一種馬西替坦有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種化學(xué)藥物純度的分析方法，具體地說是一種馬西替坦有關(guān)物質(zhì)的 高效液相色譜分析方法。 二、
【背景技術(shù)】
[0002] 馬西替坦（Macitentan)，化學(xué)名為N-[5-(4-溴苯基）-6-[2-[ (5-溴-2-嘧啶基） 氧]乙氧基]-4-嘧啶基]-Ν'-丙基磺酰胺，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式（I):
[0003]
[0004] 馬西替坦是一柙雙冋円反累黨懷栢沉刑，田垌士茇口」忝陲制約公司（Actelion Pharmaceuticals Inc.)開發(fā)。2013年10月18日獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)，用于治療肺動(dòng)脈高壓 (PAH)，以延緩疾病進(jìn)展。
[0005] 馬西替坦雜質(zhì)較多，從結(jié)構(gòu)上看，5-(4-溴苯基）-4, 6-二取代啼啶母核及二乙氧 結(jié)構(gòu)中均有兩個(gè)活性等同的反應(yīng)位點(diǎn)（氯原子、羥基），合成過程中會(huì)產(chǎn)生雙縮合雜質(zhì)（雜 質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D)及水解雜質(zhì)（雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G);馬西替坦分子中不穩(wěn)定 的磺酰胺結(jié)構(gòu)水解產(chǎn)生雜質(zhì)H、雜質(zhì)I及雜質(zhì)J，芳醚結(jié)構(gòu)水解產(chǎn)生雜質(zhì)E及雜質(zhì)K，氧化降 解產(chǎn)生雜質(zhì)I及雜質(zhì)J。從來源看，馬西替坦原料的雜質(zhì)主要來源于合成過程中引入的反應(yīng) 原料、合成中間體、反應(yīng)副產(chǎn)物及降解雜質(zhì)，馬西替坦制劑的雜質(zhì)來源于原料引入雜質(zhì)、工 藝雜質(zhì)及降解雜質(zhì)。
[0006]目前馬西替坦原料及其制劑的分析方法還沒有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。 三、

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的在于提供一種馬西替坦有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜分析方法。
[0008] 針對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)馬西替坦原料及其制劑雜質(zhì)鑒定研究的缺失，發(fā)明人通過工藝試 制、強(qiáng)制降解試驗(yàn)對(duì)馬西替坦雜質(zhì)進(jìn)行富集、分離提純，鑒定了 18個(gè)主要已知雜質(zhì)，并且對(duì) 雜質(zhì)進(jìn)行了溯源歸屬，包括馬西替坦合成中間體（雜質(zhì)〇、雜質(zhì)P、雜質(zhì)Q、雜質(zhì)R)、馬西替坦 合成副產(chǎn)物（雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G)及降解雜質(zhì)（雜質(zhì)H、雜 質(zhì)I、雜質(zhì)J、雜質(zhì)K、雜質(zhì)L、雜質(zhì)M、雜質(zhì)N)。
[0009]
[0010] 發(fā)明人曾試圖通過等度洗脫分離各已知雜質(zhì)，但在保證各雜質(zhì)達(dá)到基線分離的情 況下色譜保留時(shí)間大于2h，耗時(shí)，不實(shí)用。因此，改用梯度洗脫法，經(jīng)對(duì)流動(dòng)相組成及比例的 優(yōu)化篩選，確定本發(fā)明的分析方法。同時(shí)按中國(guó)藥典2010年版二部附錄VD(高效液相色 譜法）及附錄XIXA(藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則）的定義和驗(yàn)證方法，進(jìn)行專屬 性驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法可同時(shí)分析馬西替坦原料及其制劑中的所有已知雜質(zhì)，并且可通 過加校正因子的主成份自身對(duì)照法有效控制各已知雜質(zhì)含量，各雜質(zhì)峰之間及主峰與相鄰 雜質(zhì)峰之間的分離度均大于1. 5,主峰與各雜質(zhì)峰峰純度均為1. 0。
[0011] 所述"峰純度"是指采用配有相應(yīng)分析軟件的光二極管陣列檢測(cè)器，采集、記錄、分 析經(jīng)色譜柱分離組份的光譜數(shù)據(jù)，自動(dòng)生成的表征特定分離組份對(duì)應(yīng)的光譜特征一致性的 加權(quán)值。
[0012] 本發(fā)明馬西替坦有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜分析方法，采用反相色譜柱及紫外檢測(cè) 器，是以乙腈-水-甲酸的混合溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，包括如下步驟：
[0013] (1)樣品配制：取馬西替坦原料，用體積比為1 : 4的碳酸氫銨緩沖液（取碳酸氫 銨1. 58g，加水1000ml使溶解，用氨水調(diào)節(jié)pH值至9. 0)-乙腈溶液超聲溶解，過濾或離心， 配制成濃度為〇. 1-1. 5mg/ml的馬西替坦溶液；
[0014] (2)色譜條件設(shè)置：采用反相C18柱，柱溫設(shè)置在20-50°C;以體積比 為49 : 49-54 : 0. 05-0. 15的乙腈-水-甲酸混合液為流動(dòng)相A，以體積比為 85 : 14-17 : 0.05-0. 15的乙腈-水-甲酸混合液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；流速為 0. 5-2.Oml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為250-270nm;洗脫液由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B構(gòu)成；
[0015] (3)檢測(cè)：取步驟⑴配制的馬西替坦溶液，進(jìn)樣10-50μ1，記錄色譜圖。
[0016] 步驟（2)中反相C18 柱選自GraceSmartC18 (250X4. 6mm，5μm)、Agilent C18 (250X4. 6mm，5μm)或ApolloC18 (250X4. 6mm，5μm)，優(yōu)選AgilentC18 (250X4. 6mm， 5μm) 〇
[0017] 步驟（2)中流動(dòng)相A為乙腈、水和甲酸按體積比49 : 50-52 :0·08-0. 12 混合構(gòu)成，優(yōu)選體積比為49 : 51 : 0.1;流動(dòng)相B中為乙腈、水和甲酸按體積比 85 : 14-16 : 0.08-0. 12混合構(gòu)成，優(yōu)選體積比為85 : 15 : 0.1。
[0018] 步驟（2)中梯度洗脫程序?yàn)椋?-10min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比為100%， 10min-35min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比由100%逐步遞減至0%，35min-50min流動(dòng) 相A占洗脫液的體積百分比為0%，50min-52min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比由0%逐 步遞增至100%，52min-60min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比為100%。
[0019] 更優(yōu)的洗脫程序?yàn)椋?br>[0020] 0-10min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比為100%，10min-35min流動(dòng)相A占洗脫 液的體積百分比由100%逐步遞減至〇%，35min-40min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比為 0%，40min_42min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比由0%逐步遞增至100%，42min_50min 流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比為100%。
[0021]步驟（2)中流速為0·5-2. 0ml/min，優(yōu)選0·5-1. 5ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為 250-270nm， 優(yōu)選 255-265nm。
[0022] 步驟（3)中進(jìn)樣量為10μ1-20μ1。
[0023] 采用本發(fā)明方法可有效地控制馬西替坦原料及制劑中的有關(guān)物質(zhì)，18個(gè)已知雜質(zhì) 均能在一張圖譜上分析出來，各雜質(zhì)峰之間及主峰與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度均大于1. 5， 主峰與各雜質(zhì)峰峰純度均為1. 〇。分析過程見實(shí)施例1，典型色譜圖見圖1，計(jì)算結(jié)果見表 1〇
[0024] 表1馬西替坦與各已知雜質(zhì)色譜分離參數(shù)結(jié)果
[0025]

[0026] 采用本發(fā)湳方法能"分析馬西替j：旦在各種復(fù)-環(huán)境下的降解雜質(zhì)，方法專屬性 強(qiáng)。按中國(guó)藥典2010年版二部附錄VD(高效液相色譜法）及附錄XIXA(藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則）的定義和驗(yàn)證方法，將馬西替坦分別用酸、堿、高溫、氧化、光照破 壞，制得破壞樣品，按本發(fā)明方法分別采集各破壞樣品色譜圖，分析過程見實(shí)施例2,典型色 譜圖見附圖2~7。結(jié)果表明該方法能夠分析經(jīng)酸、堿、高溫、氧化、光照破壞的樣品，主峰與 各雜質(zhì)峰均能達(dá)到基線分離，主峰純度均為1. 〇。
[0027] 采用本發(fā)明方法能對(duì)各已知雜質(zhì)進(jìn)行定量分析。按中國(guó)藥典2010年版二部附錄 VD(高效液相色譜法）及附錄XIXA(藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則）的定義和驗(yàn) 證方法，采用雜質(zhì)對(duì)照法對(duì)馬西替坦18個(gè)已知雜質(zhì)的檢測(cè)限、定量限進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明 該方法對(duì)各雜質(zhì)的響應(yīng)值高，能有效控制各已知雜質(zhì)，結(jié)果見表2。
[0028] 表2馬西替坦已知雜質(zhì)定量分析驗(yàn)證參數(shù)結(jié)果
[0029]
[0030] 本發(fā)明首次對(duì)馬西替坦原料及其制劑雜質(zhì)進(jìn)行溯源歸屬，鑒定了 18個(gè)已知雜質(zhì)， 為馬西替坦原料及其制劑有關(guān)物質(zhì)研究提供了可靠的雜質(zhì)譜參考，具有較大的積極進(jìn)步效 果和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 四、【附圖說明】
[0031] 圖1是實(shí)施例1馬西替坦與已知雜質(zhì)的混合色譜圖（圖中A為原圖，B為放大圖）。
[0032] 圖2是實(shí)施例2酸破壞色譜圖。
[0033] 圖3是實(shí)施例2堿破壞色譜圖。
[0034] 圖4是實(shí)施例2高溫破壞色譜圖。
[0035] 圖5是實(shí)施例2氧化破壞色譜圖。
[0036] 圖6是實(shí)施例2光照破壞色譜圖。
[0037] 圖7是實(shí)施例2未破壞樣品色譜圖。
[0038] 圖8是實(shí)施例3馬西替坦有關(guān)物質(zhì)色譜圖。
[0039] 圖9是實(shí)施例4馬西替坦片（10mg)有關(guān)物質(zhì)色譜圖。 五、【具體實(shí)施方式】
[0040] 實(shí)施例1 :
[0041] 檢測(cè)儀器與色譜條件：
[0042] 高效液相色譜儀：LC-10AD栗，Sro-ΜΙΟΑ檢測(cè)器
[0043]色譜柱：Agilent C18(250X4.6mm，5ym);流動(dòng)相A:體積比為49:51:0· 1的 乙腈-水-甲酸溶液；流動(dòng)相B :體積比為85:15 : 0. 1的乙腈-水-甲酸溶液；檢測(cè)波 長(zhǎng)：260nm ;流速：L Oml/min ;進(jìn)樣量：20μ1。
[0044] 實(shí)驗(yàn)步驟：
[0045] ⑴樣品配制：
[0046] 取馬西替坦、已知雜質(zhì)A-R各適量，用體積比1:4的碳酸氫銨緩沖液（取碳酸氫 銨1. 58g，加水1000ml使溶解，用氨水調(diào)節(jié)pH值至9. 0)-乙腈溶液超聲溶解并稀釋制成含 馬西替坦約為lmg/ml、雜質(zhì)A-R均約為1yg/ml的溶液，作為樣品溶液；
[0047](2)梯度洗脫程序設(shè)置：
[0048]
[0049] (3)檢測(cè)：取上述樣品溶液，分別進(jìn)樣20μ1，分