一種牛奶中抗生素殘留的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗生素殘留檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種牛奶中抗生素殘留的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]牛奶富含除了膳食纖維外的人體所需要的所有營養(yǎng)物質(zhì)，其營養(yǎng)之高是其他食物不可替代的。新鮮牛奶和奶制品己經(jīng)成為人們(尤其是老人和兒童)生活食品中的重要組成部分。近年來，隨著我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，奶產(chǎn)量大幅度提高，為了預(yù)防疾病的發(fā)生和治療乳房炎等疾病，養(yǎng)殖者會在牛飼料中及飲用水中添加含有一定比例抗生素的飼料添加劑，然而，這樣將不可避免地造成牛奶中抗生素的殘留。若長期飲用含有抗生素的牛奶，牛奶中的抗生素可通過食物鏈進(jìn)入人體，無疑是等于長期服用小劑量的抗生素。對抗生素過敏體質(zhì)的人服用殘留抗生素的牛奶后可引發(fā)過敏反應(yīng)。正常飲用者，會導(dǎo)致體內(nèi)的某些條件性致病菌易產(chǎn)生耐藥性，一旦患病再用同種抗生素治療很難奏效?？股貧埩舨粌H危害人類健康，同時也影響牛奶的品質(zhì)。世界糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織的食品法對牛奶中抗生素最高殘留量作了詳細(xì)的規(guī)定。我國農(nóng)業(yè)部2001年頒布實(shí)施了《無公害食品生鮮牛乳行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》。因此，建立一種簡單、快速、有效地檢測牛奶中多種抗生素殘留的方法是非常必要的。
[0003]由于磺胺類、喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氯霉素類共5大類33種獸藥的藥物，其化學(xué)分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)差異較大，同時對牛奶中多種抗生素殘留的同時檢測有一定困難，目前還沒有文獻(xiàn)報道。對于牛奶中抗生素殘留分析，固相萃取技術(shù)、固相微萃取技術(shù)以及基質(zhì)固相分散等前處理技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用到樣品前處理步驟中，以用來解決樣品分析測試中的基質(zhì)干擾問題。其中，固相萃取技術(shù)的應(yīng)用最為廣泛，但是應(yīng)用在牛奶中抗生素殘留檢測的前處理中，固相萃取技術(shù)卻普遍存在樣品處理過程復(fù)雜、有毒試劑接觸多、耗材消耗量大、需要額外氮吹、重現(xiàn)性差和無法實(shí)現(xiàn)全自動聯(lián)機(jī)等問題。特別是四環(huán)素類等藥物，由于其與蛋白質(zhì)或者礦物質(zhì)結(jié)合，形成結(jié)合態(tài)，因此更加加重了牛奶中殘留抗生素的檢測難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、檢測速度快的牛奶中抗生素殘留的檢測方法，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
一種牛奶中抗生素殘留的檢測方法，具體步驟如下:
(I)將枯草芽孢桿菌的菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，調(diào)節(jié)斜面培養(yǎng)基的PH值為6.5-7，于45-65 °C下進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)48-72h，所述斜面培養(yǎng)基按照重量份的原料包括:蛋白胨2-4份、牛肉膏粉2.5-3.5份、酵母膏5-6份、瓊脂10-20份、氯化鈉0.4-0.6份、葡萄糖1-2份、磷酸氫二鉀0.01-0.03份、蒸餾水100-120份； (2)用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)斜面培養(yǎng)基的pH值為7-8，進(jìn)行轉(zhuǎn)種繼代培養(yǎng)24-36h后收集，再用生理鹽水洗下菌苔，轉(zhuǎn)移至無菌容器中，充分振蕩后，過濾，制成懸浮液，于60-70°C下加熱懸浮液8-12min，靜置過夜后，以1500-1700r/min的速度離心15-25min，取上清液，再3800-4000r/min的速度離心5-10min，棄去上清液，如此反復(fù)離心洗滌3-5次后，用生理鹽水將離心沉淀懸浮成枯草芽孢桿菌菌泥，調(diào)整其0D600值至0.25-0.35，于0_4°C下貯存、備用；
(3)按瓊脂指示劑溶液與枯草芽孢桿菌菌泥的體積比為3-4:1加入瓊脂指示劑溶液，于60-70°C下混合均勻，得反應(yīng)液，將所述反應(yīng)液0.2-0.4mL分別裝入孔板的每一孔或微量反應(yīng)器中，每孔或微量反應(yīng)器中的枯草芽孢桿菌達(dá)到0.5-1.5 X 18Cfu，蓋上鋁塑膜并進(jìn)行熱合封口，于60-70°C倒置20-40min后，順置冷卻至常溫，并裝入鋁塑袋，防潮和避光保存，制成檢測試劑盒;所述瓊脂指示劑溶液按照重量份的原料包括:瓊脂1.5-3.5份、溴甲酚紫0.0008-0.0012份、氫氧化鈉0.02-0.04份、蛋白胨1.0_1.5份、牛肉膏粉2.5_3.5份、氯化鈉
0.4-0.6份、蒸餾水93-95份；
(4)在得到的所述試劑盒的每孔或微量反應(yīng)器中加入牛奶樣品0.05-0.25mL，用鋁塑膜仔細(xì)密封，于50-60°C的水浴或恒溫箱中恒溫反應(yīng)2.3-2.5h，陰性樣品的試劑盒每孔或微量反應(yīng)器中由藍(lán)色變成黃色，變色范圍pH為5.0-6.0，表示抗生素殘留呈陰性；陽性樣品不變色，表示抗生素殘留呈陽性。
[0006]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述斜面培養(yǎng)基按照重量份的原料包括:蛋白胨2.5-3.5份、牛肉膏粉2.8-3.2份、酵母膏5.2-5.8份、瓊脂12-18份、氯化鈉0.45-0.55份、葡萄糖1.2-1.8份、磷酸氫二鉀0.015-0.025份、蒸餾水105-115份。
[0007]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述斜面培養(yǎng)基按照重量份的原料包括:蛋白胨3份、牛肉膏粉3份、酵母膏5.5份、瓊脂15份、氯化鈉0.5份、葡萄糖1.5份、磷酸氫二鉀0.02份、蒸餾水110份。
[0008]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述瓊脂指示劑溶液按照重量份的原料包括:瓊脂2-3份、溴甲酚紫0.0009-0.0011份、氫氧化鈉0.025-0.035份、蛋白胨1.1-1.4份、牛肉膏粉2.8-3.2份、氯化鈉0.45-0.55份、蒸餾水93.5-94.5份。
[0009]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述瓊脂指示劑溶液按照重量份的原料包括:瓊脂2.5份、溴甲酚紫0.001份、氫氧化鈉0.03份、蛋白胨1.2份、牛肉膏粉3份、氯化鈉0.5份、蒸餾水94份。
[0010]作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案:所述步驟(2)中氫氧化鈉溶液的濃度為l-2mol/L。
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明中枯草芽孢桿菌的菌株穩(wěn)定，易保存和制備，能耐受加工過程中的熱，在粗放的保存條件下也不易失活，操作簡便、靈敏度高、成本低，快速檢測，高通量檢測，不需要昂貴的檢測設(shè)備，檢測限低。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本專利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0013]實(shí)施例1
一種牛奶中抗生素殘留的檢測方法，具體步驟如下:
(I)將枯草芽孢桿菌的菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，調(diào)節(jié)斜面培養(yǎng)基的PH值為6.5，于45°(:下進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)48h，所述斜面培養(yǎng)基按照重量份的原料包括:蛋白胨2份、牛肉膏粉2.5份、酵母膏5份、瓊脂10份、氯化鈉0.4份、葡萄糖I份、磷酸氫二鉀0.0l份、蒸餾水100份；
(2)采用濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)斜面培養(yǎng)基的pH值為7，進(jìn)行轉(zhuǎn)種繼代培養(yǎng)24h后收集，再用生理鹽水洗下菌苔，轉(zhuǎn)移至無菌容器中，充分振蕩后，過濾，制成懸浮液，于60 0C下加熱懸浮液8min，靜置過夜后，以1500r/min的速度離心15min，取上清液，再3800r/min的速度離心5min，棄去上清液，如此反復(fù)離心洗滌3次后，用生理鹽水將離心沉淀懸浮成枯草芽孢桿菌菌泥，調(diào)整其0D600值至0.25，于O 0C下貯存、備用；
(3)按瓊脂指示劑溶液與枯草芽孢桿菌菌泥的體積比為3:1加入瓊脂指示劑溶液，于60°C下混合均勻，得反應(yīng)液，將所述反應(yīng)液0.2mL分別裝入孔板的每一孔或微量反應(yīng)器中，每孔或微量反應(yīng)器中的枯草芽孢桿菌達(dá)到0.5 X 18Cfu，蓋上鋁塑膜并進(jìn)行熱合封口，于60°C倒置20min后，順置冷卻至常溫，并裝入鋁塑袋，防潮和避光保存，制成檢測試劑盒;所述瓊脂指示劑溶液按照重量份的原料包括:瓊脂1.5份、溴甲酚紫0.0008份、氫氧化鈉0.02份、蛋白胨1.0份、牛肉膏粉2.5份、氯化鈉0.4份、蒸餾水93份；
(4)在得到的所述試劑盒的每孔或微量反應(yīng)器中加入牛奶樣品0.05mL，用鋁塑膜仔細(xì)密封，于50°C的水浴或恒溫箱中恒溫反應(yīng)2.3h，陰性樣品的試劑盒每孔或微量反應(yīng)器中由藍(lán)色變成黃色，變色范圍PH為5.0，表示抗生素殘留呈陰性；陽性樣品不變色，表示抗生素殘留呈陽性。
[0014]實(shí)施例2
一種牛奶中抗生素殘留的檢測方法，具體步驟如下:
(1)將枯草芽孢桿菌的菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，調(diào)節(jié)斜面培養(yǎng)基的PH值為6.6，于50°(:下進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)56h，所述斜面培養(yǎng)基按照重量份的原料包括:蛋白胨2.8份、牛肉膏粉2.9份、酵母膏5.3份、瓊脂13份、氯化鈉0.48份、葡萄糖1.3份、磷酸氫二鉀0.018份、蒸餾水108 份；
(2)采用濃度為1.2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)斜面培養(yǎng)基的pH值為7.2，進(jìn)行轉(zhuǎn)種繼代培養(yǎng)28h后收集，再用生理鹽水洗下菌苔，轉(zhuǎn)移至無菌容器中，充分振蕩后，過濾，制成懸浮液，于62°C下加熱懸浮液9min，靜置過夜后，以1550r/min的速度離心18min，取上清液，再3850r/min的速度離心6min，棄去上清液，如此反復(fù)離心洗滌4次后，用生理鹽水將離心沉淀懸浮成枯草芽孢桿菌菌泥，調(diào)整其0D600值至0.28，于1°C下貯存、備用；
(3)按瓊脂指示劑溶液與枯草芽孢桿菌菌泥的體積比為3.2:1加入瓊脂指示劑溶液，于62°C下混合均勻，得反應(yīng)液，將所述反應(yīng)液0.25mL分別裝入孔板的每一孔或微量反應(yīng)器中，每孔或微量反應(yīng)器中的枯草芽孢桿菌達(dá)到0.8 X 18Cfu，蓋上鋁塑膜并進(jìn)行熱合封口，于620C倒置25min后，順置冷卻至常溫，并裝入鋁塑袋，防潮和避光保存，制成檢測試劑盒;所述瓊脂指示劑溶液按照重量份的原料包括:瓊脂2.2份、溴甲酚紫0.00095份、氫氧化鈉0.028份、蛋白胨1.15份、牛肉膏粉2.9份、氯化鈉0.48份、蒸餾水93.8份；
(4)在得到的所述試劑盒的每孔或微量反應(yīng)器中加入牛奶樣品0.lmL，用鋁塑膜仔細(xì)密封，于52 °C的水浴或恒溫箱中恒溫反應(yīng)2.35h，陰性樣品的試劑盒每孔或微量反應(yīng)器中由藍(lán)色變成黃色，變色范圍PH為5.2，表示抗生素殘留呈陰性；陽性樣品不變色，表示抗生素殘留呈陽性。
[0015]實(shí)施例3 一種牛奶中抗生素殘留的檢測方法，具體步驟如下:
(1)將枯草芽孢桿菌的菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，調(diào)節(jié)斜面培養(yǎng)基的PH值為6.8，于55°(:下進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)51h，所述斜面培養(yǎng)基按照重量份的原料包括:蛋白胨3份、牛肉膏粉3份、酵母膏5.5份、瓊脂15份、氯化鈉0.5份、葡萄糖1.5份、磷酸氫二鉀0