(duì)比檢測(cè)波形示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案作進(jìn)一步說明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說明 本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中所采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體