專(zhuān)利名稱(chēng)：一種甲酰肽受體激動(dòng)劑篩選用微流控芯片組及篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞水平藥物篩選技術(shù)，特別提供了一種甲酰肽受體激動(dòng)劑篩選用微
流控芯片組及篩選方法。
背景技術(shù)：
甲酰肽受體(formyl p印tide rec印tor， FPR)在機(jī)體對(duì)抗外源性病原微生物感 染的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)病原微生物入侵機(jī)體時(shí)，其分泌物N-甲酰肽與FPR結(jié)合后， 能在炎癥和免疫應(yīng)急反應(yīng)中募集噬菌性白細(xì)胞游走并聚集在病灶處，對(duì)抗并清除病原微生 物。近年來(lái)的研究已證實(shí)，F(xiàn)PR不僅在有噬菌功能的白細(xì)胞中表達(dá)，而且在肝細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì) 胞、星狀細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等中也均有表達(dá)，F(xiàn)PR激動(dòng)劑還包括在炎癥早期出現(xiàn)的內(nèi)源 性多肽等非N-甲酰肽類(lèi)物質(zhì)。因此，F(xiàn)PR的功能也不僅僅局限于白細(xì)胞活化，還參與中樞 神經(jīng)系統(tǒng)病變和免疫調(diào)節(jié)作用等方面，發(fā)現(xiàn)新的FPR激動(dòng)劑和抑制劑有可能為治療神經(jīng)退 行性病變、艾滋病等人類(lèi)重大疾病提供潛在藥物。激動(dòng)劑與位于細(xì)胞表面的FPR結(jié)合后，啟 動(dòng)細(xì)胞內(nèi)FPR信號(hào)傳導(dǎo)通路，細(xì)胞發(fā)生受體內(nèi)吞、鈣離子釋放、脫顆粒效應(yīng)、趨化運(yùn)動(dòng)和炎 癥介質(zhì)釋放等一系列響應(yīng)事件，通過(guò)考察這些細(xì)胞功能，可實(shí)現(xiàn)FPR激動(dòng)劑和抑制劑篩選。
目前，對(duì)FPR介導(dǎo)的細(xì)胞響應(yīng)事件進(jìn)行檢測(cè)，仍以陣列微孔板為主要技術(shù)平臺(tái)。由 于孔板尺寸固定，與之配套的自動(dòng)操作設(shè)備和檢測(cè)系統(tǒng)模式單一，無(wú)法針對(duì)不同細(xì)胞功能 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)靈活變換，更難以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)藥物響應(yīng)過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。此外，細(xì)胞趨化檢 測(cè)通常采用Boyden盲端小室法。該方法雖然靈敏度較高，但是實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣，尤其是鋪膜 和取膜過(guò)程完全是手工操作且需要一定經(jīng)驗(yàn)。綜上所述，如能將微流控芯片技術(shù)引入這類(lèi) 藥物篩選研究中，根據(jù)不同篩選體系所需要檢測(cè)的指標(biāo)，對(duì)芯片上各種功能單元進(jìn)行靈活 組合、規(guī)模集成，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)藥物響應(yīng)的多參數(shù)、多指標(biāo)同時(shí)分析，將會(huì)在很大程度上解決 現(xiàn)有技術(shù)所面臨的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種甲酰肽受體激動(dòng)劑篩選用微流控芯片組及篩選方法，
使用專(zhuān)用的功能化微流控芯片組可在細(xì)胞水平進(jìn)行甲酰肽受體激動(dòng)劑篩選。 本發(fā)明提供了一種甲酰肽受體激動(dòng)劑篩選用微流控芯片組，該微流控芯片組由三
個(gè)功能化微流控芯片單元組成 第一個(gè)功能化微流控芯片單元是細(xì)胞趨化檢測(cè)單元； 第二個(gè)功能化微流控芯片單元是受體內(nèi)吞檢測(cè)單元； 第三個(gè)功能化微流控芯片單元是鈣離子瞬間流動(dòng)過(guò)程監(jiān)測(cè)單元； 所述細(xì)胞趨化檢測(cè)單元由2 99個(gè)相同的結(jié)構(gòu)單元組成，這些結(jié)構(gòu)單元之間通過(guò)
一個(gè)公共樣品池相連接；每個(gè)結(jié)構(gòu)單元由一個(gè)短而細(xì)的凝膠通道、一個(gè)上細(xì)下粗的細(xì)胞灌
注通道和細(xì)胞遷移通道組成；細(xì)胞遷移通道位于凝膠通道和細(xì)胞灌注通道之間； 所述受體內(nèi)吞檢測(cè)單元由位于芯片中心的細(xì)胞培養(yǎng)陣列、位于芯片四周的細(xì)胞灌
4注通道、化合物_量子點(diǎn)灌注通道和沖洗液灌注通道組成； 所述鈣離子瞬間流動(dòng)過(guò)程監(jiān)測(cè)單元由位于芯片中心的細(xì)胞培養(yǎng)室、位于芯片四周 并與細(xì)胞培養(yǎng)室相連的細(xì)胞灌注通道、化合物灌注通道和染料/沖洗液灌注通道組成。
本發(fā)明提供的甲酰肽受體激動(dòng)劑篩選用微流控芯片組，所述受體內(nèi)吞檢測(cè)單元中 的細(xì)胞培養(yǎng)陣列由2 99個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室相互串聯(lián)作為一列，2 99列相互并聯(lián)構(gòu)成陣列式 細(xì)胞培養(yǎng)模塊，每?jī)闪械娜肟诤统隹诰鸺?jí)相互連接，最終連接成一個(gè)入口和一個(gè)出口通 道；入口通道的末端有兩個(gè)分支，分別與化合物_量子點(diǎn)通道和沖洗液通道相連接，出口通 道的末端與細(xì)胞灌注通道相連接。 本發(fā)明提供的甲酰肽受體激動(dòng)劑篩選用微流控芯片組，所述的細(xì)胞培養(yǎng)陣列每一 列細(xì)胞培養(yǎng)室的個(gè)數(shù)相同，并且每?jī)闪屑?xì)胞培養(yǎng)室由微通道相連接，這些微通道再每?jī)蓚€(gè) 互相連接，最終連接成一個(gè)通道。 本發(fā)明提供了一種基于微流控芯片組的甲酰肽受體激動(dòng)劑篩選方法，方法過(guò)程 為 進(jìn)行細(xì)胞趨化分析首先向凝膠通道內(nèi)緩慢注入液態(tài)基底膜樣物質(zhì)(BME)，當(dāng)在 顯微鏡下看到BME快要充滿整個(gè)凝膠通道時(shí)，立即停止注入，芯片靜置數(shù)分鐘后，依次加入 50%乙醇(v/v)、磷酸鹽緩沖液PBS和細(xì)胞培養(yǎng)基，芯片置于37t:數(shù)分鐘，使BME完全固化， 利用細(xì)胞灌注通道兩端儲(chǔ)液池中液面高度差所產(chǎn)生的靜壓力將細(xì)胞引入灌注通道，芯片放 入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁后，取出芯片拍照，記錄遷移通道內(nèi)初始細(xì)胞個(gè)數(shù)，向基底膜 /化合物入口加入備選化合物，芯片在培養(yǎng)箱中靜置數(shù)小時(shí)后拍照，記錄遷移通道內(nèi)終了細(xì) 胞個(gè)數(shù)； 進(jìn)行甲酰肽受體內(nèi)吞分析將細(xì)胞懸液由細(xì)胞入口注入芯片，待細(xì)胞均勻進(jìn)入各 微培養(yǎng)室并沉降后，將芯片放入培養(yǎng)箱中過(guò)夜，細(xì)胞充分貼壁并伸展，將標(biāo)記了量子點(diǎn)的先 導(dǎo)化合物溶液引入芯片，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行剌激，將洗滌液引入芯片對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗，最后將芯片 置于熒光顯微鏡下成像； 進(jìn)行鈣離子瞬間流動(dòng)(釋放)過(guò)程監(jiān)測(cè)細(xì)胞懸液由細(xì)胞入口注入芯片，待細(xì)胞沉 降后將芯片放入培養(yǎng)箱中過(guò)夜，細(xì)胞充分貼壁并伸展，向芯片注入Hank' s balanced salt saline (HBSS)溶液洗滌細(xì)胞兩次，加入鈣離子熒光染料孵育一段時(shí)間，再向芯片注入HBSS 溶液洗滌細(xì)胞兩次，芯片置于熒光顯微鏡下，打開(kāi)激發(fā)光源后立刻對(duì)細(xì)胞施加化合物剌激， 并開(kāi)啟CCD快門(mén)，記錄細(xì)胞內(nèi)鈣離子瞬間流動(dòng)過(guò)程。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn) 1.本發(fā)明所述的細(xì)胞趨化分析微流控芯片只依靠擴(kuò)散作用，而不需要任何其它輔 助設(shè)備就能夠在細(xì)胞遷移通道內(nèi)形成化合物濃度梯度。 2.本發(fā)明所述的細(xì)胞趨化分析微流控芯片細(xì)胞遷移通道內(nèi)形成的化合物濃度梯 度是一種靜態(tài)梯度，使細(xì)胞在溶液靜止環(huán)境下接受剌激，避免了原有方法中必需依靠溶液 流動(dòng)形成濃度梯度時(shí)，流體剪切力對(duì)細(xì)胞帶來(lái)的影響。 3.本發(fā)明所述的鈣離子瞬間流動(dòng)監(jiān)測(cè)微流控芯片能夠在單細(xì)胞分辨率水平上實(shí) 時(shí)監(jiān)測(cè)受激后細(xì)胞內(nèi)鈣離子瞬間流動(dòng)過(guò)程。 4.本發(fā)明的創(chuàng)造性是針對(duì)不同細(xì)胞功能分析實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)設(shè)計(jì)了一組芯片，可分別 進(jìn)行細(xì)胞趨化、受體內(nèi)吞檢測(cè)和鈣離子瞬間流動(dòng)(釋放)過(guò)程監(jiān)測(cè)，通過(guò)綜合評(píng)價(jià)備選化合
5物對(duì)甲酰肽受體信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響來(lái)判斷其生物學(xué)活性。 5.與傳統(tǒng)技術(shù)相比，微流控芯片實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并且 省去了細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)中鋪膜、取膜、細(xì)胞刮除、固定、染色等一系列繁瑣操作，大大節(jié)省分析 時(shí)間，降低檢測(cè)成本。


圖1為細(xì)胞趨化檢測(cè)微流控芯片的整體設(shè)計(jì)圖(a)和其中一個(gè)結(jié)構(gòu)單元的局部放 大圖(b)，其中(l)為凝膠通道，(2)為細(xì)胞灌注通道，(3)為細(xì)胞遷移通道，(4)為凝膠入 口， (5)為細(xì)胞入口， (6)為中心廢液池，(7)為細(xì)胞廢液池； 圖2為甲酰肽受體內(nèi)吞檢測(cè)微流控芯片設(shè)計(jì)圖，其中(l)為化合物-量子點(diǎn)入 口， (2)為沖洗液入口， (3)為細(xì)胞培養(yǎng)陣列，(4)為細(xì)胞入口 ； 圖3為鈣離子瞬間流動(dòng)過(guò)程監(jiān)測(cè)微流控芯片設(shè)計(jì)圖，其中(l)為細(xì)胞入口， (2)為
染料/沖洗液入口， (3)為激動(dòng)劑入口， (4)為廢液池； 圖4為典型的預(yù)LF和GSH誘導(dǎo)RBL-FPR細(xì)胞趨化結(jié)果； 圖5為典型的預(yù)LF誘導(dǎo)RBL-FPR細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的劑量效應(yīng)結(jié)果； 圖6為典型的GSH誘導(dǎo)RBL-FPR細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的劑量效應(yīng)結(jié)果； 圖7為典型的預(yù)LF-QD作用RBL-FPR細(xì)胞結(jié)果； 圖8為典型的GSH-QD作用RBL-FPR細(xì)胞結(jié)果； 圖9為預(yù)LF誘導(dǎo)RBL-FPR細(xì)胞發(fā)生鈣離子釋放的劑量效應(yīng)關(guān)系； 圖10為預(yù)LF誘導(dǎo)RBL-FPR細(xì)胞發(fā)生鈣離子釋放的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此而限制本發(fā)明。
實(shí)施例1 BME從_201:冰箱取出后置于冰上，待其溶化成液態(tài)時(shí)用移液器吸取0. 1 y L，將圖 l所示芯片置于光學(xué)顯微鏡下，吸頭對(duì)準(zhǔn)基底膜通道入口處并緩慢向通道內(nèi)注入液態(tài)BME， 當(dāng)在顯微鏡下看到液體快要充滿整個(gè)基底膜通道時(shí)，立即移走吸頭，芯片靜置5min，依次向 芯片通道內(nèi)加入50%乙醇(v/v)、 PBS和細(xì)胞培養(yǎng)基，芯片置于37。C培養(yǎng)箱中15min， BME 完全固化。芯片置于光學(xué)顯微鏡下，各樣品池中加入7 ii L培養(yǎng)基，從外圈細(xì)胞廢液池中抽 取liiL培養(yǎng)基，并立即向細(xì)胞入口注入liiL細(xì)胞懸液，絕大部分細(xì)胞進(jìn)入灌注通道并停 留，只有極少數(shù)細(xì)胞進(jìn)入遷移通道，將芯片放入培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞貼壁后，取出芯片拍照，記 錄遷移通道內(nèi)初始細(xì)胞個(gè)數(shù)。分別向四個(gè)結(jié)構(gòu)單元的凝膠樣品池中滴加濃度為0nM、4nM、 40nM和400nM的預(yù)LF或GSH，芯片置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。由于N-甲酰肽物質(zhì)(預(yù)LF)和還原 型谷胱甘肽(GSH)都是由三個(gè)氨基酸構(gòu)成的小肽，在靜止?fàn)顟B(tài)下，這類(lèi)小分子藥物能夠透 過(guò)BME凝膠向細(xì)胞入口端擴(kuò)散，在遷移通道中形成濃度梯度。 一旦其中一種物質(zhì)與細(xì)胞膜 上的FPR結(jié)合，就會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)FPR信號(hào)傳導(dǎo)通路，細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)，由灌注通道和遷移 通道的交叉處進(jìn)入遷移通道并向藥物濃度高的方向遷移，藥物作用4h后，記錄遷移通道內(nèi) 終了細(xì)胞個(gè)數(shù)。圖4為典型的預(yù)LF和GSH作用表達(dá)人甲酰肽受體的大鼠嗜堿性粒白血病 細(xì)胞(RBL-FPR)后的結(jié)果，可以看出，與0小時(shí)相比，預(yù)LF作用4小時(shí)后遷移通道內(nèi)細(xì)胞數(shù)
6量明顯增多，然而GSH作用的細(xì)胞卻無(wú)此現(xiàn)象。計(jì)算備選化合物的趨化指數(shù)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組 相比，預(yù)LF實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞都發(fā)生了明顯的趨化作用，尤其以40nM作用最為明顯，4nM和400nM 次之，而GSH作用后趨化指數(shù)沒(méi)有增強(qiáng)(見(jiàn)圖5和圖6)。
實(shí)施例2 RBL-FPR細(xì)胞懸液由細(xì)胞入口注入圖2所示芯片，待細(xì)胞均勻進(jìn)入各微培養(yǎng)室并 沉降后，將芯片放入培養(yǎng)箱中過(guò)夜，細(xì)胞充分貼壁并伸展。將標(biāo)記了量子點(diǎn)(quantum dot, QD)的化合物溶液(預(yù)LF-QD和GSH-QD)引入芯片，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行剌激，芯片置于37°C C02培養(yǎng) 箱中45min后，將洗滌液引入芯片，沖洗細(xì)胞約45s，最后將芯片置于熒光顯微鏡下成像，檢 測(cè)甲酰肽受體內(nèi)吞情況，汞燈激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為330-385nm，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為大于420nm，在同一 視場(chǎng)拍攝熒光照片和明場(chǎng)照片。分別優(yōu)化了化合物_量子點(diǎn)與RBL-FPR細(xì)胞作用時(shí)間，作 用濃度和洗滌時(shí)間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物_量子點(diǎn)溶液稀釋40倍，與細(xì)胞在37t:孵育45min， 然后用PBS緩沖液沖洗約45s，效果較好。由圖7、圖8可以看出，絕大多數(shù)與預(yù)LF-QD孵育 的細(xì)胞都結(jié)合了量子點(diǎn)，并且部分預(yù)LF-QD已經(jīng)位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，然而與GSH-QD孵育的細(xì) 胞表面卻沒(méi)有結(jié)合量子點(diǎn)。這說(shuō)明預(yù)LF-QD能夠與細(xì)胞膜上的FPR受體結(jié)合，并隨發(fā)生內(nèi) 吞的受體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而GSH-QD由于沒(méi)有與FPR受體結(jié)合而被沖洗掉了 。
實(shí)施例3 RBL-FPR細(xì)胞懸液由細(xì)胞入口注入圖3所示芯片，待細(xì)胞沉降后將芯片放入培養(yǎng) 箱中過(guò)夜，細(xì)胞充分貼壁并伸展。抽干樣品池中的培養(yǎng)基，向芯片注入HBSS溶液洗滌細(xì)胞 兩次，加入預(yù)先用HBSS稀釋成5 g/mL的鈣離子熒光染料Fluo-4AM，芯片放入培養(yǎng)箱中孵 育45min，抽干樣品池中的染料，再次向芯片注入HBSS溶液洗滌細(xì)胞兩次，以熒光顯微鏡 記錄細(xì)胞受激引起的鈣離子瞬間流動(dòng)過(guò)程，汞燈激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為470-495nm，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為 510-550nm，打開(kāi)激發(fā)光源后立刻施加化合物剌激，并開(kāi)啟CCD快門(mén)，以Is/張的速度連續(xù) 拍攝50張照片?？疾炝藵舛确謩e為0nM，4nM，40nM和400nM的預(yù)LF或GSH誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣 離子瞬間流動(dòng)的作用效果。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，預(yù)LF作用組細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯升高， 而GSH作用組細(xì)胞未見(jiàn)熒光強(qiáng)度增加。由于細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與胞內(nèi)鈣離子濃度成正比，說(shuō) 明預(yù)LF作用組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯增加，預(yù)LF誘導(dǎo)RBL-FPR發(fā)生了鈣離子瞬間流動(dòng)，而 GSH沒(méi)有誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鈣離子瞬間流動(dòng)。進(jìn)一步考察預(yù)LF作用RBL-FPR細(xì)胞的劑量效應(yīng)和 時(shí)間效應(yīng)，從圖9可以看出，鈣離子瞬間流動(dòng)強(qiáng)度隨預(yù)LF作用濃度升高而增強(qiáng)，而不同濃度 預(yù)LF誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鈣離子瞬間流動(dòng)的速度也不同，預(yù)LF濃度越高，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度達(dá)到 峰值所需時(shí)間越短(圖io)。
權(quán)利要求
一種甲酰肽受體激動(dòng)劑篩選用微流控芯片組，其特征在于該微流控芯片組由三個(gè)功能化微流控芯片單元組成第一個(gè)功能化微流控芯片單元是細(xì)胞趨化檢測(cè)單元；第二個(gè)功能化微流控芯片單元是受體內(nèi)吞檢測(cè)單元；第三個(gè)功能化微流控芯片單元是鈣離子瞬間流動(dòng)過(guò)程監(jiān)測(cè)單元；所述細(xì)胞趨化檢測(cè)單元由2～99個(gè)相同的結(jié)構(gòu)單元組成，這些結(jié)構(gòu)單元之間通過(guò)一個(gè)公共樣品池相連接；每個(gè)結(jié)構(gòu)單元由凝膠通道、細(xì)胞灌注通道和細(xì)胞遷移通道組成；所述受體內(nèi)吞檢測(cè)單元由細(xì)胞培養(yǎng)陣列、細(xì)胞灌注通道、化合物-量子點(diǎn)灌注通道和沖洗液灌注通道組成；所述鈣離子瞬間流動(dòng)過(guò)程監(jiān)測(cè)單元由細(xì)胞培養(yǎng)室、細(xì)胞灌注通道、化合物灌注通道和染料/沖洗液灌注通道組成。
2. 按照權(quán)利要求1所述甲酰肽受體激動(dòng)劑篩選用微流控芯片組，其特征在于所述細(xì)胞趨化檢測(cè)單元中的細(xì)胞遷移通道位于凝膠通道和細(xì)胞灌注通道之間。
3. 按照權(quán)利要求1所述甲酰肽受體激動(dòng)劑篩選用微流控芯片組，其特征在于所述受體內(nèi)吞檢測(cè)單元中的細(xì)胞培養(yǎng)陣列位于芯片的中心。
4. 按照權(quán)利要求1所述甲酰肽受體激動(dòng)劑篩選用微流控芯片組，其特征在于所述受體內(nèi)吞檢測(cè)單元中的細(xì)胞灌注通道位于芯片的四周。
5. 按照權(quán)利要求1所述甲酰肽受體激動(dòng)劑篩選用微流控芯片組，其特征在于所述受體內(nèi)吞檢測(cè)單元中的細(xì)胞培養(yǎng)陣列由2 99個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室相互串聯(lián)作為一列，2 99列相互并聯(lián)構(gòu)成陣列式細(xì)胞培養(yǎng)模塊，每?jī)闪械娜肟诤统隹诰鸺?jí)相互連接，最終連接成一個(gè)入口和一個(gè)出口通道；入口通道的末端有兩個(gè)分支，分別與化合物-量子點(diǎn)通道和沖洗液通道相連接，出口通道的末端與細(xì)胞灌注通道相連接。
6. 按照權(quán)利要求1或5所述甲酰肽受體激動(dòng)劑篩選用微流控芯片組，其特征在于所述的細(xì)胞培養(yǎng)陣列每一列細(xì)胞培養(yǎng)室的個(gè)數(shù)相同，并且每?jī)闪屑?xì)胞培養(yǎng)室由微通道相連接，這些微通道再每?jī)蓚€(gè)互相連接，最終連接成一個(gè)通道。
7. 按照權(quán)利要求1所述甲酰肽受體激動(dòng)劑篩選用微流控芯片組，其特征在于所述鈣離子瞬間流動(dòng)過(guò)程監(jiān)測(cè)單元中的細(xì)胞培養(yǎng)室與細(xì)胞灌注通道相連。
8. —種基于權(quán)利要求1所述微流控芯片組的甲酰肽受體激動(dòng)劑篩選方法，其特征在于方法過(guò)程為進(jìn)行細(xì)胞趨化分析首先向凝膠通道內(nèi)緩慢注入液態(tài)基底膜樣物質(zhì)BME，當(dāng)在顯微鏡下看到BME快要充滿整個(gè)凝膠通道時(shí)，立即停止注入，芯片靜置后，依次加入50X乙醇、磷酸鹽緩沖液PBS和細(xì)胞培養(yǎng)基，芯片置于37°C ，使BME完全固化，利用細(xì)胞灌注通道兩端儲(chǔ)液池中液面高度差所產(chǎn)生的靜壓力將細(xì)胞引入灌注通道，芯片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁后，取出芯片拍照，記錄遷移通道內(nèi)初始細(xì)胞個(gè)數(shù)，向基底膜/化合物入口加入備選化合物，芯片在培養(yǎng)箱中靜置后拍照，記錄遷移通道內(nèi)終了細(xì)胞個(gè)數(shù)；進(jìn)行甲酰肽受體內(nèi)吞分析將細(xì)胞懸液由細(xì)胞入口注入芯片，待細(xì)胞均勻進(jìn)入各微培養(yǎng)室并沉降后，將芯片放入培養(yǎng)箱中過(guò)夜，細(xì)胞充分貼壁并伸展，將標(biāo)記了量子點(diǎn)的先導(dǎo)化合物溶液引入芯片，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行剌激，將洗滌液引入芯片對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗，最后將芯片置于熒光顯微鏡下成像；進(jìn)行鈣離子瞬間流動(dòng)過(guò)程監(jiān)測(cè)細(xì)胞懸液由細(xì)胞入口注入芯片，待細(xì)胞沉降后將芯片放入培養(yǎng)箱中過(guò)夜，細(xì)胞充分貼壁并伸展，向芯片注入Hank's balanced salt saline溶液洗滌細(xì)胞兩次，加入鈣離子熒光染料孵育，再向芯片注入HBSS溶液洗滌細(xì)胞兩次，芯片置于熒光顯微鏡下，打開(kāi)激發(fā)光源后立刻對(duì)細(xì)胞施加化合物剌激，并開(kāi)啟CCD快門(mén)，記錄細(xì)胞內(nèi)鈣離子瞬間流動(dòng)過(guò)程。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種甲酰肽受體激動(dòng)劑篩選用微流控芯片組及篩選方法，該微流控芯片組由細(xì)胞趨化檢測(cè)單元、受體內(nèi)吞檢測(cè)單元、鈣離子瞬間流動(dòng)過(guò)程監(jiān)測(cè)單元三個(gè)微流控芯片單元組成；本發(fā)明針對(duì)不同細(xì)胞功能分析實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)設(shè)計(jì)了一組芯片，可分別進(jìn)行細(xì)胞趨化、受體內(nèi)吞檢測(cè)和鈣離子瞬間流動(dòng)(釋放)過(guò)程監(jiān)測(cè)，通過(guò)綜合評(píng)價(jià)備選化合物對(duì)甲酰肽受體信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響來(lái)判斷其生物學(xué)活性；與傳統(tǒng)技術(shù)相比，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并且省去了細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)中鋪膜、取膜、細(xì)胞刮除、固定、染色等一系列繁瑣操作，大大節(jié)省了分析時(shí)間，降低了檢測(cè)成本。
文檔編號(hào)G01N21/76GK101782569SQ20091001022
公開(kāi)日2010年7月21日 申請(qǐng)日期2009年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月21日
發(fā)明者葉囡楠, 林炳承, 秦建華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所