一種鑒定新生牛血清質(zhì)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鑒定方法，具體涉及一種鑒定新生牛血清質(zhì)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展離不開細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基的質(zhì)量是細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵。作為細(xì) 胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，牛血清含有豐富的細(xì)胞生長所必需的營養(yǎng)成分，它不僅 為細(xì)胞提供貼壁鋪展所需的因子，還起著緩沖酸堿度、保護(hù)細(xì)胞不受傷害、解毒等作用，因 此牛血清是醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品中重要的原材料之一。在抗原的生產(chǎn)過程中，常添加新生牛 血清進(jìn)行CH0細(xì)胞的生長及表達(dá)，若血清質(zhì)量不好，不僅影響細(xì)胞的生長和表達(dá)，而且會影 響后續(xù)純化收率及抗原原液質(zhì)量，所以對于新生牛血清的質(zhì)量控制尤為關(guān)鍵。
[0003] 新生牛血清是指從出生14小時內(nèi)未進(jìn)食的新生牛體上采血，分離血清，并經(jīng)除菌 過濾后制成的犢牛血清，也有人稱之為小牛血清?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《藥 典》)三部附錄中規(guī)定，新生牛血清的各項(xiàng)檢測指標(biāo)應(yīng)符合以下標(biāo)準(zhǔn):①總蛋白含量:3.5%_ 5.0 % ;②血紅蛋白：不高于0.02% ;③大腸桿菌噬菌體:不得有噬菌體污染;④滲透壓摩爾 濃度:250-400m0smol/kg;⑤無菌檢查：陰性;⑥支原體檢查：陰性;⑦細(xì)菌內(nèi)毒素：不高于 1 OEU/ml;⑧病毒檢查：陰性;⑨支持細(xì)胞增殖檢查-(Sp2/0-Agl4):生長曲線(接種濃度)最 大增殖濃度2 1.0 X 1〇6個/ml，細(xì)胞倍增時間< 20h，克隆率2 70%。
[0004] 但是，僅通過《藥典》三部附錄中的方法，不能夠?qū)π律Ｑ遒|(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格精確 的控制。例如當(dāng)一些不法商家將新生牛血清兌水稀釋;或使用價格較為低廉、采血牛齡相對 較長的牛血清充當(dāng)新生牛血清;抑或?qū)r格低廉、質(zhì)量較差的小牛血清摻入到新生牛血清 中時，檢測結(jié)果雖然合格，但實(shí)際應(yīng)用時不僅會影響細(xì)胞的增殖和表達(dá)，而且對下游純化的 原液質(zhì)量、介質(zhì)壽命等均有嚴(yán)重影響，甚至?xí)：Ξa(chǎn)品使用者的健康和安全。很明顯，藥典 中的檢測指標(biāo)無法準(zhǔn)確鑒定新生牛血清是否滿足實(shí)際使用的要求。
[0005] 鑒于前述問題，實(shí)際使用中對牛血清進(jìn)行鑒定時采用的傳統(tǒng)方法是，在藥典規(guī)定 的檢測項(xiàng)目合格的基礎(chǔ)上，再使用表達(dá)本產(chǎn)品的工作細(xì)胞做支持細(xì)胞增殖檢查，觀察細(xì)胞 的生長周期，繪制生長曲線、計(jì)算倍增時間以及統(tǒng)計(jì)維持期的表達(dá)水平等，以確保新生牛血 清質(zhì)量的準(zhǔn)確鑒定。但是這至少需要7天的時間，費(fèi)時費(fèi)力，操作繁瑣，且由于需要多次細(xì)胞 計(jì)數(shù)而易出現(xiàn)因人為因素導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確、重復(fù)性差等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是提供一種鑒定新生牛血清質(zhì)量的方法，以解決現(xiàn)有鑒定方法操 作繁瑣、耗時長且鑒定結(jié)果準(zhǔn)確度低、重復(fù)性差的問題。
[0007] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種鑒定新生牛血清質(zhì)量的方法，包括以下步驟:在 按照《中國藥典》三部附錄的方法對牛血清樣品進(jìn)行各指標(biāo)全檢的基礎(chǔ)上，進(jìn)行總蛋白含 量、白蛋白含量以及脂含量的檢測；總蛋白含量為4.0-4.5g/100ml;白蛋白含量定量掃描結(jié) 果為1.0~1.5;脂含量為5.5-6.5mg/ml的待鑒定樣品為質(zhì)量合格的新生牛血清。
[0008] 本發(fā)明方法中，按照《中國藥典》三部附錄，"蛋白質(zhì)測定法"中的"Lowry法"檢測待 鑒定樣品中的總蛋白含量。
[0009] 本發(fā)明方法中，按照《中國藥典》三部附錄，"電泳法"中的"SDS-聚丙烯酰胺凝膠電 泳法"對待鑒定樣品進(jìn)行非還原電泳檢測，將電泳結(jié)果進(jìn)行定量掃描分析，計(jì)算待鑒定樣品 中的白蛋白含量。
[0010]本發(fā)明方法中，采用香草醛顯色法測定待鑒定樣品的脂含量。
[0011 ]本發(fā)明方法中，白蛋白含量檢測的具體步驟為：
[0012] 凝膠的配制:分離膠凝膠濃度為15%，濃縮膠凝膠濃度為4.5% ;
[0013] 加樣:使用BIO-RAD MINI 2電泳槽和10孔樣品梳;待濃縮膠聚合后拔去樣品梳，加 入待鑒定樣品，每孔加樣20yL;
[0014] 電泳及染色:接通電源，開始電泳;待電泳結(jié)束后，使用考馬斯亮藍(lán)法過夜染色后， 取出脫色，直至凝膠底色幾乎無色，得電泳膠片；
[0015] 掃描及分析:使用BI0-RAD光密度掃描儀GS-800 Calibrated Densitometer對所 得電泳膠片進(jìn)行掃描后，使用分析軟件"Quantity One"中的條帶分析方法"Band Attributes-Trace Qty"進(jìn)行電泳條帶的定量分析，計(jì)算血清中的白蛋白含量。
[0016] 上述測定方法的測定結(jié)果與所用試劑、儀器和加樣量有關(guān)，使用其他不同試劑、儀 器或加樣量測定的結(jié)果經(jīng)等量換算之后亦可采用上述指標(biāo)范圍來判定樣品質(zhì)量的好壞。 [00 17]本發(fā)明方法中，脂含量檢測的具體步驟為：
[0018]首先，將待鑒定樣品用生理鹽水稀釋3倍，得到樣品待測液；
[0019]然后，以橄欖油為標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇配制成濃度為0.5mg/ml的脂含量測定標(biāo)準(zhǔn)溶液， 再用乙醇配制濃度分別為〇mg/ml、0 · lmg/ml、0 · 2mg/ml、0 · 3mg/ml、0 · 4mg/ml、0 · 5mg/ml的溶 液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0020] 接著，吸取樣品待測液和標(biāo)準(zhǔn)溶液各500μ1于玻璃試管中，各加入2ml硫酸并煮沸 lOmin，室溫放置30min使其完全冷卻后，再向每試管中加入4ml磷酸一香草醛試劑反應(yīng) 40min；
[0021] 最后，在530nm測定吸收值并乘以稀釋倍數(shù)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算待鑒定樣品的脂 含量。
[0022] 本發(fā)明方法中，還包括評定雜蛋白含量的步驟，通過雜蛋白含量來更進(jìn)一步確定 待鑒定樣品的質(zhì)量，具體步驟為：
[0023] 選擇對照品，選取胎牛血清作為質(zhì)量好的合格對照品，小牛血清作為質(zhì)量差的不 合格對照品；
[0024]雜蛋白檢測，按照《中國藥典》三部附錄，"電泳法"中的"SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 法"對胎牛血清和小牛血清分別進(jìn)行非還原電泳檢測，得到胎牛血清的電泳膠片和小牛血 清的電泳膠片；
[0025]結(jié)果評定，通過電泳膠片上雜蛋白條帶的深淺度來評定雜蛋白的含量，雜蛋白條 帶越深說明該樣品中雜蛋白含量越高。雜蛋白條帶深淺度的等級劃分方法為:將胎牛血清 電泳膠片上的雜蛋白條帶的深淺度定義為1級，小牛血清電泳膠片上的雜蛋白條帶的深淺 度定義為4級，將待鑒定清樣品電泳膠片上的雜蛋白條帶的深淺度在1，2,3,4級之間進(jìn)行評 定，深淺度在1級與4級之間且更接近1級的定義為2級，深淺度在1級與4級之間且更接近4級 的定義為3級。在總蛋白含量、脂含量和白蛋白含量均合格的前提下，雜蛋白條帶深淺度為1 級或2級的牛血清樣品為質(zhì)量好的新生牛血清。
[0026] 本發(fā)明方法可以精確的鑒別出哪些樣品是經(jīng)過稀釋的、哪些樣品是采血牛齡延長 或者摻入其它雜質(zhì)成分的。若血脂含量、白蛋白含量均較低，且雜蛋白條帶較淺，說明此樣 品較稀，可能為經(jīng)過稀釋后的新生牛血清;若總蛋白含量在正常范圍內(nèi)，但血脂含量、白蛋 白含量均較高，雜蛋白條帶很深，說明牛齡較長，血清中雜質(zhì)含量較高。
[0027] 本發(fā)明采用電泳檢查法、血脂含量檢查法結(jié)合原有的總蛋白檢查法，能夠快速有 效的篩選出符合后續(xù)使用要求的新生牛血清，解決了現(xiàn)有篩選方法費(fèi)時費(fèi)力的問題。
[0028] 通過本發(fā)明方法，可對血清中的主要雜質(zhì)成分(脂類、雜蛋白等)進(jìn)行嚴(yán)格控制，這 不僅為細(xì)胞的生長和表達(dá)提供了保障，而且雜質(zhì)引入量的減少對純化原液質(zhì)量的提高、純 化介質(zhì)壽命的延長均有幫助，從而保證了生物制品的質(zhì)量，使生物制品使用者的健康安全 得到了保障。
[0029] 本發(fā)明方法簡單，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確有效，重復(fù)性好，且所用設(shè)備均為常規(guī)實(shí)驗(yàn) 設(shè)備，便于推廣和應(yīng)用。
【附圖說明】
[0030] 圖1是實(shí)施例1中各樣品的電泳膠片結(jié)果，圖中，由左向右依次為新生牛血清、胎牛 血清、小牛血清的電泳膠片結(jié)果。
[0031 ]圖2是實(shí)施例2中1 #~10#樣品的電泳膠片結(jié)果。
[0032 ]圖3是實(shí)施例2中11 #~18#樣品的電泳膠片結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，在以下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過 程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，所用試劑為市售分析純或化學(xué)純。
[0034] 以下實(shí)施例中的牛血清樣品是按照《中國藥典》三部附錄中的方法對其全檢均合 格的樣品。
[0035] 實(shí)施例1
[0036] 樣品:A廠家的經(jīng)常年使用認(rèn)定為在細(xì)胞培養(yǎng)階段表現(xiàn)較好和質(zhì)量較好的新生牛 血清;胎牛血清;小牛血清。
[0037]所用試劑：
[0038] 總蛋白含量檢測所用試劑:似0!1、似(：1、似2〇)3、〇1304、酒石酸鉀鈉（國藥化學(xué)試劑 公司AR)，酚試劑(SIGMA AR)，標(biāo)準(zhǔn)品：血清白蛋白（牛）（中國食品藥品檢定研究院）；
[0039]電泳檢測所用試劑：30%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺37.5:1(翊圣生物），TEMED (GE)，SDS(SIGMA)，考馬斯亮藍(lán)染色液(SIGMA);
[0040] 脂含量檢測所用試劑：乙醇、硫酸、磷酸、香蘭素（國藥化學(xué)試劑公司AR)。
[0041] 所用儀器：
[0042] 紫外分光光度計(jì)：PerkinElmer Lambda25;電泳槽:BI〇-RAD MINI 2;光密度掃描 儀：BIO-RAD GS-800 Calibrated Densitometer。
[0043] 按照如下方