專利名稱：一種快速檢測(cè)dna甲基化的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種快速檢測(cè)DNA甲基化的試劑盒及 方法。
背景技術(shù)：
DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)的重要組成部分，是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶 (DNMTs)的作用下使CpG 二核苷酸5’端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’甲基胞嘧啶。哺乳動(dòng)物中，CpG 序列在基因組中出現(xiàn)的頻率僅有1 %，但在基因組的某些區(qū)域中，通常位于基因的啟動(dòng)子區(qū) 或是第一個(gè)外顯子區(qū)，CpG序列密度很高，可以達(dá)均值的5倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的 富集區(qū)，形成所謂的CpG島。DNA甲基化在人的正常發(fā)育、X染色體失活、衰老以及許多人類 疾病(如發(fā)育畸形、癌癥、心血管疾病、糖尿病和神經(jīng)心理失調(diào)等)發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作 用。甲基化的研究熱點(diǎn)之一是甲基化與腫瘤的關(guān)系。甲基化狀態(tài)的改變是引起腫瘤 的一個(gè)重要因素，這種變化包括基因組整體甲基化水平降低和CpG島局部甲基化水平的異 常升高，從而導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定(如染色體的不穩(wěn)定、可移動(dòng)遺傳因子的激活、原癌基因 的表達(dá))和抑癌基因的不表達(dá)。目前腫瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。這是因?yàn)槿?們發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生可能與抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島甲基化造成抑癌基因關(guān)閉有關(guān)。由 于CpG島的局部高度甲基化早于細(xì)胞的惡性增生，因此甲基化的診斷可以用于腫瘤發(fā)生 的早期預(yù)測(cè)。如Uhlmarm等發(fā)現(xiàn)不同病理類型及不同惡性程度的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的7種 腫瘤標(biāo)志基因存在著不同程度的甲基化[Uhlmann K, Rohde K, Zeller C, etal. Distinct methylationprofiles of glioma subtypes. [J]Int Cancer,2003, Aug. 10,106 (1) 52-59]，因此，甲基化的研究，為腫瘤的早期預(yù)測(cè)、分類、分級(jí)及預(yù)后評(píng)估提供了新的依據(jù)?；蚣谆瘷z測(cè)主要分為基因組整體水平的甲基化檢測(cè)、基因特異位點(diǎn)甲基化 的檢測(cè)，兩種水平檢測(cè)方法有多種，絕大多數(shù)方法檢測(cè)原理都要通過(guò)重亞硫酸氫鹽對(duì)DNA 樣品的修飾，使未甲基化修飾的胞嘧啶發(fā)生脫氨基反應(yīng)，變?yōu)榛腔蜞奏?，最后在氫氧化鈉 的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化胞嘧啶不發(fā)生脫氨基反應(yīng)，胞嘧啶保持不變。通過(guò)PCR或 其它方法就能對(duì)甲基化與非甲基化的CpG島進(jìn)行檢測(cè)加以區(qū)別。重亞硫酸氫鹽的修飾效果和效率直接影響到甲基化檢測(cè)的準(zhǔn)確性和效率，傳統(tǒng)的 重亞硫酸氫鹽對(duì)DNA樣品的修飾過(guò)程包括1. DNA提取按常規(guī)方法，酚氯仿法(詳見莎姆布魯克著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)需 要1 2天時(shí)間，或試劑盒法(見本公司產(chǎn)品，植物SK1203、SK1207、SK1209 ；動(dòng)物:SK1205 ； 血液:SK1260 ；通用:SK1251)，需要2 5小時(shí)。2.重亞硫酸氫鹽修飾(1)將約2ug DNA于1. 5ml EP管中使用DDW稀釋至50ul ；(2)加 5. 5ul 新鮮配制的 3M NaOH, 42°C水浴 30min ；(3)加30ul IOmM對(duì)苯二酚(氫醌)至上述水浴后混合液中；
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(4)加520ul 3. 6M亞硫酸氫鈉PH 5. 0，至上述水浴后溶液中，EP管外裹以鋁箔紙， 避光，輕柔顛倒混勻溶液；(5)加200ul石蠟油，防止水分蒸發(fā)，限制氧化。50°C避光水浴16 18h ；(6)將上述DNA修飾混合在4°C下用DDW透析過(guò)夜法純化或使用PromegaWizard Cleanup DNA純化回收系統(tǒng)(Promega，A7280)純化(約還需操作5步，用時(shí)1小時(shí)以上)；(7)加IOM的氫氧化鈉至透析純化產(chǎn)物，使其終濃度為0. 3M室溫放置20分鐘，再 加入等當(dāng)量的IM的HCl和NaOH，使磺化尿嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぁ?8)加入1/4體積的IOM乙酸銨和2倍的無(wú)水乙醇_20°C沉淀過(guò)夜。(9) 12000rpm離心5分鐘，去上清，75%的乙醇洗滌2次，干燥20分鐘，加20ul DDff 或TE就得到需要的重亞硫酸氫鹽修飾過(guò)的DNA模板。這種傳統(tǒng)的DNA修飾方法主要存在幾個(gè)方面的不足(I)DNA需要量在1 2ug，在臨床診斷中需要較大量的待測(cè)人血液或組織，給待測(cè) 人帶來(lái)不必要的痛苦。(2)操作繁鎖，必須先提取DNA，再進(jìn)行DNA修飾，特別是在亞硫酸氫鹽修飾過(guò)程需 要16 18h ；純化和脫磺基步驟也很長(zhǎng)時(shí)間，嚴(yán)重影響了工作效率，并且，容易造成污染。(3) 50°C低溫修飾16 18h，并不能充分地進(jìn)行修飾，因?yàn)榇藴囟认?，DNA超螺旋結(jié) 構(gòu)不可能打開，造成修飾不完成，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性不高。(4)目前，市場(chǎng)上有各類的甲基化檢測(cè)試劑盒，如美國(guó)GENMED SCIENTIFICSINC 生產(chǎn)的試劑盒有14種溶液，操作步驟多達(dá)30多步，相當(dāng)繁瑣；Zymo公司生產(chǎn)的EZ DNA Methylation-Gold Kit雖然操作簡(jiǎn)便，但價(jià)格昂貴，并且每次處理的DNA量只夠做2 3次 PCR。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)DNA甲基化的試劑盒及方法，具有靈敏度更高，處理 更快捷的特點(diǎn)。本發(fā)明實(shí)行DNA提取和DNA修飾同步完成，省略了 DNA提取和DNA修飾過(guò)程中的 多步分離、純化步驟，整個(gè)過(guò)程在2個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比做了以下四個(gè)方面的改進(jìn)1. DNA提取和DNA修飾同步完 成；2.修飾液中添加硫化促進(jìn)劑MBT和異硫氰酸胍，快速完成DNA提取和修飾過(guò)程；3.修飾 反應(yīng)采用短時(shí)間高溫處理方法，使DNA呈解鏈狀態(tài)，以充分暴露堿基，將未甲基化修飾的胞 嘧啶轉(zhuǎn)化為磺化尿嘧啶；4.對(duì)修飾后繁瑣的透析脫鹽步驟進(jìn)行簡(jiǎn)化處理將修飾處理后的 產(chǎn)物轉(zhuǎn)到核酸純化柱中，再用清理液(去磺化)處理后洗脫，得到檢測(cè)基因的甲基化PCR的 DNA模板。本發(fā)明首先提供了一種檢測(cè)DNA甲基化的試劑盒，包括修飾液、清理液和洗滌液。所述修飾液包括如下組分亞硫酸氫鈉4-6M，亞硫酸氫銨3-7M，氫醌3_7mM，硫化 促進(jìn)劑l_5mM，異硫氰酸胍2. 5-5. 5M和緩沖液。較佳的，所述硫化促進(jìn)劑為MBT(2_硫醇基苯駢噻唑)，所述緩沖液為pH5-6的 40-60mM Tris-HCl。所述清理液包括如下組分乙醇30-50 % (體積百分比濃度)、氫氧化鈉300-500mM 和氯化鈉 200_400mM。所述洗滌液包括如下組分pH 6. 8的5_15mM Tris,乙醇65-85% (體積百分比濃 度)。所述修飾液、清理液和洗滌液的溶劑均為水。本發(fā)明的檢測(cè)DNA甲基化的試劑盒可用于從樣本細(xì)胞中提取DNA，并將未甲基化 修飾的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化修飾的胞嘧啶保持不變。利用本發(fā)明檢測(cè)DNA甲基化的試劑盒同步完成DNA提取和亞硫酸氫鹽修飾，回收 產(chǎn)物可用作為測(cè)序法或甲基化特異性的PCR法的PCR模板。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)DNA甲基化的方法，包括下列步驟1.將適當(dāng)數(shù)量的樣本細(xì)胞與前述修飾液混合完成細(xì)胞裂解后高溫處理；2.將修飾液處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)到核酸純化柱中；3.先用清理液去磺化處理，再用前述洗滌液洗滌核酸純化柱后洗脫，收集洗脫 液；4.以洗脫液中的DNA為模板，采用亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法(bisulfite-PCR， BSP)或甲基化特異性的PCR法(Methylation-Specific PCR, MSP)檢測(cè)DNA甲基化。所述核酸純化柱優(yōu)選UNIQ-10核酸純化柱(SD5005)。所述洗脫液選自雙蒸水或TE。所述步驟1修飾反應(yīng)過(guò)程采用短時(shí)間高溫處理方法，使DNA呈解鏈狀態(tài)，以充分暴 露堿基，將未甲基化修飾的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為磺化尿嘧啶。步驟3將磺化尿嘧啶去磺化轉(zhuǎn)變?yōu)?尿嘧啶。所述步驟1中的高溫處理方法為98"C 20 秒一90°C 20 分鐘一70°C 5 分鐘一4°C保溫。所述步驟4可使用10次以上。所述的亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法和甲基化特異性的PCR法是用于甲基化檢測(cè)最 為廣泛的方法。BSP法是以亞硫酸氫鹽修飾后的DNA為模板在待測(cè)CpG島兩端設(shè)計(jì)引物，通 過(guò)PCR擴(kuò)出目的序列，直接測(cè)序或克隆測(cè)序，克隆測(cè)序可用于定量檢測(cè)；MSP法也是以亞硫 酸氫鹽修飾后的DNA為模板做PCR，但引物設(shè)計(jì)位置不一樣，在待測(cè)CpG島甲基化區(qū)域設(shè)計(jì) 兩對(duì)引物，分別是甲基化特異性的(primer I)和非甲基化的引物(primerll)。如果甲基化 引物能擴(kuò)增出片段，則說(shuō)明該被檢測(cè)的位點(diǎn)存在甲基化，若用針?lè)羌谆疍NA鏈的引物擴(kuò) 增出片段，則說(shuō)明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化，MSP法用于定性檢測(cè)，對(duì)于單個(gè)位點(diǎn)的甲基 化區(qū)域容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。具體的，所述檢測(cè)DNA甲基化的方法可包括下列步驟(1)收集的細(xì)胞IO3 IO5個(gè)直接加入修飾液按前述高溫處理方法處理；(2)將修飾液處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)到UNIQ-10核酸純化柱，離心，棄收集管廢液。(3)加清理液到UNIQ柱中，室溫靜置lOmin，離心，棄收集管廢液。(4)加入洗滌液UNIQ柱中，離心，棄收集管廢液。重復(fù)洗滌一次(5)加入雙蒸水或TE，離心收集洗脫液。本發(fā)明的基因甲基化檢測(cè)試劑盒及方法價(jià)廉、高效、快速、高重復(fù)性，相比傳統(tǒng)方 法的不足，做了多方面的改進(jìn)
1、試劑盒組成更加簡(jiǎn)單，只有3種配制的溶液2、試劑盒操作更加簡(jiǎn)便，實(shí)行DNA提取和修飾同步進(jìn)行，節(jié)省DNA提取的耗時(shí)耗 材，同時(shí)，減少操作步驟，可以極大程度地避免交叉污染。本試劑盒修飾液既是DNA修飾液， 也是細(xì)胞裂解和DNA提取液。修飾液中添加了 4M異硫氰酸胍，起到溶解蛋白、裂解細(xì)胞作 用，并促進(jìn)修飾的DNA與UNIQ柱中硅膠膜結(jié)合。3、操作方案采用高溫物理變性來(lái)取代以傳統(tǒng)方案中使用氫氧化鈉的化學(xué)變性，在 高溫條件下，DNA呈解鏈狀態(tài)，以充分暴露堿基，并采用高濃度亞硫酸氫鹽取代低濃度的亞 硫酸氫鹽將未甲基化修飾的胞嘧啶充分轉(zhuǎn)化為磺化尿嘧啶。4、為使DNA修飾在短時(shí)間內(nèi)更加充分，在修飾液中添加硫化促進(jìn)劑MBT，化學(xué)名稱 2-硫醇基苯駢噻唑劑(2-Mercaptobenzothiazole)，分子式C7H5NS2,可促進(jìn)DNA的快速修飾轉(zhuǎn)化。5、針對(duì)DNA修飾后繁瑣的純化和去磺化步驟，采用UNIQ-10柱，直接在UNIQ柱中 完成脫鹽和去磺化，節(jié)省大量時(shí)間，同時(shí)減少因操作步驟過(guò)多而導(dǎo)致修飾過(guò)的DNA回收的 損失，提高回收率。本發(fā)明方法成本低廉、大大節(jié)省DNA提取和脫鹽時(shí)間、重復(fù)性好，可直接用于檢測(cè) 血細(xì)胞、口腔上皮細(xì)胞及各種組織細(xì)胞基因的甲基化水平，在早臨床診斷等生物醫(yī)學(xué)檢測(cè) 技術(shù)方面具有重要的使用價(jià)值。


圖1 :PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖條帶從左到右依次為Marker，H0XC9, CRABPl 和 IGFBP7圖2 實(shí)施例5PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖條帶從左到右依次為Marker，IGFBP7圖3 實(shí)施例2測(cè)序比對(duì)4 實(shí)施例3測(cè)序比對(duì)5 實(shí)施例4、實(shí)施例5測(cè)序比對(duì)圖
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合BSP法實(shí)例來(lái)充分說(shuō)明本發(fā)明試劑盒修飾效果和詳細(xì)的操作過(guò)程。實(shí)施例1試劑盒的制備三種溶液按常規(guī)方法配制。配方1如下(1)修飾液5M亞硫酸氫鈉，5M亞硫酸氫銨，5mM氫醌，2mM MBT (2-硫醇基苯駢噻 唑)，4M 異硫氰酸胍，50mM Tris-HCl pH 5. 5 ；(2)清理液35%乙醇，400mM氫氧化鈉，200mM氯化鈉；(3)洗滌液10mM Tris pH 6. 8，80% 乙醇。三種溶液的溶劑均為水。將修飾液、清理液和洗滌液分裝后裝配試劑盒。配方2如下
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(1)修飾液4M亞硫酸氫鈉，3M亞硫酸氫銨，7mM氫醌，5mM MBT (2-硫醇基苯駢噻 唑)，2. 6M 異硫氰酸胍，40mM Tris-HCl pH 6. 0 ；(2)清理液30%乙醇，500mM氫氧化鈉，200mM氯化鈉；(3)洗滌液5mM Tris ρΗ 6·8，85% 乙醇。三種溶液的溶劑均為水。將修飾液、清理液和洗滌液分裝后裝配試劑盒。配方3如下(1)修飾液6Μ亞硫酸氫鈉，7Μ亞硫酸氫銨，3mM氫醌，ImM MBT (2-硫醇基苯駢噻 唑)，5. 5M 異硫氰酸胍，60mM Tris-HCl pH 5. 0 ；(2)清理液50%乙醇，300mM氫氧化鈉，400mM氯化鈉；(3)洗滌液15mM Tris ρΗ 6·8，65% 乙醇。三種溶液的溶劑均為水。將修飾液、清理液和洗滌液分裝后裝配試劑盒。實(shí)施例2 檢測(cè)口腔上皮細(xì)胞H0XC9基因啟動(dòng)子區(qū)1、采樣采樣前，先用清水簌口，然后一手持消毒的醫(yī)用棉簽，伸進(jìn)口腔，從口腔 內(nèi)側(cè)頰粘膜處反復(fù)擦拭5分鐘左右，取出棉簽，把棉簽放入盛有Iml TE的EP管中清洗， 12000rpm離心3分鐘，去上清，收集口腔上皮細(xì)胞。2、細(xì)胞裂解取500ul的實(shí)施例1配方1的修飾液放入1. 5ml的EP管中，將少于 或等于20ul的收集的口腔上皮細(xì)胞加入盛有修飾液EP管中，顛倒混勻、輕微震蕩30秒，細(xì) 胞裂解變澄清。3、修飾將上述修飾液體平均分成4份分裝到4個(gè)PCR管中，在PCR儀中高溫修飾 處理98°C 20秒一90 0C 20分鐘一70 °C 5分鐘一4°C保溫。4、上柱將修飾液處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)到UNIQ-10核酸純化柱，室溫靜置1分鐘，8000rpm 離心2分鐘，棄收集管廢液。5、脫磺化加入實(shí)施例1配方1的清理液500ul甩動(dòng)數(shù)次，使清理完全浸入U(xiǎn)NIQ 柱的硅膠膜中，室溫放置15 20分鐘，SOOOrpm離心2分鐘，棄收集管廢液。6、純化加入實(shí)施例1配方1的洗滌液500ul于UNIQ柱中，12000rpm離心2分鐘， 棄收集管廢液。重復(fù)洗滌一次。55°C烘箱放置10分鐘，加30ul DDW或TE，12000rpm離心 2分鐘，得到重亞硫酸氫鹽修飾過(guò)的DNA模板。7、PCR:(1)引物設(shè)計(jì)上游引物5，TGGAGGGGTATGAGGAGTTTAG3，(SEQ ID NO 1)下游引物5，CCTTTAACTATAAAACCCCCATAAC3，(SEQ ID NO 2)PCR 產(chǎn)物大小316bp(2) 50 μ 1體系的配制
權(quán)利要求
一種檢測(cè)DNA甲基化的試劑盒，包括修飾液、清理液和洗滌液。
2.如權(quán)利要求1所述檢測(cè)DNA甲基化的試劑盒，其特征在于，所述修飾液包括如下 組分亞硫酸氫鈉4-6M，亞硫酸氫銨3-7M，氫醌3-7mM，硫化促進(jìn)劑l_5mM，異硫氰酸胍 2. 5-5. 5M和緩沖液。
3.如權(quán)利要求2所述檢測(cè)DNA甲基化的試劑盒，其特征在于，所述硫化促進(jìn)劑為MBT， 所述緩沖液為PH 5-6的40-60mM Tris-HCl。
4.如權(quán)利要求1所述檢測(cè)DNA甲基化的試劑盒，其特征在于，所述清理液包括如下組 分乙醇30-50%、氫氧化鈉300-500mM和氯化鈉200_400mM。
5.如權(quán)利要求1所述檢測(cè)DNA甲基化的試劑盒，其特征在于，所述洗滌液包括如下組 分pH 6. 8 的 5-15mM Tris,乙醇 65-85%。
6.如權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述檢測(cè)DNA甲基化的試劑盒用于從樣本細(xì)胞中提取 DNA,作為亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法或甲基化特異性的PCR法的PCR模板的用途。
7.一種采用權(quán)利要求1-6任一權(quán)利要求所述試劑盒檢測(cè)DNA甲基化的方法，包括下列 步驟1)將適當(dāng)數(shù)量的樣本細(xì)胞與修飾液混合完成細(xì)胞裂解后高溫處理；2)將修飾液處理的產(chǎn)物轉(zhuǎn)到核酸純化柱中；3)先用清理液去磺化處理，再用洗滌液洗滌核酸純化柱后洗脫，收集洗脫液；4)以洗脫液中的DNA為模板，采用亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法或甲基化特異性的PCR法 檢測(cè)DNA甲基化。
8.如權(quán)利要求7所述試劑盒檢測(cè)DNA甲基化的方法，其特征在于，所述核酸純化柱為 UNIQ-10核酸純化柱。
9.如權(quán)利要求7所述試劑盒檢測(cè)DNA甲基化的方法，其特征在于，所述洗脫液選自雙蒸 水或TE。
10.如權(quán)利要求7所述試劑盒檢測(cè)DNA甲基化的方法，其特征在于，所述步驟1)中的高 溫處理方法為98°C 20秒一900C 20分鐘一70°C 5分鐘一4°C保溫。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)DNA甲基化的試劑盒及方法。本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比做了以下四個(gè)方面的改進(jìn)1.DNA提取和DNA修飾同步完成；2.修飾液中添加硫化促進(jìn)劑MBT和異硫氰酸胍，快速完成DNA提取和修飾過(guò)程；3.修飾反應(yīng)采用短時(shí)間高溫處理方法，使DNA呈解鏈狀態(tài)，以充分暴露堿基，將未甲基化修飾的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為磺化尿嘧啶；4.對(duì)修飾后繁瑣的透析脫鹽步驟進(jìn)行簡(jiǎn)化處理將修飾處理后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)到核酸純化柱中，再用清理液處理后洗脫，得到檢測(cè)基因的甲基化PCR的DNA模板。本發(fā)明方法成本低廉、省時(shí)、重復(fù)性好，可直接用于檢測(cè)各種組織細(xì)胞基因的甲基化水平，在早臨床診斷等生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)方面具有重要的使用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101984069SQ20101028664
公開日2011年3月9日 申請(qǐng)日期2010年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月19日
發(fā)明者吳俊生, 張玉武, 李瑞峰 申請(qǐng)人:生工生物工程(上海)有限公司