一種豬瘟抗體檢測系統(tǒng)及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和家畜疫病診斷領(lǐng)域，具體涉及一種豬癌抗體檢測系統(tǒng)及 其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬癌是由豬癌病毒（Classical swine fever virus, CSFV)引起的一種高度接觸 性病毒傳染病，傳播快、流行廣、發(fā)病率和死亡率高，對我國養(yǎng)豬業(yè)危害極大。根據(jù)臨床癥狀 和病程長短可將豬癌分為急性型、慢性型、溫和型。病豬和帶毒母豬是豬癌病毒的主要傳染 源。世界動物衛(wèi)生組織將其列為A類疾病，中國《動物防疫法》將其列為一類疫病。
[0003] 豬癌病毒屬黃病毒科癌病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為12. 3肺，含 有一個大的開放閱讀框（ORF)，編碼一個多聚蛋白，此多聚蛋白經(jīng)病毒和宿主細(xì)胞的酶作 用，形成4個成熟的結(jié)構(gòu)蛋白（C、Erns、El、E2)和至少7個非結(jié)構(gòu)蛋白（化ro、P7、NS2、NS3、 NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。
[0004] 酶聯(lián)免疫吸附試驗巧nzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)因為其操作簡 便，快速敏感的優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于市場上的豬癌抗體監(jiān)測方法。目前，市場上的豬癌抗體診 斷化ISA試劑盒大多數(shù)是檢測豬血清中的E2蛋白抗體，而化ns蛋白作為包被原，僅用于鑒 別診斷亞單位疫苗免疫后疫苗產(chǎn)生的抗體和野毒感染產(chǎn)生的抗體，且特異性和靈敏度均不 理想。此類E2蛋白抗體檢測化ISA試劑盒針對豬癌大規(guī)模的群體診斷中，能夠發(fā)揮有效的 作用。
[0005] 但是對于一些早期感染或者豬癌抗體水平低下的臨床樣本，單純檢測E2蛋白抗 體，有出現(xiàn)假陰性的可能。因此，建立一種準(zhǔn)確可靠的新型化ISA檢測手段，用來彌補現(xiàn)有 技術(shù)中單純檢測E2蛋白抗體的不足，對疾病的預(yù)防和控制有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種豬癌抗體檢測化ISA試劑盒，W及 該試劑盒的制備與使用方法。
[0007] 本發(fā)明的第一方面是一種豬癌抗體檢測系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包被抗原為豬癌病毒E2 蛋白、Erns蛋白。
[0008] 術(shù)語"豬癌病毒E2蛋白"位于病毒囊膜表面，由373個氨基酸組成，是豬癌病 毒主要保護(hù)性抗原，是抗豬癌病毒感染的主要保護(hù)性抗原（李竊，王宇飛，王燈等.表 達(dá)豬癌病毒E2蛋白的BacMam病毒的構(gòu)建及其免疫原性分析.生物化學(xué)與生物物理進(jìn) 展，2009, 36(7) :916-922)。
[0009] 術(shù)語"豬癌病毒化ns蛋白"為病毒的囊膜糖蛋白，由227個氨基酸組成，無跨 膜區(qū)（高華峰，李富祥，張念祖等.豬癌病毒化ns基因的克隆及原核表達(dá).動物醫(yī)學(xué)進(jìn) 展，2007, 28 (2) :22-24)。
[0010] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的豬癌抗體檢測系統(tǒng)中，所述豬癌病 毒E2蛋白為實質(zhì)上編碼序列SEQ ID No. 2的蛋白，所述化ns蛋白為實質(zhì)上編碼序列SEQ ID No. 4編碼的蛋白。
[0011] 術(shù)語"實質(zhì)上編碼"意指通過添加、刪除、替換一個或多個氨基酸后仍然保持原有 蛋白相同或相近功能。
[0012] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的豬癌抗體檢測系統(tǒng)中，所述豬癌病 毒E2蛋白含量為100-400ng，化ns蛋白含量為25-lOOng。
[0013] 作為本發(fā)明的一種最優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的豬癌抗體檢測系統(tǒng)中，所述豬癌 病毒E2蛋白含量為2(K)ng，化ns蛋白含量為50ng。
[0014] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的豬癌抗體檢測系統(tǒng)中，所述豬癌病 毒E2蛋白和化ns蛋白為真核表達(dá)體系表達(dá)的重組蛋白。
[0015] 作為本發(fā)明的一種最優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的豬癌抗體檢測系統(tǒng)中，所述豬癌 病毒E2蛋白和化ns蛋白為重組桿狀病毒表達(dá)體系表達(dá)的重組蛋白。
[0016] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的豬癌抗體檢測系統(tǒng)中，所述的檢測 系統(tǒng)包括化ISA檢測試劑盒、試紙。
[0017] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的豬癌抗體化ISA檢測試劑盒中，試 劑盒包括包被所述豬癌病毒E2蛋白和化ns蛋白的酶標(biāo)板、樣品稀釋液、洗涂液、封閉液、帶 標(biāo)記的二抗、顯色液、顯色液、終止液、陽性豬血清對照W及陰性豬血清對照。
[001引作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的豬癌抗體化ISA檢測試劑盒中，所 述樣品稀釋液為含有0. 05% V/VTween-20和10% V/V脫脂奶的磯酸鹽緩沖液；
[0019] 所述洗涂液為含有0. 05 % V/VTween-20的磯酸鹽緩沖液；
[0020] 所述封閉液為1 % W/VBSA的磯酸鹽緩沖液、5% W/V脫脂奶粉的磯酸鹽緩沖液、 1. 5 % V/V明膠的磯酸鹽緩沖液或5 % V/V轅牛血清FCS的磯酸鹽緩沖液中的任一種；
[0021] 所述顯色液包括顯色液A和顯色液B液，所述顯色液A液含TMB20mg、無水己醇 IOml,并用d地2〇定容至100mL ;所述顯色液B含巧樣酸2. Ig、無水胞2冊〇42. 82g、0. 75% W/ V的過氧化氨尿素0. 64ml，并用d地2〇定容至100mL ;
[0022] 所述終止液為2M的H2SO4。
[0023] 術(shù)語"磯酸鹽緩沖液"是指含有磯酸或其鹽并被調(diào)至理想抑值的溶液，是生物化 學(xué)研究中使用最為廣泛的一種緩沖液。一般地，磯酸鹽緩沖液是從磯酸或磯酸鹽（包括但 不限于鋼和鐘鹽）制備的。本領(lǐng)域已經(jīng)知道一些磯酸鹽，例如磯酸二氨鋼和磯酸二氨鐘、磯 酸氨二鋼和磯酸氨二鐘、磯酸鋼和磯酸鐘。已經(jīng)知道磯酸鹽是W鹽的水合物形式存在的。由 于緩沖液的二級解離作化緩沖的抑值范圍很寬，例如約4-10的范圍，優(yōu)選約5-9的范圍， 更有選約6-8的范圍，最優(yōu)選約7. 4。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述磯酸鹽緩沖液為含氯化鋼和氯化 鐘的磯酸鹽緩沖液。
[0024] 本發(fā)明的另一方面是一種所述豬癌抗體檢測系統(tǒng)的制備方法，所述制備方法包括 W下步驟；（1)克隆表達(dá)所述豬癌病毒抗原性蛋白E2蛋白、Erns蛋白，使用所述E2蛋白和 化ns蛋白包被酶標(biāo)板；（2)制備或配制樣品稀釋液、洗涂液、封閉液、HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG、 顯色液A液、顯色液B液、終止液、陽性豬血清對照W及陰性豬血清對照；W及（3)將步驟 (1)與（2)所制備的各成分組裝成試劑盒。
[0025] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的豬癌抗體檢測系統(tǒng)的制備方法中， 所述步驟（I)中克隆表達(dá)E2蛋白為實質(zhì)上編碼序列SEQ ID No. 2的蛋白，所述化ns蛋白 為實質(zhì)上編碼序列SEQ ID No. 4編碼的蛋白；所述E2蛋白含量為100-40化g/孔，化ns蛋 白含量為25-lOOng/孔；優(yōu)選地，所述豬癌病毒E2蛋白含量為20化g/孔，Erns蛋白含量為 5化g/孔。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的豬癌抗體檢測系統(tǒng)的制備方法中， 所述步驟（1)使用真核表達(dá)體系表達(dá)豬癌病毒E2蛋白和化ns蛋白；優(yōu)選地，所述真核表達(dá) 體系為重組桿狀病毒表達(dá)體系。
[0026] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的豬癌抗體檢測系統(tǒng)的制備方法中， 所述樣品稀釋液為含有0. 05% V/VTween-20和10% V/V脫脂奶的磯酸鹽緩沖液；
[0027] 所述洗涂液為含有0. 05 % V/VTween-20的磯酸鹽緩沖液；
[0028] 所述封閉液為1% W/VBSA的磯酸鹽緩沖液、5% W/V脫脂奶粉的磯酸鹽緩沖液、 1. 5 % V/V明膠的磯酸鹽緩沖液或5 % V/V轅牛血清FCS的磯酸鹽緩沖液中的任一種；
[0029] 所述顯色液包括顯色液A和顯色液B液，所述顯色液A液含TMB20mg、無水己醇 IOml,并用d地2〇定容至100mL ;所述顯色液B含巧樣酸2. Ig、無水胞2冊〇42. 82g、0. 75% W/ V的過氧化氨尿素0. 64ml，并用d地2〇定容至100mL ;
[0030] 所述終止液為2M的H2SO4。
[0031] 本發(fā)明的另一方面是所述試劑盒的使用方法，作為使用方法的一種優(yōu)選實施方 式，所述使用方法包括W下步驟：
[0032] (1)將待檢血清和陰陽性豬血清用稀釋液做100倍稀釋。
[003引 似將稀釋后的樣品100 加入至ELISA反應(yīng)板，37°C反應(yīng)比。每孔加入200 洗涂液洗3次，每次Imin,洗完后用吸水紙拍干。
[0034] 做每孔加入100 的1:10000倍稀釋（V/V)的HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG, 37 °C反 應(yīng)40min，每孔加入200 U 1洗涂液洗5次，每次Imin,洗完后用吸水紙拍干。
[0035] (4)每孔加入顯色液A液和B液各50 U 1，室溫放置IOmin。
[0036] (5)加入50 U 1終止液終止反應(yīng)