六瓣紅大蒜酶解產(chǎn)物hplc指紋圖譜的建立方法
【專利說明】
[0001] 本發(fā)明得到"天津市農委重點項目（201302030)和天津師范大學應用開發(fā)研究基 金"資助。
技術領域
[0002] 本發(fā)明屬于天然植物分析技術領域，涉及天然植物指紋圖譜的構建方法，尤其是 寶坻"六瓣紅"大蒜高效液相色譜（HPLC)指紋圖譜的構建方法及其標準指紋圖譜。
【背景技術】
[0003] 大蒜)百合科蔥屬，二年生草本植物，食藥兼用，在世界范圍 內被廣泛種植。目前，我國是最大的大蒜生產(chǎn)國，國內種植大蒜69. 2萬公頃，占世界種植面 積的1/2左右，我國大蒜的總產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量3/4以上，產(chǎn)量1208. 8萬噸。大蒜作為人 們生活中必不可少的蔬菜和調味品，營養(yǎng)豐富，含有多種對人體有益的化學成分，包括其中 含硫揮發(fā)物43種，硫化亞磺酸(如大蒜素)酯類13種、氨基酸9種、肽類8種、糖苷類12種、 酶類11種等。大蒜鱗莖、幼苗及花莖均可食用。大蒜還具有較強的藥用價值，具有殺菌、消 炎、抗病毒、抗癌、降血脂等功效。
[0004] 寶坻特有品種"六瓣紅"大蒜，蒜頭致密緊實，一般每頭6瓣左右，單柱型圍座，無 加楔，無重瓣，蒜瓣潔白脆嫩，辛辣汁多味濃，易貯藏，耐運輸，抗病性較強，辣味柔和適口， 生、熟食用倶佳。"六瓣紅"大蒜以其優(yōu)良的農藝性狀、豐富的營養(yǎng)成分以及良好的口感，一 直保持著名優(yōu)特產(chǎn)的地位，深受國內外消費者喜愛，已遠銷日本、韓國及東南亞等多個國家 和地區(qū)。但由于品質管理技術落后，導致品種出現(xiàn)退化的跡象，成為制約這一名優(yōu)品種進一 步科學化、規(guī)模化發(fā)展的瓶頸。
[0005] 指紋圖譜技術已成為國際公認的控制中藥或天然藥物質量的最有效手段之一。它 可以較全面、準確、直觀的反映多種成分在中藥或其制劑中的分布，是一種綜合的、宏觀的 和可量化的鑒別方法。運用指紋圖譜技術，通過對指紋圖譜中主要特征峰的識別或比例的 測定，可以鑒別中藥材和中成藥的真?zhèn)?，有效評價產(chǎn)品質量的均一性和穩(wěn)定性。但是，迄今 為止，有關寶坻特有大蒜品種"六瓣紅"的指紋圖譜還未見報道。
[0006] 鑒于以上不足，有必要發(fā)明一種建立寶坻"六瓣紅"大蒜指紋圖譜的新方法，使之 能夠簡便、穩(wěn)定、可重復、全面、精確的評價"六瓣紅"大蒜的質量，從而既加強了對"六瓣紅" 大蒜真?zhèn)渭爱a(chǎn)地的鑒別能力，又能提高"六瓣紅"大蒜質量的全面評估和控制，彌補了現(xiàn)有 檢測方法的不足，使之更加科學、完善。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術問題是針對現(xiàn)有寶坻"六瓣紅"大蒜品質管理檢測方法的不 足，而提供一種"六瓣紅"大蒜HPLC指紋圖譜的建立方法。該方法通過將大蒜制備成酶解產(chǎn) 物待測溶液，經(jīng)固相萃取技術分離濃縮，再經(jīng)由高效液相色譜儀分析檢測，獲得指紋圖譜， 為"六瓣紅"大蒜的真?zhèn)舞b別以及品質控制提供可靠依據(jù)和技術方法。
[0008] 本發(fā)明寶坻"六瓣紅"大蒜酶解產(chǎn)物HPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在于：該方 法按如下的步驟進行： (1) 大蒜酶解產(chǎn)物待測溶液的制備：稱取寶坻"六瓣紅"大蒜鱗莖20g破碎、研磨，加 25-30ml蒸餾水，50-55°C溫浴酶解lh，加甲醇定容至50ml，5000 X g離心15min，取上清液經(jīng) 0. 45 μ m微孔濾膜過濾； (2) 大蒜酶解產(chǎn)物供試品溶液的制備：C18固相萃取小柱經(jīng)5ml甲醇、IOml超純水活化， 平衡15min ;待測溶液以4ml/min速度過柱，再用5ml超純水淋洗，低真空抽干；再由5ml甲 醇洗脫后，室溫下低流速氮氣濃縮至〇. 5-0. 8ml，再以甲醇定容至Iml，經(jīng)0. 45 μ m微孔濾膜 過濾待測； (3) 參照物溶液的制備：稱取二烯丙基二硫醚30. 44 mg和二烯丙基三硫醚32. 12 mg， 溶于甲醇中定容至50ml，再吸取上述混合溶液Iml用甲醇定容至10ml，作為參照物； (4) 高效液相色譜分析：色譜柱為：Eclipse Plus C18,5 ym，4.6x250mm;保護柱為： Eclipse Plus C18 Grd，5 μ m，4.6x12. 5mm;柱溫 35°C;流動相為甲醇和 0.2% 甲酸水溶液； 采用梯度淋洗方式 〇 - 2 min - 10 min - 20 min，甲醇：70% - 70% - 80% - 80% ;二極管 陣列檢測器檢測波長240nm ;進樣量50 μ L ;在上述條件下分析供試品溶液，得到大蒜酶解 產(chǎn)物HPLC指紋圖譜； 本發(fā)明還提供上述大蒜酶解產(chǎn)物HPLC指紋圖譜得到的"六瓣紅"大蒜解產(chǎn)物HPLC標 準指紋圖譜。
[0009] 將10批次"六瓣紅"大蒜樣品按上述方法制備成供試品溶液，由上述方法分離檢 測，使用國家藥典委員會的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004版》軟件分析，得到 "六瓣紅"大蒜標準指紋圖譜。該方法確定了 14個共有特征峰，其保留時間分別為：2. 243 min、2.991 min、3. 423 min、3. 871 min、4. 731 min、5.993 min、6.629 min、7. 168 min、8. 151 min、9.295 min、10.824 min、13.344 min、15.65 min、18.723 min，相對標準偏差（RSDX2%， 這些共有特征峰構成了寶坻"六瓣紅"大蒜酶解產(chǎn)物HPLC標準指紋圖譜。
[0010] 本發(fā)明公開的寶坻"六瓣紅"大蒜酶解產(chǎn)物HPLC指紋圖譜的建立方法與現(xiàn)有技術 相比所具有關鍵之處在于： (1) 樣品前處理簡便，易于操作，采用固相萃取技術對樣品進行預分離濃縮，得到的供 試品溶液所含雜質少，不污染色譜柱，對色譜圖信號干擾??； (2) 色譜條件簡便易行，重現(xiàn)性好； (3) 本發(fā)明能夠最大程度上提取大蒜鱗莖酶解后的含硫化合物，在此基礎之上建立的 HPLC指紋圖譜對"六瓣紅"大蒜品質控制更具針對性和實用性。
[0011] (4)本發(fā)明色譜體系下各色譜峰分離較好，不僅能從整體上識別"六瓣紅"大蒜化 學成分的特點，也能對如二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚等化合物進行定性定量分析。
[0012] (5)本發(fā)明分析效率高，穩(wěn)定性好，特異性強，重現(xiàn)性好，特征峰較多，利用本發(fā)明 能對寶坻"六瓣紅"大蒜進行真?zhèn)渭爱a(chǎn)地鑒別，并能全面、準確地評價其內在品質質量。
[0013]
【附圖說明】： 圖1是"六瓣紅"大蒜HPLC指紋圖譜； 圖2是參照物HPLC圖譜；1:二烯丙基二硫醚，2:二烯丙基三硫醚； 圖3是"六瓣紅"大蒜HPLC標準指紋圖譜。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合實施例說明本發(fā)明，這里所述實施例的方案，不限制本發(fā)明，本領域的專 業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應視為在本 發(fā)明的范圍內，本發(fā)明的范圍和實質由權利要求來限定。所用各種原料均有市售。
[0015] 實施例1 : 寶坻"六瓣紅"大蒜酶解產(chǎn)物HPLC指紋圖譜的建立方法，該方法步驟如下： (1) 樣品、試劑盒儀器：寶坻"六瓣紅"大蒜，使用安捷倫1200型高效液相色譜儀，試劑 均為色譜純或分析純； (2) 大蒜酶解產(chǎn)物待測溶液的制備：稱取寶坻"六瓣紅"大蒜鱗莖20g破碎、研磨，加 25-30ml蒸餾水，50-55°C溫浴酶解lh，加甲醇定容至50ml，5000 X g離心15min，取上清液經(jīng) 0. 45 μ m微孔濾膜過濾； (3) 大蒜酶解產(chǎn)物供試品溶液的制備：C18固相萃取小柱經(jīng)5ml甲醇、IOml超純水活化， 平衡15min ;待測溶液以4ml/min速度過柱，再用5ml超純水淋洗，低真空抽干；再由5ml甲 醇洗脫后，室溫下低流速氮氣濃縮至〇. 5-0. 8ml，再以甲醇定容至Iml，經(jīng)0. 45 μ m微孔濾膜 過濾待測； (4) 參照物溶液的制備：稱取二烯丙基二硫醚30. 44 mg和二烯丙基三硫醚32. 12 mg， 溶于甲醇中定容至50ml，再吸取上述混合溶液Iml用甲醇定容至10ml，作為參照物； (5) 高效液相色譜分析：色譜柱為：Eclipse Plus C18,5 ym，4.6x250mm;保護柱為： Eclipse Plus C18 Grd，5 μ m，4.6x12. 5mm;柱溫 35°C;流動相為甲醇和 0.2% 甲酸水溶液； 采用梯度淋洗方式 〇 - 2 min - 10 min - 20 min，甲醇：70% - 70% - 80% - 80% ;二極管 陣列檢測器檢測波長240nm ;進樣量50 μ L。
[0016] 分別精密吸取各供試品液溶液，在上述色譜條件下經(jīng)高效液相色譜儀分離檢測， 得到寶坻"六瓣紅"大蒜HPLC指紋圖譜，見圖1，按相同實驗條件分析參照物溶液得到圖 譜，見圖2。
[0017] 實施例2: 寶坻"六瓣紅"大蒜酶解產(chǎn)物HPLC標準指紋圖譜的建立方法，該方法步驟如下： (1) 樣品、試劑盒儀器：寶坻"六瓣紅"大蒜共10批次，使用安捷倫1200型高效液相色 譜儀，試劑均為色譜純或分析純； (2) 大蒜酶解產(chǎn)物待測溶液的制備：稱取寶坻"六瓣紅"大蒜鱗莖20g破碎、研磨，加 25-30ml蒸餾水，50-55°C溫浴酶解lh，加甲醇定容至50ml，5000 X g離心15min，取上清液經(jīng) 0. 45 μ m微孔濾膜過濾； (3) 大蒜酶解產(chǎn)物供試品溶液的制備：C18固相萃取小柱經(jīng)5ml甲醇、IOml超純水活化， 平衡15min ;待測溶液以4ml/min速度過柱，再用5ml超純水淋洗，低真空抽干；再由5ml甲 醇洗脫后，室溫下低流速