一種快速檢測凝血酶的電化學(xué)適配體傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種電化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法，具體是利用金納米-甲?；溥蛐揎椷€原石墨烯和鈷鈀納米粒子構(gòu)建一種快速檢測凝血酶的夾心型電化學(xué)適配體傳感器，屬于新型功能材料及生物傳感分析技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]
凝血酶Tb是一種由凝血酶前體形成的蛋白質(zhì)水解酶，可以促使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，它是哺乳動物中普遍存在的一種絲氨酸蛋白質(zhì)，其增多會導(dǎo)致血栓的形成而減少則會導(dǎo)致出血。在臨床上，凝血酶適用于結(jié)扎止血困難的下血管、毛細(xì)血管以及實(shí)質(zhì)性臟器出血的止血，適用于外傷、手術(shù)、口腔、耳鼻喉、泌尿、燒傷、骨科等出血的止血。凝血酶的在生物體中的含量多少，會導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生。凝血酶在人體中的含量甚少，一般的檢測方法難以對其進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。
[0003]目前對于凝血酶的檢測，主要集中在應(yīng)用生物傳感器的方法，與文獻(xiàn)中所報(bào)道的各種檢測方法相比，本發(fā)明用于凝血酶的檢測具有選擇性好、靈敏度高、簡便快速等優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的凝血酶夾心型電化學(xué)適配體傳感器。
[0005]1.一種快速檢測凝血酶的電化學(xué)適配體傳感器的制備方法
(I)選擇巰基修飾的凝血酶捕獲探針Aptl和生物素修飾的凝血酶報(bào)告探針Apt2 ; (2)合成金納米粒子修飾的甲?；溱嘧揎椷€原石墨稀AuOGS-FI ;稱取質(zhì)量比為1:1 ~ 1.2的甲?；溥蛐揎椷€原石墨烯GS-FI和氯金酸，用水分散24 h，離心去除上清液，重新用水分散，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH < 2，攪拌至少30 min，逐滴加入40~60 mmol*L NaBH4S液至氯金酸全部還原，最后，離心并用超純水洗三次，在真空干燥箱中烘干；
(3)鈷鈀納米粒子CoPdNPs修飾的凝血酶報(bào)告探針CoPdNPs-Apt2的制備將3~5 mg、粒徑7~9 nm左右的鈷鈀納米粒子CoPdNPs，加入到1.5~2.5 mL濃度為0.05mol*L 1的十六烷基三甲基溴化銨CTMAB溶液中，超聲30 min，將油溶性的鈷鈀納米粒子CoPdNPs改性為水溶性，離心除去多余的十六烷基三甲基溴化銨CTMAB，將離心后的鈷鈀納米粒子CoPdNPs重新分散于pH 7.4的PBS緩沖溶液中；向鈷鈀納米粒子CoPdNPs溶液中加Λ 80-120 yL的I mg*mL 1的親和素，37 °C下振蕩孵育120 min，離心除去未與鈷鈀納米粒子納米粒子CoPdNPs結(jié)合的親和素，制得親和素化的鈷鈀納米粒子CoPdNPs ;再向親和素化的鈷鈀納米粒子CoPdNPs溶液中加入80~120 μ L的10 μ g*mL 1生物素修飾的Apt2，在37 °(:下，振蕩孵育30 min，離心以除去未與鈷鈀納米粒子CoPdNPs結(jié)合的Apt2 ;重新分散于2 mL、pH 7.4的PBS緩沖溶液中，制得2 mg*mL 1的鈷鈀納米粒子CoPdNPs修飾的凝血酶報(bào)告探針CoPdNPs-Apt2溶液，儲存在4 °(:下備用；
(4)AuiGS-F1-Aptl/Tb/CoPdNPs-Apt2夾心型電化學(xué)適配體傳感器的制備O用氧化鋁粉對玻碳電極進(jìn)行預(yù)處理，無水乙醇超聲清洗，將電極置于5 mmol-L 1鐵氰化鉀溶液中，在-0.2?0.6 V電位下掃循環(huán)伏安，峰電位差小于110 mV ；
2)將金納米粒子修飾的甲?；溱嘧揎椷€原石墨稀AuiGS-FI超聲分散處理，制得分散性好的AuO GS-FI溶液；
3)將分散好的AuOGS-FI溶液滴涂到玻碳電極表面，置于紅外燈下烤干；
4)在電極上滴涂上凝血酶捕獲探針Aptl，置于4°C下晾干；
5)將6-巰基己醇滴涂電極上，置于4°C下晾干，用于封閉非特異性活性位點(diǎn)；
6)在電極上滴涂一定濃度的凝血酶，置于4°C下晾干；
7)滴涂鈷鈀納米粒子CoPdNPs修飾的凝血酶報(bào)告探針CoPdNPs-Apt2溶液，置于4°C下瞭干，制得AuO GS-F1-Aptl/Tb/CoPdNPs-Apt2電化學(xué)適配體傳感器。
[0006]2.凝血酶的測定
(1)將AuOGS-F1-Aptl/Tb/CoPdNPs-Apt2電化學(xué)適配體傳感器作為工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極，鉑絲電極作為對電極，連接到電化學(xué)工作站上；
(2)設(shè)置計(jì)時(shí)電流參數(shù)，測量電位為-0.4 V，在10 mL底液為pH 7.4的PBS緩沖溶液中測定，用微量注射器加入10 yL,5mol*L 1的H 202溶液，記錄計(jì)時(shí)電流信號；
(3)根據(jù)所測定的計(jì)時(shí)電流信號的變化值與凝血酶濃度的線性關(guān)系，繪制工作曲線。
[0007]本發(fā)明的有益成果
(I)本發(fā)明電化學(xué)適配體傳感器的第一層為AuOGS-FI，利用GS-FI大的比表面積和優(yōu)良的電子傳遞能力，以及金納米粒子比表面積大和良好的生物相容性，有效地提高了傳感器的靈敏度。
[0008](2)甲酰基咪卩坐修飾還原石墨稀GS-FI，活性基團(tuán)含量約為7.2wt%，固定生物分子效果優(yōu)異，含量非常高。
[0009](3)本發(fā)明在凝血酶報(bào)告探針上修飾了 CoPdNPs，其特征是利用了 Co、Pd的協(xié)同作用，對H2O2的催化能力更強(qiáng)，進(jìn)一步增強(qiáng)了電化學(xué)的響應(yīng)信號，從而降低了檢測的檢測限。
【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例1一種快速檢測凝血酶的電化學(xué)適配體傳感器的制備方法
(I)選擇巰基修飾的凝血酶捕獲探針Aptl和生物素修飾的凝血酶報(bào)告探針Apt2 ; (2)合成金納米粒子修飾的甲?；溱嘧揎椷€原石墨稀AuOGS-FI ;稱取質(zhì)量比為1:1的甲?；溥蛐揎椷€原石墨烯GS-FI和氯金酸，用水分散24 h，離心去除上清液，重新用水分散，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH < 2，攪拌至少30 min，逐滴加入40 mmol?L 1的NaBH4溶液至氯金酸全部還原，最后，離心并用超純水洗三次，在真空干燥箱中烘干；
(3)鈷鈀納米粒子CoPdNPs修飾的凝血酶報(bào)告探針CoPdNPs-Apt2的制備將3 mg、粒徑7 nm左右的鈷鈀納米粒子CoPdNPs，加入到1.5 mL濃度為0.05 mol.L1的十六烷基三甲基溴化銨CTMAB溶液中，超聲30 min,將油溶性的鈷鈀納米粒子CoPdNPs改性為水溶性，離心除去多余的十六烷基三甲基溴化銨CTMAB，將離心后的鈷鈀納米粒子CoPdNPs重新分散于pH 7.4的PBS緩沖溶液中；向鈷鈀納米粒子CoPdNPs溶液中加入80yL的I mg^mL1的親和素，37 °C下振蕩孵育120 min，離心除去未與鈷鈀納米粒子納米粒子CoPdNPs結(jié)合的親和素，制得親和素化的鈷鈀納米粒子CoPdNPs ;再向親和素化的鈷鈀納米粒子CoPdNPs溶液中加入80 μ L的10 μ g*mL 1生物素修飾的Apt2，在37 °(:下，振蕩孵育30 min，離心以除去未與鈷鈀納米粒子CoPdNPs結(jié)合的Apt2 ;重新分散于2 mL、pH7.4的PBS緩沖溶液中，制得2 mg*mL 1的鈷鈀納米粒子CoPdNPs修飾的凝血酶報(bào)告探針CoPdNPs-Apt2溶液，儲存在4 °(:下備用；
(4)AuiGS-F1-Aptl/Tb/CoPdNPs-Apt2夾心型電化學(xué)適配體傳感器的制備
O用氧化鋁粉對玻碳電極進(jìn)行預(yù)處理，無水乙醇超聲清洗，將電極置于5 mmol-L 1鐵氰化鉀溶液中，在-0.2?0.6 V電位下掃循環(huán)伏安，峰電位差小于110 mV ；
2)將金納米粒子修飾的甲?；溱嘧揎椷€原石墨稀AuiGS-FI超聲分散處理，制得分散性好的AuO GS-FI溶液；
3)將分散好的AuOGS-FI溶液滴涂到玻碳電極表面，置于紅外燈下烤干；
4)在電極上滴涂上凝血酶捕獲探針Aptl，置于4°C下晾干；
5)將6-巰基己醇滴涂電極上，置于4°C下晾干，用于封閉非特異性活性位點(diǎn)；
6)在電極上滴涂一定濃度的凝血酶，置于4°C下晾干；
7)滴涂鈷鈀納米粒子CoPdNPs修飾的凝血酶報(bào)告探針CoPdNPs-Apt2溶液，置于4°C下瞭干，制得AuO GS-F1-Aptl/Tb/CoPdNPs-Apt2電化學(xué)適配體傳感器。
[0011]實(shí)施例2 —種快速檢測凝血酶的電化學(xué)適配體傳感器的制備方法
(I)選擇巰基修飾的凝血酶捕獲探針Aptl和生物素修飾的凝血酶報(bào)告探針Apt2 ; (2)合成金納米粒子修飾的甲?；溱嘧揎椷€原石墨稀AuOGS-FI ;稱取質(zhì)量比為1:1 ~ 1.1的甲?；溥蛐揎椷€原石墨烯GS-FI和氯金酸，用水分散24 h，離心去除上清液，重新用水分散，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH < 2，攪拌至少30 min，逐滴加入50 mmol?L 1的NaBH4溶液至氯金酸全部還原，最后，離心并用超純水洗三次，在真空干燥箱中烘干；
(3)鈷鈀納米粒子CoPdNPs修飾的凝血酶報(bào)告探針CoPdNPs-Apt2的制備
將4 mg、粒徑8 nm左右的鈷鈀納米粒子CoPdNPs，加入到2.0 mL濃度為0.05 mol*L 1的十六烷基三甲基溴化銨CTMAB溶液中，超聲30 min,將油溶性的鈷鈀納米粒子CoPdNPs改性為水溶性，離心除去多余的十六烷基三甲基溴化銨CTMAB，將離心后的鈷鈀納米粒子CoPdNPs重新分散于pH 7.4的PBS緩沖溶液中；向鈷鈀納米粒子CoPdNPs溶液中加入100yL的I mg^mL1的親和素，37