鈉處理大腸桿菌（Escherichia coli，EC)。5ml LB培養(yǎng)基中的微生物的 0D600 = 0. 5,加入50 μ L的疊氮化鈉（IM)，在搖床中培育1小時(shí)，其用PBS清洗三次，失活 細(xì)菌用于熒光探針的的對(duì)照控制實(shí)驗(yàn)。
[0052] 實(shí)施例6 :硫酸鹽還原菌對(duì)于棉籽糖熒光探針的吸收利用情況
[0053] 硫酸鹽還原菌菌斑重懸浮到30ml的PBS緩沖液中，紫外分光光度計(jì)（波長(zhǎng)為 6〇〇 nm)測(cè)量其OD值為0. 5。而后將硫酸鹽還原菌懸浮液轉(zhuǎn)移到IOml離心管中，每個(gè)離心 管加入5ml的菌懸液，然后加入100 μ L棉籽糖熒光探針（lm M)，最終熒光探針的濃度為 20 μ M0
[0054] 硫酸鹽還原菌在30度條件下，搖床的轉(zhuǎn)速為250rpm，培養(yǎng)1小時(shí)。同時(shí)，取50 μ L 菌液測(cè)量微生物濃度上述培育1小時(shí)后的細(xì)菌然后在8000rp離心10min，再用5ml PBS分 別清洗三次。清洗過(guò)得細(xì)菌菌斑在冰浴條件下，超聲16分鐘。超聲的輸出功率為200瓦， 100個(gè)循環(huán)操作過(guò)程。微生物被破碎之后，用離心機(jī)8000rp離心10min。上清液的熒光強(qiáng) 度用日立熒光光譜儀測(cè)量。棉籽糖熒光探針在上清液中的濃度通過(guò)其標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量。
[0055] 用疊氮化鈉處理大腸桿菌（Escherichia coli，EC)。5ml LB培養(yǎng)基中的微生物的 0D600 = 0. 5,加入50 μ L的疊氮化鈉（IM)，在搖床中培育1小時(shí)，其用PBS清洗三次，失活 細(xì)菌用于熒光探針的的對(duì)照控制實(shí)驗(yàn)。
[0056] 實(shí)施例7 :水蘇糖標(biāo)記熒光探針對(duì)于大腸桿菌檢測(cè)
[0057] 大腸桿菌菌斑重懸浮到30ml的PBS緩沖液中，紫外分光光度計(jì)（波長(zhǎng)為600nm) 測(cè)量其OD值為0. 5。而后將大腸桿菌懸浮液轉(zhuǎn)移到IOml離心管中，每個(gè)離心管加入5ml的 菌懸液，然后加入100 μ L水蘇糖標(biāo)記熒光探針（水蘇糖標(biāo)記熒光探針合成方式與上述棉籽 糖熒光探針一樣）（lm Μ)，最終熒光探針的濃度為20 μ Μ。
[0058] 大腸桿菌在30度條件下，搖床的轉(zhuǎn)速為250rpm，培養(yǎng)1小時(shí)。同時(shí)，取50 yL菌 液測(cè)量微生物濃度上述培育1小時(shí)后的細(xì)菌然后在8000rp離心10min，再用5ml PBS分別 清洗三次。清洗過(guò)得細(xì)菌菌斑在冰浴條件下，超聲16分鐘。超聲的輸出功率為200瓦，100 個(gè)循環(huán)操作過(guò)程。微生物被破碎之后，用離心機(jī)8000rp離心10min。上清液的熒光強(qiáng)度用 日立熒光光譜儀測(cè)量。水蘇糖熒光探針在上清液中的濃度通過(guò)其標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量。
[0059] 用疊氮化鈉處理大腸桿菌（Escherichia coli，EC)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus，SA)。5ml LB 培養(yǎng)基中的微生物的 0D600 = 0· 5,加入 50 μ L 的 疊氮化鈉（IM)，在搖床中培育1小時(shí)，其用PBS清洗三次，失活細(xì)菌用于熒光探針的的對(duì)照 控制實(shí)驗(yàn)。
[0060] 實(shí)施例8.海藻糖標(biāo)記熒光探針對(duì)于大腸桿菌檢測(cè)
[0061] 大腸桿菌菌斑重懸浮到30ml的PBS緩沖液中，紫外分光光度計(jì)（波長(zhǎng)為600nm) 測(cè)量其OD值為0. 5。而后將大腸桿菌懸浮液轉(zhuǎn)移到IOml離心管中，每個(gè)離心管加入5ml的 菌懸液，然后加入100 μ L海藻糖標(biāo)記熒光探針（海藻糖標(biāo)記熒光探針合成方式與上述棉籽 糖熒光探針一樣）（lm Μ)，最終熒光探針的濃度為20 μ Μ。
[0062] 大腸桿菌在30度條件下，搖床的轉(zhuǎn)速為250rpm，培養(yǎng)1小時(shí)。同時(shí)，取50 yL菌 液測(cè)量微生物濃度上述培育1小時(shí)后的細(xì)菌然后在8000rp離心10min，再用5ml PBS分別 清洗三次。清洗過(guò)得細(xì)菌菌斑在冰浴條件下，超聲16分鐘。超聲的輸出功率為200瓦，100 個(gè)循環(huán)操作過(guò)程。微生物被破碎之后，用離心機(jī)8000rp離心10min。上清液的熒光強(qiáng)度用 日立熒光光譜儀測(cè)量。海藻糖熒光探針在上清液中的濃度通過(guò)其標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量。
[0063] 用疊氮化鈉處理大腸桿菌（Escherichia coli，EC)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus，SA)。5ml LB 培養(yǎng)基中的微生物的 0D600 = 0· 5,加入 50 μ L 的 疊氮化鈉（IM)，在搖床中培育1小時(shí)，其用PBS清洗三次，失活細(xì)菌用于熒光探針的的對(duì)照 控制實(shí)驗(yàn)。
[0064] 實(shí)施例9.海藻糖標(biāo)記磁性納米顆粒探針對(duì)于大腸桿菌檢測(cè)
[0065] 海藻糖標(biāo)記磁性納米顆粒探針合成：0.1 g氨基鉸鏈的海藻糖與0.1 g羧基修飾的 磁性顆?；旌?，然后加入N-羥基琥珀酰亞胺（40m Μ)和1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳 二亞胺鹽酸鹽（l〇m M)，反應(yīng)兩個(gè)小時(shí)，用磁鐵分離清洗三次，既可以得到海藻糖標(biāo)記磁性 納米顆粒探針。
[0066] 大腸桿菌菌斑重懸浮到30ml的PBS緩沖液中，紫外分光光度計(jì)（波長(zhǎng)為600nm) 測(cè)量其OD值為0. 5。而后將大腸桿菌懸浮液轉(zhuǎn)移到IOml離心管中，每個(gè)離心管加入5ml 的菌懸液，然后加入100 μ L海藻糖標(biāo)記磁性納米顆粒探針（lm Μ)，最終熒光探針的濃度為 20 μ M0
[0067] 大腸桿菌在30度條件下，搖床的轉(zhuǎn)速為250rpm，培養(yǎng)1小時(shí)。同時(shí)，取50 yL菌 液測(cè)量微生物濃度上述培育1小時(shí)后的細(xì)菌然后在8000rp離心10min，再用5ml PBS分別 清洗三次。清洗過(guò)得細(xì)菌菌斑在冰浴條件下，超聲16分鐘。超聲的輸出功率為200瓦，100 個(gè)循環(huán)操作過(guò)程。微生物被破碎之后，用離心機(jī)8000rp離心10min。上清液的熒光強(qiáng)度用 日立熒光光譜儀測(cè)量。海藻糖標(biāo)記磁性納米顆粒探針在上清液中的濃度通過(guò)其標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè) 量。
[0068] 用疊氮化鈉處理大腸桿菌（Escherichia coli，EC)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus，SA)。5ml LB 培養(yǎng)基中的微生物的 0D600 = 0· 5,加入 50 μ L 的 疊氮化鈉（IM)，在搖床中培育1小時(shí)，其用PBS清洗三次，失活細(xì)菌用于熒光探針的的對(duì)照 控制實(shí)驗(yàn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種小分子標(biāo)記探針，其特征在于：熒光探針的識(shí)別單元為糖類活性功能的小分子 記 D2. 按權(quán)利要求1所述的小分子標(biāo)記探針，其特征在于：所述具有糖類活性功能的小分 子標(biāo)記為棉籽糖、水蘇糖、海藻糖或花蕊糖。3. 按權(quán)利要求1所述的小分子標(biāo)記探針，其特征在于：將所述小分子標(biāo)記與量子點(diǎn)、磁 性顆粒、熒光素或納米金交聯(lián)即得探針。4. 按權(quán)利要求3所述的小分子標(biāo)記探針，其特征在于：所述量子點(diǎn)為核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn) (CdSe-Au核殼結(jié)構(gòu)）、稀土元素?fù)诫s的量子點(diǎn)或羧基修飾的量子點(diǎn)。5. 按權(quán)利要求3所述的小分子標(biāo)記探針，其特征在于：所述熒光素為羅丹明類、細(xì)胞色 素c類、AlexaFluor系列染料或異氰酸熒光素類。6. -種權(quán)利要求1所述的小分子標(biāo)記探針的應(yīng)用，其特征在于：利用所述小分子標(biāo)記 探針使其與微生物細(xì)胞特異性的結(jié)合，通過(guò)識(shí)別小分子標(biāo)記轉(zhuǎn)運(yùn)通道進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)和吸收，進(jìn) 而能夠?qū)ξ⑸锾禺愋缘姆治龊统上瘛?br>【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物的檢測(cè)和成像領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種小分子標(biāo)記探針及其應(yīng)用。熒光探針的識(shí)別單元為糖類活性功能的小分子標(biāo)記。利用所述小分子標(biāo)記探針使其與微生物細(xì)胞特異性的結(jié)合，通過(guò)識(shí)別小分子標(biāo)記轉(zhuǎn)運(yùn)通道進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)和吸收，進(jìn)而能夠?qū)ξ⑸锾禺愋缘姆治龊统上?。相?duì)于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫反應(yīng)吸附的測(cè)量或基于抗體的識(shí)別技術(shù)，利用這類糖類活性小分子信號(hào)系統(tǒng)來(lái)快速檢測(cè)和分析生物分子具有顯著的特異性，同時(shí)準(zhǔn)確性高。利用糖類活性功能小分子標(biāo)記熒光信號(hào)系統(tǒng)來(lái)快速檢測(cè)和分析微生物，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高，不容易失活，價(jià)格便宜等優(yōu)勢(shì)；同時(shí)，這類糖類活性功能小分子還可以在哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行活體成像。
【IPC分類】G01N21/64
【公開(kāi)號(hào)】CN105092552
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510522356
【發(fā)明人】萬(wàn)逸, 張盾
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院海洋研究所
【公開(kāi)日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年8月24日