二水合檸檬酸三鈉拮抗重金屬污染物聯(lián)合毒性的篩選方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及重金屬污染物驅排技術領域，尤其涉及多種重金屬污染物聯(lián)合毒性的驅排，特別指的是二水合檸檬酸三鈉拮抗重金屬污染物聯(lián)合毒性的篩選方法。
【背景技術】
[0002]重金屬一般是指比重大于4.0的金屬元素，重金屬或其化合物是環(huán)境中一類很難降解的污染物，廣泛存在大氣、水體、土壤等環(huán)境介質中并引起嚴重的環(huán)境污染。重金屬污染指由重金屬或其化合物造成的環(huán)境污染。近年來，我國關于重金屬污染事件屢見不鮮，從兒童血鉛群體超標，到重金屬污染“鎘大米”等等，重金屬污染已嚴重影響到人民的生活環(huán)境和身體健康。
[0003]重金屬元素是地殼巖石中的天然組分，在采礦、冶煉、工業(yè)生產以及煤、石油燃料燃燒過程中進入大氣、水、土壤，造成環(huán)境污染。環(huán)境中的重金屬具有較強的生物富集性，可以通過各種途徑進入人體并在體內長期積累，當濃度超過一定限度時會對人體的多種器官(肝臟、腎臟等)及系統(tǒng)(泌尿系統(tǒng)、神經系統(tǒng)等)造成嚴重的損壞作用，從而對人體造成很大的危害。其中，水是最重要的污染途徑。重金屬可以通過食物鏈經水生藻類、植物、動物器官組織逐級濃集放大，最終進入并蓄積在人體內。水以及水中生物(包括魚蝦貝類)中的重金屬污染與富積，是重金屬污染危害人類健康的重要途徑。如日本發(fā)生的甲基汞污染水體引發(fā)的水俁病。
[0004]關于單一重金屬的毒性，已有很多研究報道，如鉛的主要毒性是引起貧血、神經機能失調。鎘可以置換骨中鈣，使骨骼軟化，并能干擾人體內的酶系統(tǒng)，導致高血壓癥。汞在腦組織中積累達到一定量時，能對腦組織造成損害。進入水體的無機汞離子還可以轉變?yōu)槎拘愿蟮挠袡C汞，由食物鏈進入人體，引起全身中毒。另外，鉻、鎘、鎳等重金屬均有致癌作用。值得注意的是，當前，在重金屬毒性研究中，多集中于單一或兩種重金屬之間的聯(lián)合毒性，三種以上重金屬的聯(lián)合毒性研究很少見，這是因為多種重金屬之間存在著錯綜復雜的相互作用，聯(lián)合染毒可能影響彼此的吸收、轉運、分布、排泄和生物轉化等過程，給研究帶來很大的困難。然而，在實際接觸過程中，多種重金屬污染物往往正是同時存在并同時進入人體內的。因此，多種重金屬污染物同時接觸后的聯(lián)合毒性效應以及防治措施，是一個無法繞過而且亟待研究解決的問題。
[0005]重金屬污染物種類繁多，盡管各自的生物毒性機制差異很大，但也存在一些共同點。首先，大多數(shù)重金屬離子可直接或通過代謝產物間接與機體生物大分子、細胞器以及細胞內鈣穩(wěn)態(tài)和轉運系統(tǒng)等發(fā)生反應。另外，研究表明，幾乎所有的重金屬離子，在體內都可以引起活性氧基團的產生，進而導致細胞組織氧化應激損傷。金屬中毒的傳統(tǒng)臨床治療方法多采用絡合劑，絡合劑與重金屬離子結合，可形成穩(wěn)定的配合物，從而起到解毒作用。不同重金屬元素在水產品中的蓄積量不同，水產中人體所必需的鋅、銅、錳及鎂等的蓄積量遠高于萊、鎘、鉛和絡，高濃度的鋅、銅、錳及鎂等產生的毒性遠高于低蓄積量的萊、鎘、鉛和鉻等。一些經典的拮抗汞、鎘、鉛和鉻毒性的拮抗劑，在拮抗這些重金屬聯(lián)合毒性時顯得捉襟見肘。所以拮抗這些重金屬聯(lián)合毒性的新型的拮抗劑亟待尋找。
[0006]檸檬酸鈉又稱枸櫞酸鈉，是目前最終要的檸檬酸鹽，具有水溶性好，對水中的鋅、鎂和銅等金屬離子具有優(yōu)良的螯合能力。其主要由淀粉類物質經發(fā)酵生成檸檬酸，再跟堿類物質中和而產生，具有安全無毒性能。聯(lián)合國糧農與世界衛(wèi)生組織對其每日攝入量不作任何限制，可認為該品屬于無毒品。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的現(xiàn)狀，提供篩檢速度快，費用低的二水合檸檬酸三鈉拮抗重金屬污染物聯(lián)合毒性的篩選方法。
[0008]本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為:
二水合檸檬酸三鈉拮抗重金屬污染物聯(lián)合毒性的篩選方法，包括以下步驟:
步驟一、配置多種重金屬污染物的混合溶液；
步驟二、通過MTT實驗確定重金屬混合溶液的LC50 ;
步驟三、將二水合檸檬酸三鈉作為拮抗劑，將待篩選的不同濃度的二水合檸檬酸三鈉水溶液和半數(shù)細胞致死濃度的重金屬混合溶液依次混合，并加入到培養(yǎng)基中作細胞系培養(yǎng);
步驟四、MTT細胞生存活力試驗:染毒24小時，再加MTT溫育3至4小時；進行細胞生存活力測定，得出待篩選的不同濃度的化學拮抗劑的拮抗效率。
[0009]為優(yōu)化上述技術方案，采取的具體措施還包括:
上述的多種重金屬污染物的混合溶液包含有重金屬元素鉛、鎘、汞、銅、鋅、錳、鉻以及鎳。
[0010]上述的細胞系為HL7702細胞系。
[0011]上述的溫育的溫度為37°C。
[0012]上述的二水合檸檬酸三鈉水溶液的給藥濃度為0.175g/L至1.225g/L。
[0013]上述的二水合檸檬酸三鈉水溶液的給藥濃度為0.175g/L。
[0014]上述的二水合檸檬酸三鈉水溶液的給藥濃度為0.525g/L。
[0015]上述的二水合檸檬酸三鈉水溶液的給藥濃度為0.875g/L。
[0016]上述的二水合檸檬酸三鈉水溶液的給藥濃度為1.225g/L。
[0017]本發(fā)明拮抗劑的篩選方法，采用體外細胞MTT法，篩檢速度快，費用低；其采用二水合檸檬酸三鈉作用多種重金屬污染物聯(lián)合毒性的拮抗劑使用，開發(fā)了二水合檸檬酸三鈉新的功用；本篩選方法能夠同時對不同濃度的拮抗劑進行篩選，篩選效率高。
【附圖說明】
[0018]圖1是八種重金屬混合物加入二水合檸檬酸三鈉后的HL7702細胞生存率變化圖；
圖2是重金屬溶液儲備液配置圖表；
圖3是實驗中二水合檸檬酸三鈉藥劑量分組圖表；
圖4是實驗中各組實驗給藥圖表。
【具體實施方式】
[0019]以下結合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0020]二水合檸檬酸三鈉拮抗重金屬污染物聯(lián)合毒性的篩選方法，包括以下步驟: 步驟一、配置多種重金屬污染物的混合溶液；
步驟二、通過MTT實驗確定重金屬混合溶液的LC50 ;
步驟三、將二水合檸檬酸三鈉作為拮抗劑，將待篩選的不同濃度的二水合檸檬酸三鈉水溶液和半數(shù)細胞致死濃度的重金屬混合溶液依次混合，并加入到培養(yǎng)基中作細胞系培養(yǎng);
步驟四、MTT細胞生存活力試驗:染毒24小時，再加MTT溫育3至4小時；進行細胞生存活力測定，得出待篩選的不同濃度的化學拮抗劑的拮抗效率。
[0021 ] 所述的多種重金屬污染物的混合溶液包含有重金屬元素鉛、鎘、汞、銅、鋅、錳、鉻以及鎳。
[0022]所述的細胞系為HL7702細胞系。
[0023]所述的溫育的溫度為37 °C。
[0024]所述的二水合檸檬酸三鈉水溶液的給藥濃度為0.175g/L至1.225g/L。
[0025]下面通過實驗證明二水合檸檬酸三鈉(C6H5Na307*2H20)在拮抗多種重金屬污染物混合后的聯(lián)合毒性中確有作用。實驗中，二水合檸檬酸三鈉水溶液的給藥濃度分別為
0.175g/L、0.525g/L、0.875g/L 以及 1.225g/L。
[0026]—、配置8種重金屬原液進行實驗。
[0027]1、重金屬溶液儲備液配置
按照圖2所示的重金屬溶液儲備液配置圖表配置重金屬溶液。
[0028]其中，(CH3C00)2Pb*3H20、CdCl2.2.5H20、NiCl2.6H20、MnCl2.4H20、ZnS04.7H20、CuS04*5H20、K2Cr207、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、二甲亞砜均為分析純，購買自國藥集團化學試劑有限公司。CH3ClHg購買自德國Dr.Ehrenstor