一種用于二乙酰精胺(das)檢測(cè)的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及檢測(cè)二乙酷精胺(NI ,Ni2-Diacetylspermine,簡(jiǎn)稱DAS)含量的方法，具 體的說(shuō)是一種用于二乙酷精胺(DAS)檢測(cè)的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌，大腸癌在全世界的發(fā)病率在惡性腫瘤中排在第= 位，在我國(guó)的發(fā)病率排在第五位，我國(guó)男性的腸癌發(fā)病率是十萬(wàn)分之十六，女性為十萬(wàn)分之 十四，是最常見(jiàn)的腫瘤之一。西方人主要是W結(jié)腸為主，70%到80%患者所患為結(jié)腸癌，直 腸癌患者占20%到30%。我國(guó)卻相反，直腸癌患者占60%到70%，結(jié)腸癌占30%到40%。近 年的研究分析發(fā)現(xiàn)，我國(guó)的直腸癌發(fā)病率基本保持不變，結(jié)腸癌發(fā)病比例卻在上升。盡管化 療對(duì)轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者有效，但預(yù)后較差。因此，研究制備用于檢測(cè)結(jié)腸癌患者腫瘤標(biāo)志物 含量的試劑盒具有重要的社會(huì)意義和科學(xué)價(jià)值。
[0003] 多胺包括腐胺、尸胺、亞精胺和精胺，是一類具有生物活性含氮的低分子量有機(jī)化 合物的總稱?？煽醋魇前狈肿又?-3個(gè)氨原子被烷基或芳基取代后而生成的物質(zhì)?？蒞由原 核和真核細(xì)胞產(chǎn)生?？焖偕L(zhǎng)的組織通常有活躍的多胺合成系統(tǒng)，含有大量的多胺。當(dāng)體內(nèi) 存在運(yùn)樣的組織時(shí)，尿液中多胺的合成會(huì)增加。先前的研究表明與健康人相比，癌癥患者尿 液中多胺的含量增加。然而，后續(xù)的研究顯示尿液中總的及游離的多胺含量由于產(chǎn)生了大 量的假陽(yáng)性和陰性結(jié)果，因而不能作為可靠的腫瘤標(biāo)志物。
[0004] DAS分子式為Cl邊3〇N4〇2,分子量286.41，是一種多胺的二乙酷基衍生物，在體內(nèi)由 鳥(niǎo)氨酸經(jīng)鳥(niǎo)氨酸脫簇酶作用生成。二乙酷精胺是腫瘤細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，排泄到尿中。細(xì)胞癌 變后，乙酷基多胺分泌增加，導(dǎo)致腫瘤患者尿液中二乙酷精胺濃度明顯升高。DAS的早期檢 測(cè)是通過(guò)高效液相色譜法化化C)完成的，后來(lái)建立了適用于尿液中DAS含量檢測(cè)的酶聯(lián)免 疫吸附系統(tǒng)。有研究顯示，尿液中DAS表達(dá)量的檢測(cè)可W作為結(jié)腸癌、乳腺癌和肝癌有效的 新型腫瘤標(biāo)志物。至此，用于尿液中DAS含量檢測(cè)的化ISA檢測(cè)方法得到了廣泛的臨床研究。 但化ISA檢測(cè)方法同樣存在操作復(fù)雜，不能批量檢測(cè)等問(wèn)題。本發(fā)明開(kāi)發(fā)的利用全自動(dòng)生化 分析儀檢測(cè)患者樣本中DAS含量的比濁法檢測(cè)試劑盒，是一種比ELISA檢測(cè)方法更為方便、 快捷的檢測(cè)技術(shù)，能夠一次對(duì)大量樣本進(jìn)行檢測(cè)，并且其靈敏度高，操作簡(jiǎn)單。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[000引本發(fā)明目的在于提供一種二乙酷精胺(DAS)免疫比濁法體外檢測(cè)試劑盒。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種二乙酷精胺(DAS)免疫比濁法體外檢測(cè)試劑盒，包括Rl試劑，R2試劑，標(biāo)準(zhǔn)品 和質(zhì)控品，所述Rl試劑為將二乙酷精胺抗體偶聯(lián)在納米顆粒上，添加保護(hù)液后W液體形態(tài) 或者凍干后的固定形態(tài)保存的試劑;所述的R2試劑為將乙酷精胺(DAS)分子通過(guò)偶聯(lián)試劑 偶聯(lián)在載體蛋白上，W液體形態(tài)或者凍干后的固體形態(tài)保存的試劑。
[0008] 所述二乙酷精胺抗體是W乙酷精胺化AS)分子通過(guò)偶聯(lián)試劑偶聯(lián)在載體蛋白上所 得的產(chǎn)物作為免疫原，再免疫動(dòng)物獲得多克隆抗體或經(jīng)篩選獲得單克隆抗體。
[0009] 所述Rl中保護(hù)液按重量百分比計(jì)為:0.1-0.5%的Tris、0.5-2%的PVP40、0.5-1 % 的 BSA、0.1-0.5% 的陽(yáng) G20000、2-5% 的薦糖、0.01-0.8%的1胖66肥0、0.02-0.1%的疊氮鋼、 0.85-1.5 % 的NaCl、1-4% 的陽(yáng)G 6000，余量為水。
[0010] 所述的樣本包含但不限于血清、血漿、尿液等。所述納米顆粒包括但不限于納米 金、微球等。所述載體蛋白包括但不限于血清白蛋白（BSA)、多聚賴氨酸、卵清蛋白等。
[0011] 所述偶聯(lián)試劑為碳二亞酷胺類或馬來(lái)酷亞胺類;其中，碳二亞酷胺類為抓C，1-乙 基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺或N-徑基班巧酷亞胺醋類(NHS醋）；馬來(lái)酷亞胺類為4-馬來(lái)酷亞胺基下酸-N-班巧酷亞胺醋(GMBS)或4-(N-馬來(lái)酷亞胺基甲基)環(huán)己燒-1-簇酸班 巧酷亞胺醋(SMCC)。
[001引所述二乙酷精胺（DAS)分子偶聯(lián)載體蛋白是：W碳二亞胺/N-徑基班巧酷亞胺 化DC/NHS)作為偶聯(lián)試劑，將活化處理后的載體蛋白加入至過(guò)量的0.0 lM-O. IM的抑=6.5-8.0的PBS中，再加入水溶性的碳二亞胺化DC)和N-徑基班巧酷亞胺(NHS)，混勻至清澈透明， 而后室溫下靜置15-30分鐘；靜置后加入過(guò)量的乙酷精胺，混勻至清澈透明，調(diào)節(jié)體系PH值 至10-12,室溫下反應(yīng)4-6小時(shí);反應(yīng)后經(jīng)透析所得產(chǎn)物，即得二乙酷精胺(DAS)分子偶聯(lián)載 體蛋白。
[0013]具體為:所述二乙酷精胺(DAS)分子偶聯(lián)載體蛋白是W碳二亞胺/N-徑基班巧酷亞 胺化DC/NHS)作為偶聯(lián)試劑，將活化處理后的6-15mg載體蛋白加入至0.01M-0.1M的PH = 6.5-8. OPBS 3-8mL中，再加入水溶性的碳二亞胺巧DC)7-lOmg和N-徑基班巧酷亞胺(畑S)3-5mg，混勻至清澈透明，而后室溫下靜置15-30分鐘;靜置后加入乙酷精胺，混勻至清澈透明， 調(diào)節(jié)體系PH值調(diào)至10-12,室溫下反應(yīng)4-6小時(shí)；反應(yīng)后經(jīng)透析所得產(chǎn)物，即得二乙酷精胺 (DAS)分子偶聯(lián)載體蛋白。
[0014]所述二乙酷精胺（DAS)分子偶聯(lián)載體蛋白是：W碳二亞胺/N-徑基班巧酷亞胺 化DC/NHS)作為偶聯(lián)試劑，活化處理后的載體蛋白加入至過(guò)量的0.0 lM-O. IM的抑=6.5-8.0 的PBS中，再加入水溶性的碳二亞胺化DC)和N-徑基班巧酷亞胺(NHS)，混勻至清澈透明，而 后室溫下靜置15-30分鐘;靜置后加入精胺，混勻至清澈透明，調(diào)節(jié)體系PH值調(diào)至10-12,室 溫下反應(yīng)4-6小時(shí);反應(yīng)后經(jīng)透析所得產(chǎn)物在2-8°C中，向反應(yīng)體系內(nèi)加入的酷化劑，而后再 于2-8°C下反應(yīng)1-3小時(shí)，反應(yīng)物在經(jīng)透析即得二乙酷精胺(DAS)分子偶聯(lián)載體蛋白。
[0015] 具體為:所述二乙酷精胺(MS)分子偶聯(lián)載體蛋白是：W碳二亞胺/N-徑基班巧酷 亞胺化DC/NHS)作為偶聯(lián)試劑時(shí)，將活化處理后的6-15mg載體蛋白加入至0.0 lM-O. IM的pH =6.5-8.OPBS 3-8血中，再加入水溶性的碳二亞胺巧DC)7-10mg和N-徑基班巧酷亞胺(NHS) 3-5mg，混勻至清澈透明，而后室溫下靜置15-30分鐘;靜置后加入精胺，混勻至清澈透明，調(diào) 節(jié)體系PH值調(diào)至10-12,室溫下反應(yīng)4-6小時(shí)；反應(yīng)后經(jīng)透析所得產(chǎn)物在2-8°C中，向3-lOmL 反應(yīng)體系內(nèi)加入40化-8化L的酷化劑，而后再于2-8°C下反應(yīng)1-3小時(shí)，反應(yīng)物在經(jīng)透析即得 二乙酷精胺(DAS)分子偶聯(lián)載體蛋白。
[0016] 所述二乙酷精胺(DAS)分子偶聯(lián)載體蛋白是WN-[丫-馬來(lái)酷亞胺下酷氧]班巧酷 亞胺醋(GMBS)作為偶聯(lián)試劑，將酷化劑（乙酸酢或無(wú)水乙酸或乙酷氯）與精胺在2-8°C下反 應(yīng)60-90min，反應(yīng)后與偶聯(lián)劑(GMBS)在0.0 lM-O. IM的pH=6.5-8.0的PBS中混合，室溫下反 應(yīng)3-4小時(shí)，得乙酷精胺-GMBS偶聯(lián)產(chǎn)物;將載體蛋白與的乙酷琉基班巧酸在0.0IM-O. IM的 抑=6.5-8.0的PBS中混合，室溫下反應(yīng)3-5小時(shí);反應(yīng)后加入O. IM徑胺，室溫下反應(yīng)30-35分 鐘除去乙酷基;0.0 lM-O. IM的PH=6.5-8.0的PBS中透析，得琉基化修飾的BSA;將乙酷精胺-GMBS偶聯(lián)產(chǎn)物與上述琉基化修飾的BSA混合，室溫下反應(yīng)4-6小時(shí)；0.01M-0.1 M的抑= 6.5-8.0的PBS中透析得二乙酷精胺(DAS)分子偶聯(lián)載體蛋白。
[0017] 具體為:所述二乙酷精胺(DAS)分子偶聯(lián)載體蛋白是：WN-[丫-馬來(lái)酷亞胺下酷 氧]班巧酷亞胺醋(GMBS)作為偶聯(lián)試劑，將10-1扣L的酷化劑與15-25mg精胺在2-8°C下反應(yīng) 60-90min，反應(yīng)后與2-4mg偶聯(lián)劑(GMBS)在0.0 lM-O. IM的抑=6.5-8. OPBS 3-5mL緩沖溶液 中混合，室溫下反應(yīng)3-4小時(shí)，得乙酷精胺-GMBS偶聯(lián)產(chǎn)物;將8-15mg載體蛋白與3-7mg的乙 酷琉基班巧酸在0.0 lM-O. IM的抑=6.5-8. OPBS 3-5mL緩沖溶液中混合，室溫下反應(yīng)3-5小 時(shí)；反應(yīng)后加入0 . IM徑胺，室溫下反應(yīng)30-35分鐘除去乙酷基；0 . OlM-O . IM的pH = 6.5-8. OPBS緩沖液中透析，得琉基化修飾的BSA;將乙酷精胺-GMBS偶聯(lián)產(chǎn)物與上述琉基化修飾 的BSA混合，室溫下反應(yīng)4-6小時(shí)；0.0 lM-O. IM的PH = 6.5-8. OPBS緩沖液中透析得二乙酷精 胺(DAS)分子偶聯(lián)載體蛋白。
[0018] 所述載體蛋白活化處理是將載體蛋白用0.01M-0.1M pH = 6.5-8.0PBS緩沖液溶 解，溶解后加入MES，置于2-8°C環(huán)境中反應(yīng)半小時(shí)。
[0019] 。所述酷化劑包括乙酸酢、無(wú)水乙酸或乙酷氯。
[0020] 利用所述試劑盒通過(guò)免疫比濁競(jìng)爭(zhēng)抑制法檢測(cè)樣本中的二乙酷精胺。
[0021] 具體是，二乙酷精胺(NI ,Ni2-Diacetylspermine,簡(jiǎn)稱DAS)分子式為Ci4曲日N402,分 子量286.41，是一種多胺的二乙酷基衍生物，在體內(nèi)由鳥(niǎo)氨酸經(jīng)鳥(niǎo)氨酸脫簇酶作用生成。 DAS本身為小分子物質(zhì)，是半抗原，不具備免疫原性，僅具有反應(yīng)原性，無(wú)法使用DAS本身作 為免疫原制備DAS抗體，需將DAS通過(guò)偶聯(lián)劑與載體蛋白偶聯(lián)制備成完整的抗原，通過(guò)完全 抗原免疫動(dòng)物才可能獲得相應(yīng)的DAS抗體。
[0022]其檢測(cè)方法原理為:載體蛋白偶聯(lián)的DAS抗原能與納米顆粒上的抗DAS單克隆抗體 進(jìn)行特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物，出現(xiàn)濁度;尿液中的DAS與載體蛋白偶聯(lián)的DAS競(jìng)爭(zhēng)性結(jié) 合DAS單克隆抗體。通過(guò)生化分析儀測(cè)定溶液濁度。濁度與尿液中DAS的含量成反比。通過(guò)測(cè) 定標(biāo)準(zhǔn)品，建立一條反應(yīng)度對(duì)應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可測(cè)定尿樣中DAS濃度值。
[002引D A S試劑盒的預(yù)期用途為體外定量檢測(cè)人尿液中二乙酷精胺（N1，N 1 2 -Diacetylspermine ,DAS)的含量。
[0024] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：
[0025] 本發(fā)明所采用的體外檢測(cè)試劑盒的內(nèi)容物中包括針對(duì)DAS的特異性單克隆抗體和 納米顆粒標(biāo)記測(cè)定所需試劑，與新型納米顆粒免疫檢測(cè)方法相結(jié)合，用于檢測(cè)人體生物