檢測dna甲基化的方法和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及檢測DNA甲基化的方法和試劑盒。具體地說，本發(fā)明涉及用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法檢測DNA甲基化的方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002]DNA甲基化發(fā)生在CpG 二核苷酸中胞嘧啶的5’碳原子上，在人類癌癥中廣泛存在，是表觀遺傳學的重要研究對象[I]。DNA甲基轉移酶(DNMT)負責胞嘧啶的甲基共價修飾
[2]。在DNMT家族中，DNMTl主要負責維持DNA甲基化程度，例如在DNA復制時，對新生DNA鏈進行甲基化修飾[3] ;DNMT3a和DNMT3b主要負責從無到有的對DNA進行甲基化修飾[4，5]。DNA甲基化的信息在細胞分裂過程中能夠穩(wěn)定的傳遞，對于器官的發(fā)育和行使功能、Z染色體的失活、基因組印記(imprinting)、轉座子等的沉默以及基因的適度表達等發(fā)揮重要作用[6]。
[0003]在癌細胞中，基因組整體表現(xiàn)出甲基化程度降低的現(xiàn)象[7];而在特定的區(qū)域表現(xiàn)出甲基化程度升高，同一些基因的轉錄沉默相關[8]。DNA甲基化程度已成為新一代的腫瘤標志物，原則上可以用于癌癥的早期檢測、預后評估、療效監(jiān)測等方面[9]。
[0004]在用于研究DNA整體甲基化程度的方法中，高效液相色譜(HPLC)是一種經(jīng)典的方法[10]，能夠進行定量分析，可重復性強。然而這一方法所需的基因組DNA用量比較大，對DNA的質量要求也比較高，不適宜用于高通量分析。也有以亞硫酸氫鈉處理為基礎的方法，檢測重復序列(例如Alu元件或LINE)的含量[11，12]。但是這類方法的操作步驟比較繁瑣。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法，對來源于細胞、組織、血清中DNA的整體甲基化程度進行測定，操作簡單，重復性好，DNA用量少(可檢測至ng級)，定量計算方便，能夠實現(xiàn)高通量檢測。
[0006]具體的說，本發(fā)明涉及一種檢測DNA甲基化的方法，其包括:
[0007](I)提取、限制性內切酶處理、純化基因組DNA ；
[0008](2)將DNA變性后加入封閉液；
[0009](3)用抗甲基胞嘧啶抗體包被ELISA實驗板；
[0010](4)棄去包被抗體，在實驗板的每個孔中加入封閉液；
[0011 ] (5)棄去封閉液，加入預混的封閉液與DNA樣品；
[0012](6)用PBS溶液清洗，干燥后加入抗單鏈DNA抗體；
[0013](7)用PBS溶液清洗，干燥后加入二抗；
[0014](8)用PBS溶液清洗，干燥后加入TMB底物；
[0015](9)加入硫酸溶液后用酶標儀讀數(shù)；
[0016](10)根據(jù)用基因組DNA標準品制得的標準曲線，計算出樣本的相對DNA甲基化程度。
[0017]優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，所述限制性內切酶是MseI ;所述封閉液是PBS+3%BSA+0.05% Triton X-100 ;所述抗甲基胞嘧啶抗體是Santa Cruz#sc_56615，其濃度是I?10 μ g/mL,優(yōu)選5 μ g/mL ;所述抗單鏈DNA抗體是IBL code#18731，其濃度是0.1?I μ g/mL,優(yōu)選0.5 μ g/mL ;所述二抗是偶聯(lián)辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)的抗兔源IgG的抗體；所述TMB底物是PIERCE#34028。
[0018]本發(fā)明還涉及一種檢測DNA甲基化的試劑盒，其包括:
[0019](I)封閉液；
[0020](2)抗甲基胞嘧啶抗體；
[0021 ] (3)抗單鏈DNA抗體；
[0022](4) 二抗；
[0023](5) TMB 底物；
[0024](6) 2M硫酸；以及
[0025](7) PBS 溶液。
[0026]優(yōu)選地，在本發(fā)明的試劑盒中，所述封閉液是PBS+3% BSA+0.05% Triton X-100 ；所述抗甲基胞啼唆抗體是Santa Cruz#sc_56615,其濃度是I?10 μ g/mL,優(yōu)選5 μ g/mL ;所述抗單鏈DNA抗體是IBL code#18731，其濃度是0.1?I μ g/mL,優(yōu)選0.5 μ g/mL ;所述二抗是偶聯(lián)辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)的抗兔源IgG的抗體；所述TMB底物是PIERCE#34028。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒用于對癌組織進行化療療效預測，并且優(yōu)選用于對血清進行檢測。
【附圖說明】
[0027]圖1顯示在來源于不同樣本的DNA中，DNA相對甲基化程度與DNA濃度無顯著相關性。
[0028]圖2顯示經(jīng)甲基轉移酶抑制劑處理后DNA相對甲基化程度顯著降低。
[0029]圖3顯示相對甲基化程度測定的飽和曲線。
[0030]圖4顯示相對甲基化程度測定的標準曲線。
[0031]圖5顯示肺癌組織相對于癌旁正常組織的DNA相對甲基化程度顯著下降(非成對檢驗)。
[0032]圖6顯示肺癌組織相對于癌旁正常組織的DNA相對甲基化程度顯著下降(成對檢驗)。
[0033]圖7顯示肺癌患者癌組織相對甲基化程度隨年齡增高而下降。
[0034]圖8顯示肺癌患者癌組織相對甲基化程度在吸煙患者中有下降趨勢。
[0035]圖9顯示肺癌患者癌組織相對甲基化程度隨癌癥分期升高而顯著下降。
[0036]圖10顯示肺癌患者(I1、II1、IV期)癌組織相對于正常肺組織的相對甲基化程度的受試者作業(yè)特征曲線(ROC)分析。
[0037]圖11顯示在接受化療的肺癌患者中，癌組織的相對甲基化程度對患者總體生存率的影響。
[0038]圖12顯示在甲基化程度高的肺癌患者中，接受化療與否對患者總體生存率的影響。
[0039]圖13顯示癌癥患者相對于健康對照的血清中DNA相對甲基化程度顯著升高。
[0040]圖14顯示癌癥患者血清中DNA相對甲基化程度與年齡無顯著相關性。
[0041]圖15顯示癌癥患者血清中DNA相對甲基化程度與性別無顯著相關性。
[0042]圖16顯示健康對照與癌癥患者血清中DNA相對甲基化程度比較。
[0043]圖17顯示癌癥患者血清中DNA相對甲基化程度隨癌癥分期升高而顯著上升。
[0044]圖18顯示癌癥患者相對于健康對照的血清中DNA相對甲基化程度的受試者作業(yè)特征曲線(ROC)分析。
[0045]圖19顯示男性癌癥患者相對于男性健康對照的血清中DNA相對甲基化程度的受試者作業(yè)特征曲線(ROC)分析。
[0046]圖20顯示女性癌癥患者相對于女性健康對照的血清中DNA相對甲基化程度的受試者作業(yè)特征曲線(ROC)分析。
【具體實施方式】
[0047]實驗步驟
[0048]樣品處理:纟目織某因纟目DNA提取俅用QIAanro DNA Mini Kit (Qiagen)。測定濃度后，使用MseI限制性內切酶處理(37°C放置2小時)后使用DNA純化試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)純化DNA。測定DNA濃度后，將DNA稀釋至10?50ng/ μ L，95°C變性10分鐘，立即冰上放置。取I μ L與49 μ LI X封閉液(PBS+3% BSA+0.05% Triton X-100)混合，冰上放置。
[0049]血清/ 血漿(200 μ L)基因組 DNA 提取使用 QIAamp DNA Blood Kit (Qiagen)，用45 μ L水洗脫。95°C變性10分鐘，立即冰上放置。加入5 μ LlOX封閉液混合，冰上放置。
[0050]夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定^LISA)實驗步驟:用抗甲基胞嘧啶抗體(SantaCruz#sc-56615,5y g/mL)包被ELISA實驗板，每孔加入50 μ L。覆蓋平板，4°C過夜放置。次日棄去包被抗體，用 PBS 溶液(0.2g/L KH2PO4, 2.16g/L Na2HPO4.7Η20，0.2g/L KC1，8.0g/LNaCl)洗兩遍,每次每孔使用200 μ L,拍干。每孔中加入200 μ L封閉液,室溫放置2小時。隨后棄去封閉液。每孔加入預混的49 μ L封閉液與I μ LDNA樣品。4°C放置至少2小時。使用PBS洗兩遍，拍干。將抗單鏈DNA抗體(IBL code#18731,0.5 μ g/mL)加入96孔ELISA實驗板的孔中，每孔加入lOOyL。覆蓋平板，室溫放置2小時。使用PBS洗四遍，拍干。將二抗(I:4000稀釋)加入96孔ELISA實驗板的孔中，每孔加入100 μ L0覆蓋平板，室溫放置I至2小時。使用PBS洗四遍，拍干。每孔加入100 μ LTMB底物溶液(PIERCE#34028)。3?10分鐘后，加入2M硫酸溶液，混勻后用酶標儀讀數(shù)(波長選擇為450nm)。
[0051]相對甲基化程度計算:提取人非小細胞肺癌細胞系A549的基因組DNA，MseI酶切處理、純化后測定DNA濃度，稀釋為5、10、20、40即/^14示準品，再按上述步驟進行后續(xù)實驗。ELISA實驗讀數(shù)后，將標準品和樣本吸光度(OD)數(shù)據(jù)減去不合任何DNA樣品的實驗孔數(shù)據(jù)(即去本底)，利用標準品去本底數(shù)據(jù)作出標準曲線(DNA含量為橫坐標，去本底OD值為縱坐標)，將樣本的去本底數(shù)據(jù)代入標準曲線的線性擬合公式中，計算出每個樣本中相對DNA甲基化程度。對于組織樣本，還需將該數(shù)值除以加樣DNA含量，計算出每ng組織DNA中的相對甲基化程度。
[0052]實驗數(shù)據(jù):
[0053]1.選取多個不同的組織樣本，測定其DNA濃度，之后測定等體積樣本的相對甲基化程度，Pearson相關性系數(shù)r為0.1853，P值為0.6084 > 0.05,說明不同樣本DNA的相對甲基化程度與其DNA濃度/含量無顯著相關性(見圖1)。
[0054]2.使用I μ M甲基化酶抑制劑5-氮雜(aza) _2’_脫氧胞苷(DAC)或等體積溶劑二甲基亞砜(DMSO)處理A549細胞2天后，提取細胞DNA測定DNA相對甲基化程度/ng。DAC處理后細胞相對于DMSO處理后細胞的相對甲基化程度顯著降低(P = 0.0206)(見圖2)。
[0055]3.將A549細胞基因組DNA稀釋為不同濃度，加入實驗體系中，使最終含量分別為0、4、8、16、32、64、80、120、160、200即，將0嫩含量作為橫坐標，測得的相對甲基化程度作為縱坐標作圖顯示:曲線在10ng前后呈現(xiàn)飽和，而低至4ng依然可以檢測出(見圖3)。
[0056]4.將A549細胞基因組DNA稀釋為不同濃度，加入實驗體系中，使最終含量分別為0、4、8、16、32、64、80即，將0嫩含量作為橫坐標，測得的相對甲基化程度作為縱坐標，作直線擬合，得到標準曲線。R2 = 0.9929，表明擬合直線的線性關系良好(見圖4)。
[0057]5.檢測46例肺癌組織樣本和46例癌旁正常組織樣本DNA的相對甲基化程度/ng，非成對數(shù)據(jù)檢驗結果顯示癌組織相對于癌旁正常組織DNA相對甲基化程度顯著下降(P =0.0263)(見圖 5) ο
[0058]6.檢測46例肺癌組織樣本和各自對應的