一種基于植物酯酶快速檢測(cè)農(nóng)殘的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及基于植物酯酶快速檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]有機(jī)磷農(nóng)藥作為一種被使用最為廣泛的農(nóng)藥種類,主要是通過皮膚接觸,呼吸和直接食用等方式進(jìn)入人體,而后經(jīng)血液和淋巴循環(huán)到全身各器官和組織。有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)后與乙酰膽堿酯酶活性中心結(jié)合生成磷酸化膽堿酯酶,磷酸化膽堿酯酶較難水解,破壞了膽堿酯酶的活性,使得乙酰膽堿在神經(jīng)突觸上大量積累,干擾了神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳導(dǎo),甚至能導(dǎo)致人的死亡,對(duì)人類健康造成極大威脅。
[0004]目前,農(nóng)藥殘留檢測(cè)的方法主要有紫外可見光譜法、熒光光譜法、拉曼光譜法、氣相色譜、氣相/液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC/HPLC-MS)、酶抑制法(EI)、酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)和電化學(xué)傳感檢測(cè)等。大型儀器檢測(cè)農(nóng)藥殘留雖然準(zhǔn)確可靠,但仍存在像成本高、檢測(cè)周期較長(zhǎng)、操作步驟繁瑣、需要專業(yè)操作人員,后續(xù)數(shù)據(jù)分析工作量大等不足,使其無(wú)法實(shí)現(xiàn)低成本、快速、原位檢測(cè)。因此,研究和開發(fā)快速化、小型化、靈敏可靠的農(nóng)藥殘留分析方法,建立健全農(nóng)藥監(jiān)測(cè)體系已刻不容緩。
[0005]作為現(xiàn)代儀器分析手段的重要分支之一,電化學(xué)分析技術(shù)近年來(lái)在分析領(lǐng)域中顯示出了巨大的潛力和優(yōu)越性,對(duì)農(nóng)殘分析的應(yīng)用也日趨增多。用于農(nóng)殘檢測(cè)傳統(tǒng)的生物傳感器的敏感元件通常由乙酰膽堿酯酶或其修飾之后構(gòu)成,但是由于乙酰膽堿酯酶大多來(lái)源于動(dòng)物體,取材比較困難,從而增加了以乙酰膽堿酯酶為敏感元件的生物傳感器成本,也限制了該類傳感器的應(yīng)用。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足,本發(fā)明的目的是提供一種基于植物酯酶快速檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的新方法,解決生物傳感器的敏感元件原料取材困難、成本高的問題,實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度有機(jī)磷農(nóng)藥定性和定量檢測(cè)。
[0008]實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:一種基于植物酯酶快速檢測(cè)農(nóng)殘的方法,包括如下步驟:
1)采用三電極系統(tǒng),以生物傳感器作為工作電極,Ag/AgCl/3 mol -L 1 KC1作為參比電極,鉑絲電極作為輔助電極;
其中,所述生物傳感器為基于植物酯酶的生物傳感器,它以玻碳電極作為基體,所述基體表面上從內(nèi)到外依次由檢測(cè)層1、檢測(cè)層2和固定層組成;所述檢測(cè)層1由1-2:2-1體積比的多壁碳納米管和納米金層組成,所述檢測(cè)層2由牛血清蛋白和植物酯酶水溶液組成,所述固定層為離子交換樹脂; 2)將步驟1)所述三電極系統(tǒng)置于有機(jī)磷農(nóng)藥溶液中抑制6-15min后,放入背景溶液中反應(yīng)3-8 min,選用差分脈沖伏安法,記錄下電流-電位曲線,獲得基于植物酯酶的生物傳感器對(duì)不同濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥溶液的電流響應(yīng)值,得到電流與有機(jī)磷農(nóng)藥濃度之間的線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線;
3)在步驟2)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)上,利用所述三電極系統(tǒng),通過查分脈沖伏安法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè),獲得基于植物酯酶的生物傳感器對(duì)樣品的電流響應(yīng)值,并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥含量進(jìn)行測(cè)定。
[0009]進(jìn)一步,所述生物傳感器的制備方法,包括如下步驟:
1)納米金顆粒的制備:向3~6°c的水中加入質(zhì)量濃度為0.5 ~2 %的HAuClyK溶液和摩爾濃度為0.1 ~ 0.5mol/L的K2C<VK溶液,攪拌條件下迅速加入1 ~ 3 mL 0.5~1 mg/mL的硼氫化鈉水溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用),重復(fù)加入硼氫化鈉水溶液步驟3-5次,直至混合溶液由藍(lán)紫色變?yōu)槌燃t色,得到納米金顆粒;其中,所述超純水、HAuClyK溶液和K 20)3水溶液的體積比為 2000:3:2 ;
2)多壁碳納米管溶液的配制:將羧酸功能化的多壁碳納米管溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,并超聲分散20~50 min,得到濃度為2~4 mg/mL的溶液;
3)將玻碳電極用三氧化二鋁粉拋光并超聲清洗后,將8-14μ L的多壁碳納米管-納米金混合溶液(1:1、2:1或1: 2,V/V)滴涂在電極表面,于室溫晾干;
4)將步驟3)所制備電極浸泡在200yL現(xiàn)配的1_乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC,2 mg/mL)溶液中10 min,再加入200 μ L N-羥基琥珀酰亞胺(NHS,10mg/mL)浸泡20 min,用于活化多壁碳納米管上的羧基(-C00H),然后用0.1 M PBS溶液潤(rùn)洗2-3次后于室溫晾干;
5)將植物酯酶配制成濃度為50-200 U/mL的水溶液,將所述水溶液與質(zhì)量濃度為0.1~ 0.5 %的牛血清蛋白溶液等體積混合為混合溶液;取6 - 12 μ L所述混合溶液滴涂在步驟4)晾干后的電極表層,使得混合溶液中的氨基(-ΝΗ2)與步驟4)制得電極上活化的羧基(-C00H)脫水縮合,從而植物酯酶固定于復(fù)合材料上,于室溫晾干;
6)然后將5-15 μ L的0.05 %離子交換樹脂溶液涂覆在步驟5)晾干后的電極表面進(jìn)行固定,并于室溫下干燥2 ~ 4h后,得到所述基于植物酯酶的生物傳感器。
[0010]其中,所述生物傳感器中植物酯酶采用如下方法提取得到:
1)植物酯酶粗酶的制備
將小麥面粉(大豆或玉米面粉亦可)與水按照(1:3 ~8,W/V)的質(zhì)量體積比混合,并磁力攪拌20 - 50 min后,以3000 ~ 6000 r/min的離心速度離心8 ~15 min,離心后棄去沉淀取其上清液,獲得粗酶,置于-20°C下保存;
2)植物酯酶的純化
稱取 2 - 3.5 g 的 PEG ( 1000、800 或 1200)和 1 - 2.5 g 無(wú)機(jī)鹽(NaH2P04或 KH 2P04)置于帶刻度的離心管中,用蒸餾水溶解后,加入步驟1)獲得的植物酯酶粗酶(0.5 ml ~ 1ml)液,再用蒸餾水調(diào)至10 ml,混合均勻后,靜置,即可得到雙水相體系;加入PEG/NaH2P04雙水相體系中,經(jīng)過兩步雙水相萃取后,將其下相在透析液中通過透析處理36 ~ 60 h,透析期間換透析液4 - 6次;其中,所述PEG/NaH2P04雙水相體系的pH值為4.0 ~ 8.0,以重量份計(jì)包括如下成分:20 ~ 35 份 PEG ( 600U000 或 2000)、10 ~ 25 份 NaH2P04、4 ~ 10份(NH4) #04和 30 ~ 66 份水;
透析后對(duì)被透析的下相進(jìn)行冷凍干燥,得到的粉末即為植物酯酶的純品。
[0011]相比現(xiàn)有技術(shù),本發(fā)明具有如下有益效果:
1、本發(fā)明利用基于植物酯酶的生物傳感器對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè),采用三電極系統(tǒng),通過差分脈沖伏安法,可以得到電流與有機(jī)磷農(nóng)藥濃度之間的線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線,并在該標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)上,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥含量進(jìn)行計(jì)算,檢測(cè)結(jié)果靈敏度和精度高,可實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè),可重復(fù)性強(qiáng);且本發(fā)明樣品無(wú)需進(jìn)行復(fù)雜的前處理過程,操作簡(jiǎn)單。
[0012]2、本發(fā)明基于植物酯酶的生物傳感器利用氨基與羧基脫水縮合反應(yīng)后將植物酯酶固定在納米材料(多壁碳納米管/納米金)上,并利用物理吸附將復(fù)合材料修飾于電極表面,通過各檢測(cè)層物質(zhì)的協(xié)同配伍作用,對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥具有良好的檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,用本發(fā)明基于植物酯酶的生物傳感器檢測(cè)甲基對(duì)硫磷,檢測(cè)限0.02 ppb (0.076 nM),對(duì)比于一些已經(jīng)報(bào)道的結(jié)果顯示出更低的檢測(cè)限;干擾性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,基于植物酯酶的生物傳感器對(duì)于類似含有硝基、苯環(huán)的常規(guī)化合物具有較強(qiáng)的抗干擾能力,對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥具有專一的檢測(cè)性。
[0013]3、本發(fā)明采用的生物傳感器采用納米金顆粒與羧酸功能化的多壁碳納米管物理吸附后,多壁碳納米管上羧基與植物酯酶-牛血清白蛋白復(fù)合物中的氨基進(jìn)行脫水縮合后再采用物理吸附法修飾于基體上,制得生物傳感器。其原料來(lái)源廣泛,成本低廉,制備方法簡(jiǎn)單。
[0014]4、采用本發(fā)明檢測(cè)方法無(wú)需使用大型儀器,可快速精準(zhǔn)地檢測(cè)水、瓜果蔬菜中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留含量,可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線快速原位檢測(cè),具有良好的應(yīng)用前景。
[0015]
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為植物酯酶/石墨烯-納米金復(fù)合材料修飾電極用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥反應(yīng)機(jī)理圖;
圖2為植物酯酶?jìng)鞲衅髟诓煌瑵舛鹊募谆鶎?duì)硫磷下的差分脈沖伏安圖;
圖3為植物酯酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)不同濃度甲基對(duì)硫磷(圖4)的擬合曲線;
圖4為植物酯酶純品白色粉末;
圖5位純化結(jié)果檢驗(yàn)電泳圖SDS-PAGE (1:純品;2:粗酶)。
[0017]
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0019]一、一種基于植物酯酶快速檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的方法,檢測(cè)對(duì)象為有機(jī)磷農(nóng)藥(甲基對(duì)硫磷或馬拉硫磷),運(yùn)用基于植物酯酶的生物傳感器進(jìn)行檢測(cè)。
[0020]1、檢測(cè)原理:檢測(cè)原理見圖1,水解方程(1)中,底物1-乙酸萘酯被植物酯酶水解產(chǎn)生1-萘酚和乙酸(電活性物質(zhì)),從而產(chǎn)生電流信號(hào)響應(yīng),隨著有機(jī)磷農(nóng)藥的添加會(huì)抑制這一反應(yīng)的進(jìn)行,從而電活性產(chǎn)物減少,故電流信號(hào)降低,隨著有機(jī)磷農(nóng)藥添加量的不同,其電流信號(hào)降低幅度不同。
[0021]2、有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)(圖2):采用三電極系統(tǒng),所述三電極系統(tǒng)中上述基于植物酯酶的生物傳感器作為工作電極,Ag/AgCl/3 mol - L1 KC1作為參比電極,鉑絲電極作為輔助電極;
將所述三電極系統(tǒng)置于有機(jī)磷農(nóng)藥溶液中抑制10 min后,放入背景溶液(0.1 M PBS,pH 6.5,含有0.5 mM 1_乙酸萘酯)中反應(yīng)5min,通過差分脈沖法(DPV)研究了植物酯酶/納米金顆粒-石墨烯復(fù)合材料所修飾的玻碳電極對(duì)甲基對(duì)硫磷檢測(cè)的電化學(xué)行為和作用機(jī)制,記錄下電流-電位曲線,獲得基于植物酯酶的生物傳感器對(duì)不同濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥溶液的電流響應(yīng)值,得到電流與有機(jī)磷農(nóng)藥濃度之間的線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0022]二、基于植物酯酶生物傳感器的制備方法,包括如下步驟:
1、納米金顆粒的制備:向預(yù)冷在4°C的100 mL超純水中加入0.15 mL質(zhì)量濃度為1%的HAuClyK溶液和0.05 mL 0.2 mol/L K 2C03溶液,攪拌條件下迅速加入剛配制的0.1 mL
0.5 mg/