本發(fā)明涉及一種豬瘟-豬圓環(huán)二聯(lián)亞單位疫苗及其制備方法和應(yīng)用，屬于動物疫苗與獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

豬瘟是由豬瘟病毒(classicalswinefevervirus,csfv)引起的一種急性、熱性、致死性疾病。豬瘟具有高度接觸傳染性、發(fā)病急、高熱稽留和小血管壁變性引起廣泛出血、梗塞和壞死等病變特征。家養(yǎng)豬和野生豬是其唯一的天然宿主。世界動物衛(wèi)生組織(oie)將其定為a類傳染病，我國《動物防疫法》將其列為一類傳染病。豬瘟是目前危害我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一。

豬瘟病毒屬于黃病毒科、瘟病毒屬成員，為單鏈線狀rna病毒。病毒粒子略呈圓形，具有脂蛋白囊膜，病毒粒子表面有脆弱的纖突結(jié)構(gòu)。csfv基因組全長約12.5kb，僅含有1個大的開放性閱讀框(orf)，此orf編碼約3898個氨基酸殘基、分子量約438kda的多聚蛋白。此多聚蛋白在翻譯的同時和在翻譯后經(jīng)病毒與宿主細(xì)胞蛋白酶加工成12種成熟蛋白，依次為npro,c,erns,e1,e2,p7,ns2,ns3,ns4a,ns4b,ns5a,ns5b，其中c,erns,e1和e2為結(jié)構(gòu)蛋白,其余為非結(jié)構(gòu)蛋白。e2是csfv最主要的免疫原性蛋白，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體并且能夠保護(hù)豬抵抗csfv強(qiáng)毒株的攻擊，也是研究豬瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。

豬圓環(huán)病毒2型(porcinecircovirus,pcv-2)被認(rèn)為是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(pmws)、豬增生性壞死性肺炎(pnp)、豬皮膚與腎病綜合征(pdns)、豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合征(prdc)、豬繁殖障礙、豬先天性震顫及腸炎等疾病的主要病原，統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒2型相關(guān)疾病，而且pcv-2感染還會引起免疫抑制，極易導(dǎo)致其它病原混合感染或繼發(fā)感染，是目前嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的病原之一。在我國，目前幾乎100％的豬場為豬圓環(huán)病毒2型陽性。

pcv2是目前已知的最小的病毒之一，其基因組是一條共價閉合單鏈dna，約1.76kb～1.77kb。一般認(rèn)為，pcv2僅有3個開放閱讀框(openreadingframes，orfs)可以編碼蛋白。其中orf2又稱為cap基因，位于互補(bǔ)鏈上，呈逆時針方向，負(fù)責(zé)編碼唯一的結(jié)構(gòu)蛋白cap蛋白，其氨基酸長度為233～234氨基酸殘基。cap蛋白也是pcv2的主要抗原，能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生并且能夠保護(hù)豬抵抗pcv2強(qiáng)毒株的攻擊，也是研究豬圓環(huán)病毒2型基因工程疫苗的重要靶蛋白。

在我們規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展中，由于頻繁引種、生物安全防范意識較差、管理不到位、人員專業(yè)素質(zhì)較低等原因?qū)е履壳耙?guī)?；i場疾病多且雜，疫苗免疫仍是防治這些疾病爆發(fā)的首要選擇。因此，目前豬用疫苗很多，一頭商品豬在整個生長周期中，要進(jìn)行多次免疫接種。在實際操作中，多針次、多劑量、多種疾病免疫程序難以合理安排，這樣既繁瑣、費時、費力、增加成本，而且容易造成遺漏，直接影響免疫效果和豬群的健康。因此，研究能同時預(yù)防2種或2種以上疾病的豬用疫苗是豬用獸用制品的一個發(fā)展方向。

目前，豬瘟疫苗主要是弱毒活疫苗，主要有3種，即豬瘟細(xì)胞活疫苗(細(xì)胞苗)、豬瘟乳兔組織活疫苗(組織苗)、豬瘟脾淋活疫苗(脾淋苗)。這些疫苗普遍存在生產(chǎn)工藝復(fù)雜、批間差異大、易受外援病毒污染等缺點，另外，由于長期使用活疫苗，導(dǎo)致無法從根本上凈化豬瘟。目前，圓環(huán)疫苗主要有全病毒滅活苗和桿狀病毒表達(dá)cap蛋白的滅活疫苗。由于目前豬瘟疫苗是活疫苗，若與其他疫苗配制聯(lián)苗，可能會導(dǎo)致豬瘟病毒與其他病毒的基因組或其他疫苗中殘留的核酸重組，易引起豬瘟病毒的變異，存在極大的生物安全隱患，不利于豬瘟與其他疾病研究聯(lián)苗；再次，活疫苗與其他疫苗聯(lián)用，可能會存在免疫干擾的問題，最后，有的將活疫苗與其他疫苗在制備聯(lián)苗時分開包裝，使用時再混合在一起，這樣一會造成包裝成本升高，二來不方便終端用戶使用。由于亞單位疫苗是病毒的抗原蛋白組成，不存在病毒重組和變異的隱患，也不存在免疫干擾的問題，更不用分開包裝并在使用時混合，因此是研究豬用聯(lián)苗一個非常好的方向。豬瘟病毒e2蛋白的等電點是6.3，而豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白的等電點是9.4，在中性緩沖液中(如pbs、生理鹽水等)，豬瘟病毒e2蛋白帶正電荷，豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白帶負(fù)電荷，因此兩種蛋白在同一體系中存放時間較長時，可能會結(jié)合從而沉淀，從而會影響聯(lián)苗的保存期和免疫效果。因此，在豬瘟和豬圓環(huán)二聯(lián)亞單位疫苗的研究中需要克服這一影響穩(wěn)定性的重要問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題：一是開發(fā)一種可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)、質(zhì)量好、無免疫干擾且能夠同時預(yù)防豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型感染的疫苗，二是克服目前規(guī)模化豬場存在的多針次、多劑量、多種疾病免疫程序難以合理安排的問題；三是克服利用豬瘟活疫苗研制聯(lián)苗時可能導(dǎo)致豬瘟病毒與其他病毒的基因組或其他疫苗中殘留的核酸重組，引起豬瘟病毒的變異，從而存在極大的生物安全隱患以及可能存在的免疫干擾的問題；四是避免使用豬瘟活疫苗制備二聯(lián)苗時需要將豬瘟病毒和其他疾病抗原分開包裝并在使用時混合的麻煩。

本發(fā)明提供了一種豬瘟-豬圓環(huán)二聯(lián)亞單位疫苗，所述疫苗包含豬瘟病毒e2蛋白、豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白以及藥學(xué)上可以接受的佐劑；所述疫苗中每頭份含豬瘟病毒e2蛋白7.5～140μg，所述疫苗中每頭份含豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白25～200μg。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述豬瘟病毒e2蛋白為全長的豬瘟病毒e2蛋白、或截斷的豬瘟病毒e2蛋白。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白為全長的豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白、或截斷的豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述疫苗中每頭份含豬瘟病毒e2蛋白為30μg。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述疫苗中每頭份含豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白為60μg。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述藥學(xué)上可以接受的佐劑為水包油佐劑(如10號白油等)、水包油包水佐劑(如isa201vg佐劑、isa206vg佐劑等)、油包水佐劑(如isa15avg、isa35vg佐劑等)、水佐劑(如鋁膠佐劑、ims251cvg佐劑等)，優(yōu)選的為montanidegel01pr佐劑。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述疫苗還含有防腐劑，優(yōu)選的防腐劑為硫柳汞，優(yōu)選的硫柳汞的含量為2μg/頭份。

本發(fā)明還提供了一種制備豬瘟-豬圓環(huán)二聯(lián)亞單位疫苗的方法，該方法包括以下步驟：1)制備豬瘟病毒e2蛋白和豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白；2)將1)中制備的豬瘟病毒e2蛋白和豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白制備成抗原液；其中，每頭份含豬瘟病毒e2蛋白7.5～140μg，每頭份含豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白25～200μg；3)將抗原液與montanidegel01pr佐劑按照質(zhì)量比10:1混合攪拌。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，優(yōu)選的制備疫苗的抗原液中還含有防腐劑。

本發(fā)明的動物免疫實施例中，發(fā)現(xiàn)無論是豬瘟e2蛋白還是豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白，表達(dá)全長蛋白制備的疫苗與表達(dá)截短的蛋白制備的疫苗在免疫原性方面相當(dāng)。

本發(fā)明的動物免疫實施例中，發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)無論是豬瘟e2蛋白還是豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白，二免前不同劑量的疫苗產(chǎn)生的抗體效價有差異，免疫高劑量的疫苗比免疫低劑量的疫苗產(chǎn)生的抗體效價要高，但是在二免后效價基本無差異。

本發(fā)明的動物免疫實施例中，發(fā)現(xiàn)免疫該豬瘟-豬圓環(huán)二聯(lián)亞單位疫苗與單獨免疫豬瘟亞單位疫苗或豬圓環(huán)亞單位疫苗相比，在免疫后存在一定的協(xié)同刺激作用，即在免疫后，聯(lián)苗的效價滴度較單獨免疫豬瘟亞單位疫苗或豬圓環(huán)亞單位疫苗效價滴度高，且基本上能夠達(dá)到甚至優(yōu)于單獨免疫豬瘟亞單位疫苗或豬圓環(huán)亞單位疫苗的保護(hù)效果。

本發(fā)明繼續(xù)跟蹤了實施例中制備的疫苗的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)實施例中制備的4批二聯(lián)疫苗與單獨的豬瘟e2亞單位疫苗和單獨的豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗都能在4℃存放一年以上，這能夠滿足疫苗在規(guī)?；a(chǎn)中的應(yīng)用，能克服背景介紹中提及的二聯(lián)亞單位疫苗可能存在的穩(wěn)定性較差的問題。

本發(fā)明提供了一種能同時預(yù)防豬瘟和豬圓環(huán)二聯(lián)亞單位疫苗，該疫苗具備免疫原性強(qiáng)、安全性好、不存在免疫干擾、不會導(dǎo)致病毒變異的生物安全隱患、能夠從根本上凈化豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型等優(yōu)點；通過該疫苗進(jìn)行免疫接種，可有效預(yù)防和保護(hù)豬免受豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型的感染，能夠達(dá)到“一針兩防”的效果，省時、省力、節(jié)約成本，能克服目前規(guī)?；i場存在的多針次、多劑量、多種疾病免疫程序難以合理安排的問題、也能避免分開包裝和使用時混合的麻煩；同時，本發(fā)明制備的豬瘟、豬圓環(huán)二聯(lián)亞單位疫苗至少能夠在4℃儲存一年以上，能夠滿足產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次明確提出了一種豬瘟-豬圓環(huán)二聯(lián)亞單位疫苗及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的疫苗具有免疫原性強(qiáng)、安全性好、不存在免疫干擾、不會導(dǎo)致病毒變易的生物安全隱患、能夠從根本上凈化豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型等優(yōu)點；且通過該疫苗進(jìn)行免疫接種，可有效預(yù)防和保護(hù)豬免受豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型的感染，能夠達(dá)到“一針兩防”的效果，省時、省力、節(jié)約成本，能克服目前規(guī)?；i場存在的多針次、多劑量、多種疾病免疫程序難以合理安排的問題、也能避免分開包裝和使用時混合的麻煩。

附圖說明

圖1a表示idexx豬瘟抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果。

圖1b表示韓國金諾豬圓環(huán)抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果。

具體實施方式

以下將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，本發(fā)明的實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案，并非限定本發(fā)明。

本發(fā)明試劑均是市售產(chǎn)品。

montanidegel01pr佐劑購自法國賽比克公司。

實施例1：豬瘟病毒e2蛋白和豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白的制備

1.1豬瘟病毒e2蛋白制備：參照申請?zhí)枮?00810178235.4或200310103408.3或200810150304.0或201310300549.8或200810178235.4或201610625392.x或201510187995.1的發(fā)明專利中豬瘟e2蛋白的制備方法或者其他專利或文獻(xiàn)中的制備方法制備豬瘟e2蛋白，可根據(jù)實際需要制備全長的豬瘟e2蛋白或截短的豬瘟e2蛋白。

1.2豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白制備：參照申請?zhí)枮?01310050003.1或201210270504.6或201110100331.9或201110053536.6或201010618223.6的發(fā)明專利中豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白的制備方法或其他專利或文獻(xiàn)中的制備方法制備豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白，可根據(jù)實際需要制備全長的豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白或截短的豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白。

實施例2：豬瘟-豬圓環(huán)二聯(lián)亞單位疫苗的制備(以制備1ml/頭份，共220g為例說明)

所用制備疫苗的耗材和材料都需預(yù)先經(jīng)過無菌處理，制備過程是在生物安全柜或其他可以保證整個制備過程都無菌的儀器或環(huán)境中完成。

1.montanidegel01pr(佐劑)準(zhǔn)備：根據(jù)抗原液和佐劑質(zhì)量比為10:1，稱取佐劑質(zhì)量為20g(約20ml)置于預(yù)先準(zhǔn)備好的試劑瓶中，封口，待用。

2.根據(jù)抗原液和佐劑質(zhì)量比為10:1，抗原液總質(zhì)量為200g(約200ml)。根據(jù)豬瘟病毒e2蛋白濃度和豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白濃度以及疫苗中各蛋白的含量，計算e2蛋白和cap蛋白取用的體積；用pbs緩沖液或其他緩沖液將抗原液總質(zhì)量補(bǔ)充至200g(約200ml)，混勻，待用。其中，豬瘟病毒e2(csfv-e2)蛋白和豬圓環(huán)病毒cap(pcv2-cap)蛋白的濃度均為0.5mg/ml，疫苗中豬瘟病毒e2蛋白和豬圓環(huán)病毒cap蛋白含量分別為30μg/頭份(1ml/頭份)和60μg/頭份(1ml/頭份)，。具體配置如下表1所示：

表1

3.攪拌：將準(zhǔn)備好的抗原液置于預(yù)先準(zhǔn)備好的燒杯(根據(jù)制備量選擇大小合適的燒杯，如制備220ml選擇500ml的燒杯即可)中，調(diào)整好攪拌機(jī)的高度和速度，再將準(zhǔn)備好的佐劑加大抗原液中，繼續(xù)攪拌20-30min。一般根據(jù)制備體積選擇攪拌速度和攪拌時間，如制備220ml疫苗，一般選擇500rpm/min攪拌20min即可。

4.分裝：穩(wěn)定好的疫苗根據(jù)需要分裝并寫上標(biāo)簽。

實施例3：豬瘟-豬圓環(huán)二聯(lián)亞單位疫苗免疫實驗

3.1疫苗制備：按照實施例1和2的方法制備蛋白和疫苗，具體疫苗信息見下表2所示：

表2

3.2免疫實驗：篩選28-35日齡仔豬35頭(csfv和pcv2抗原抗體陰性)，隨機(jī)分成7組，每組5頭，一組作為空白對照組，其他6組分別免疫疫苗1至疫苗6?？瞻讓φ战M每次肌肉注射1ml生理鹽水，另外6組免疫組每次肌肉注射1ml相應(yīng)的疫苗，初免三周后加強(qiáng)免疫一次，免疫前、二免前和二免后21天采集血清，檢測抗體效價。

實驗結(jié)果如圖1a所示，idexx豬瘟抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果顯示：免疫豬瘟-豬圓環(huán)二聯(lián)亞單位疫苗(疫苗2)的豬瘟抗體效價在二免前較單獨免疫豬瘟病毒e2蛋白亞單位疫苗(疫苗5)的豬瘟抗體阻斷率較高，約高5％-10％，但在二免后兩組免疫組阻斷率基本保持一致，平均阻斷率均高于80％；不同劑量的豬瘟e2蛋白制備的疫苗，在二免前阻斷率有差異，疫苗中豬瘟e2蛋白含量越高，阻斷率相對要高，但在二免后阻斷率基本一致，均高于80％。

實驗結(jié)果如圖1b所示，韓國金諾豬圓環(huán)抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果顯示：免疫豬瘟-豬圓環(huán)二聯(lián)亞單位疫苗(疫苗2)的豬圓環(huán)抗體效價在二免前較單獨免疫豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白亞單位疫苗(疫苗6)的豬圓環(huán)抗體效價較高，s/p值約高0.1-0.2，但在二免后兩組免疫組s/p值基本保持一致，平均s/p值均高于1.5；不同劑量的豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白制備的疫苗，在二免前s/p值有差異，疫苗中豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白含量越高，s/p值相對要高，但在二免后s/p值基本一致，平均s/p值均高于1.5。

圖1a和圖1b的結(jié)果顯示，疫苗1和疫苗2的豬瘟抗體效價和圓環(huán)抗體效價基本一致。因此無論是豬瘟e2蛋白還是豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白，表達(dá)全長蛋白制備的疫苗與表達(dá)截短的蛋白制備的疫苗在免疫原性方面相當(dāng)。

本發(fā)明通過上面的實施例進(jìn)行舉例說明，但是應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限于這里所描述的特殊實例和實施方案。在這里包含這些特殊實例和實施方案的目的在于幫助本領(lǐng)域中的技術(shù)人員實踐本發(fā)明。任何本領(lǐng)域中的技術(shù)人員很容易在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)和完善，因此本發(fā)明只受到本發(fā)明權(quán)利要求的內(nèi)容和范圍的限制，其意圖涵蓋所有包括在由附錄權(quán)利要求所限定的本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的備選方案和等同方法。