一種氨基比林-n-去甲基酶活性測定試劑盒及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，涉及一種試劑盒，具體涉及一種氨基比林-N-去甲基酶活性測定試劑盒及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細胞色素P450酶是一組在外源物質(zhì)代謝中，尤其是藥物和毒物中，具有重要作用的酶系。氨基比林-N-去甲基酶(AND)作為P450酶系的重要一員，相當(dāng)于CYP3A4亞型，與藥物的去甲基化反應(yīng)密切相關(guān)。
氨基比林-N-去甲基酶屬于P450酶系。目前檢測P450酶的方法主要有C0吹泡法、體外溫孵法及化學(xué)比色法。C0吹泡法利用還原狀態(tài)下P450酶可與一氧化碳結(jié)合形成復(fù)合物，在波長450nm處出現(xiàn)最大吸收峰，根據(jù)峰高測定值的大小計算酶的含量。體外溫孵法是將待測樣品直接與探針底物共同孵育，通過底物的代謝動力學(xué)反映酶活性影響的大小?；瘜W(xué)比色法主要通過Nash比色法測定甲醛產(chǎn)生量反應(yīng)酶的活性。
[0003]然而，C0吹泡法不能直接反應(yīng)氨基比林-N-去甲基酶的活性;體外溫孵法可以通過底物的代謝動力學(xué)反映酶活性影響的大小，但是需要通過體外代謝酶促動力學(xué)獲得酶的反應(yīng)初速度和米氏常數(shù)建立動力學(xué)模型，故模擬生理環(huán)境條件過程比較復(fù)雜且耗時；比色法則可直接靈敏的檢測到氨基比林-N-去甲基酶的活性，且檢測結(jié)果可靠。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明旨在提供一種氨基比林-N-去甲基酶活性測定試劑盒及其方法，可快速準(zhǔn)確的測算出氨基比林-N-去甲基酶的活性。
[0005]為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，達到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
一種氨基比林-N-去甲基酶活性測定試劑盒，包括以下試劑:
試劑一，粉劑X 1瓶，4°C保存，由蔗糖組成，置于60mL試劑瓶中；
試劑二，液體XI瓶，4°C保存，由Tris、蒸餾水、濃鹽酸混勻后再加入甘油配置而成，置于lOOmL試劑瓶中；
試劑三，粉劑X 1瓶，4°C避光保存，由氨基比林組成，置于5mL棕色試劑瓶中；
試劑四，粉劑X 1瓶，4°C保存，由NADPH組成，置于5mL試劑瓶中；
試劑五，粉劑X 1瓶，室溫保存，由硫酸鋅組成，置于10mL試劑瓶中；
試劑六，液體X 1瓶，室溫保存，由過飽和氫氧化鋇溶液組成，置于10mL試劑瓶中；試劑七，液體XI瓶，4°C保存，由乙酸銨、蒸餾水、冰乙酸和乙酰丙酮充分混勻而成，置于30 mL試劑瓶中；
標(biāo)準(zhǔn)液，液體X 1支，_20°C保存，由甲醛溶液和蒸餾水充分混勻而成，置于1.5mL EP管中。
[0006]進一步的，所述試劑一中，鹿糖的質(zhì)量為4.3g;
進一步的，所述試劑二中，Tris的質(zhì)量為727mg，蒸饋水的體積為58mL，濃鹽酸的體積為215yL，甘油的體積為12mL ；
進一步的，所述試劑三中，氨基比林的質(zhì)量為50mg;
進一步的，所述試劑四中，NADPH的質(zhì)量為25mg;
進一步的，所述試劑五中，硫酸鋅的質(zhì)量為1.5g;進一步的，所述試劑六中，所述過飽和氫氧化鋇溶液的體積為9-10mL，所述過飽和氫氧化鋇溶液是由12mL蒸餾水加溫到80°C，再緩慢加入氫氧化鋇并且不斷震蕩，待不再溶解后，過濾后而制得；
進一步的，所述試劑七，乙酸銨的質(zhì)量為5g，蒸餾水的體積為25mL，冰乙酸的體積為
0.6mL，乙酰丙酮的體積為80yL ；
進一步的，所述標(biāo)準(zhǔn)液的體積為lmL，所述標(biāo)準(zhǔn)液是由40yL甲醛溶液加960yL蒸餾水充分混勻，再加9mL蒸餾水充分混勻后，制得。
[0007 ] 氨基比林-N-去甲基酶(AND )催化氨基比林釋放甲醛，通過Nash比色法測定甲醛含量，即可計算出氨基比林-N-去甲基酶的活性。
[0008]—種采用上述試劑盒且基于分光光度法的氨基比林-N-去甲基酶活性測定方法，包括以下步驟:
步驟1儀器和用品的準(zhǔn)備；
可見分光光度計、普通離心機，超速離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、lmL玻璃比色皿、蒸饋水、無水乙醇和冰；
步驟2試劑臨用前的預(yù)處理；
在所述試劑一所在的試劑瓶中加入50mL蒸餾水，充分溶解，獲得試劑一水溶液；
在所述試劑三所在的試劑瓶中加入2.6mL無水乙醇，充分溶解，獲得試劑三水溶液； 在所述試劑四所在的試劑瓶中加入2.6mL蒸餾水，充分溶解，獲得試劑四水溶液； 在所述試劑五所在的試劑瓶中加入10mL蒸餾水，充分溶解，獲得試劑五水溶液；
步驟3標(biāo)準(zhǔn)品的配制；
取1.5mL的EP管，加入10yL所述標(biāo)準(zhǔn)液后，再加入990yL蒸餾水，混勻即為0.05mmo 1/L標(biāo)準(zhǔn)甲醛溶液，4°C保存；
步驟4粗酶液的提?。?br> 1)除去包括細胞核、線粒體在內(nèi)的大分子物質(zhì):稱0.5g待測組織，加入lmL所述試劑一水溶液，冰上充分研磨，采用離心率10000g，在4°C下，離心30分鐘，取上清液轉(zhuǎn)入超速離心管；
2)粗制微粒體:采用離心率100000g，在4°C下，離心60分鐘，棄上清液；
3 )除去包括血紅蛋白在內(nèi)的雜質(zhì):向步驟4的2 )的沉淀中加lmL所述試劑一水溶液，蓋緊后充分震蕩溶解，采用離心率100000g，離心30分鐘，棄上清液；
4)最終微粒體:向步驟4的3)的沉淀中加入0.5 mL所述試劑二水溶液，蓋緊后充分震蕩溶解，即獲得粗酶液，待測；
步驟5氨基比林-N-去甲基酶(AND)活性測定的操作；
1)將分光光度計預(yù)熱30分鐘以上，調(diào)節(jié)波長到412nm，蒸餾水調(diào)零；
2)將所述試劑二置于37°C水浴中預(yù)熱30分鐘以上；
3)空白管:取一支EP管，加入50yL所述粗酶液，850yL所述試劑二，50yL所述試劑三水溶液，50yL蒸餾水，混勻后置于37°C水浴保溫30分鐘;立即加入175yL所述試劑五水溶液，混勻后置于冰浴中5分鐘;取出后加入175yL所述試劑六，混勻后室溫靜置5分鐘;在室溫8000rpm下離心5分鐘，取上清液；另取一支新的EP管，加入500yL該上清液，再加入500yL所述試劑七，混勻后60°C水浴10分鐘，然后取出，用冷水冷卻5分鐘，用分光光度計于412nm波長處測定光吸收，記為Aset;
4)測定管:再取一支EP管，加入50yL所述粗酶液，850yL所述試劑二，50yL所述試劑三水溶液，50yL所述試劑四水溶液，混勻后置于37°C水浴保溫30分鐘；立即加入175yL所述試劑五水溶液，混勻后置于冰浴中5分鐘;取出后加入175yL所述試劑六，混勻后室溫靜置5分鐘；室溫8000rpm下離心5分鐘，取上清液；另取一支新的EP管，加入500yL該上清液，500yL所述試劑七，混勻后60°C水浴10分鐘，然后取出，用冷水冷卻5分鐘，用分光光度計于412nm波長處測定光吸收，記為;
5)標(biāo)準(zhǔn)管:再取一支EP管，加入500yL所述標(biāo)準(zhǔn)品，500yL所述試劑七，混勻后60°C水浴10分鐘，然后取出，用冷水冷卻5分鐘，用分光光度計于412nm波長處測定光吸收，記為Α?體；
步驟6氨基比林-N-去甲基酶(AND)活性的計算；
1)按照蛋白濃度計算:
活性單位(U)定義:37°C中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生lM1l甲醛。
[0009]氨基比林-N-去甲基酶活性(U/mgprot) = C繊ρπΧ V雛pnX+ 繼-Aset) X稀釋倍數(shù)+ (CprXV#) + T = 0.045X(Ai隨-Aset)+ (Afi?體-Aset) + Cpr;
2)按照樣本質(zhì)量計算:
活性單位(U)定義:37°C中每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生lM1l甲醛。
[0010]氨基比林-N-去甲基酶活性(u/g) = c獅iaxV獅iax (A驗t- A空白管)+