.02份、蒸餾水110份；
(2)采用濃度為1.5mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)斜面培養(yǎng)基的pH值為7.5，進行轉(zhuǎn)種繼代培養(yǎng)31h后收集，再用生理鹽水洗下菌苔，轉(zhuǎn)移至無菌容器中，充分振蕩后，過濾，制成懸浮液，于65°C下加熱懸浮液lOmin，靜置過夜后，以1600r/min的速度離心20min，取上清液，再3900r/min的速度離心8min，棄去上清液，如此反復(fù)離心洗滌5次后，用生理鹽水將離心沉淀懸浮成枯草芽孢桿菌菌泥，調(diào)整其0D600值至0.3，于2 °C下貯存、備用；
(3)按瓊脂指示劑溶液與枯草芽孢桿菌菌泥的體積比為3.5:1加入瓊脂指示劑溶液，于65°C下混合均勻，得反應(yīng)液，將所述反應(yīng)液0.3mL分別裝入孔板的每一孔或微量反應(yīng)器中，每孔或微量反應(yīng)器中的枯草芽孢桿菌達到I X 108cfu，蓋上鋁塑膜并進行熱合封口，于65°C倒置30min后，順置冷卻至常溫，并裝入鋁塑袋，防潮和避光保存，制成檢測試劑盒;所述瓊脂指示劑溶液按照重量份的原料包括:瓊脂2.5份、溴甲酚紫0.001份、氫氧化鈉0.03份、蛋白胨1.2份、牛肉膏粉3份、氯化鈉0.5份、蒸餾水94份；
(4)在得到的所述試劑盒的每孔或微量反應(yīng)器中加入牛奶樣品0.15mL，用鋁塑膜仔細密封，于55°C的水浴或恒溫箱中恒溫反應(yīng)2.4h，陰性樣品的試劑盒每孔或微量反應(yīng)器中由藍色變成黃色，變色范圍PH為5.5，表示抗生素殘留呈陰性；陽性樣品不變色，表示抗生素殘留呈陽性。
[0016]實施例4
一種牛奶中抗生素殘留的檢測方法，具體步驟如下:
(1)將枯草芽孢桿菌的菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，調(diào)節(jié)斜面培養(yǎng)基的PH值為6.9，于60°(:下進行優(yōu)化培養(yǎng)56h，所述斜面培養(yǎng)基按照重量份的原料包括:蛋白胨3.5份、牛肉膏粉3.2份、酵母膏5.8份、瓊脂18份、氯化鈉0.55份、葡萄糖1.8份、磷酸氫二鉀0.025份、蒸餾水115 份；
(2)采用濃度為1.8mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)斜面培養(yǎng)基的pH值為7.8，進行轉(zhuǎn)種繼代培養(yǎng)34h后收集，再用生理鹽水洗下菌苔，轉(zhuǎn)移至無菌容器中，充分振蕩后，過濾，制成懸浮液，于68°C下加熱懸浮液11111；[11，靜置過夜后，以16501'/111；[11的速度離心22111；[11，取上清液，再3950r/min的速度離心9min，棄去上清液，如此反復(fù)離心洗滌3次后，用生理鹽水將離心沉淀懸浮成枯草芽孢桿菌菌泥，調(diào)整其0D600值至0.32，于3 °C下貯存、備用；
(3)按瓊脂指示劑溶液與枯草芽孢桿菌菌泥的體積比為3.8: I加入瓊脂指示劑溶液，于68°C下混合均勻，得反應(yīng)液，將所述反應(yīng)液0.35mL分別裝入孔板的每一孔或微量反應(yīng)器中，每孔或微量反應(yīng)器中的枯草芽孢桿菌達到1.2 X 18Cfu，蓋上鋁塑膜并進行熱合封口，于680C倒置35min后，順置冷卻至常溫，并裝入鋁塑袋，防潮和避光保存，制成檢測試劑盒;所述瓊脂指示劑溶液按照重量份的原料包括:瓊脂3份、溴甲酚紫0.0011份、氫氧化鈉0.035份、蛋白胨1.4份、牛肉膏粉3.2份、氯化鈉0.55份、蒸餾水94.5份；
(4)在得到的所述試劑盒的每孔或微量反應(yīng)器中加入牛奶樣品0.2mL，用鋁塑膜仔細密封，于58 °C的水浴或恒溫箱中恒溫反應(yīng)2.45h，陰性樣品的試劑盒每孔或微量反應(yīng)器中由藍色變成黃色，變色范圍PH為5.8，表示抗生素殘留呈陰性；陽性樣品不變色，表示抗生素殘留呈陽性。
[0017]實施例5
一種牛奶中抗生素殘留的檢測方法，具體步驟如下:
(1)將枯草芽孢桿菌的菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，調(diào)節(jié)斜面培養(yǎng)基的PH值為7，于65°C下進行優(yōu)化培養(yǎng)72h，所述斜面培養(yǎng)基按照重量份的原料包括:蛋白胨4份、牛肉膏粉3.5份、酵母膏6份、瓊脂20份、氯化鈉0.6份、葡萄糖2份、磷酸氫二鉀0.03份、蒸餾水120份；
(2)采用濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)斜面培養(yǎng)基的pH值為8，進行轉(zhuǎn)種繼代培養(yǎng)36h后收集，再用生理鹽水洗下菌苔，轉(zhuǎn)移至無菌容器中，充分振蕩后，過濾，制成懸浮液，于700C下加熱懸浮液12min，靜置過夜后，以1700r/min的速度離心25min，取上清液，再4000r/min的速度離心1min，棄去上清液，如此反復(fù)離心洗滌5次后，用生理鹽水將離心沉淀懸浮成枯草芽孢桿菌菌泥，調(diào)整其0D600值至0.35，于4°C下貯存、備用；
(3)按瓊脂指示劑溶液與枯草芽孢桿菌菌泥的體積比為4:1加入瓊脂指示劑溶液，于70°C下混合均勻，得反應(yīng)液，將所述反應(yīng)液0.4mL分別裝入孔板的每一孔或微量反應(yīng)器中，每孔或微量反應(yīng)器中的枯草芽孢桿菌達到1.5 X 18Cfu，蓋上鋁塑膜并進行熱合封口，于70°C倒置40min后，順置冷卻至常溫，并裝入鋁塑袋，防潮和避光保存，制成檢測試劑盒;所述瓊脂指示劑溶液按照重量份的原料包括:瓊脂3.5份、溴甲酚紫0.0012份、氫氧化鈉0.04份、蛋白胨1.5份、牛肉膏粉3.5份、氯化鈉0.6份、蒸餾水95份；
(4)在得到的所述試劑盒的每孔或微量反應(yīng)器中加入牛奶樣品0.25mL，用鋁塑膜仔細密封，于60°C的水浴或恒溫箱中恒溫反應(yīng)2.5h，陰性樣品的試劑盒每孔或微量反應(yīng)器中由藍色變成黃色，變色范圍PH為6.0，表示抗生素殘留呈陰性；陽性樣品不變色，表示抗生素殘留呈陽性。
[0018]本發(fā)明中枯草芽孢桿菌的菌株穩(wěn)定，易保存和制備，能耐受加工過程中的熱，在粗放的保存條件下也不易失活，操作簡便、靈敏度高、成本低，快速檢測，高通量檢測，不需要昂貴的檢測設(shè)備，檢測限低。
[0019]上面對本專利的較佳實施方式作了詳細說明，但是本專利并不限于上述實施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下作出各種變化。
【主權(quán)項】
1.一種牛奶中抗生素殘留的檢測方法，其特征在于，具體步驟如下: (1)將枯草芽孢桿菌的菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，調(diào)節(jié)斜面培養(yǎng)基的PH值為6.5-7，于45-65 °C下進行優(yōu)化培養(yǎng)48-72h，所述斜面培養(yǎng)基按照重量份的原料包括:蛋白胨2-4份、牛肉膏粉2.5-3.5份、酵母膏5-6份、瓊脂10-20份、氯化鈉0.4-0.6份、葡萄糖1-2份、磷酸氫二鉀0.01-0.03份、蒸餾水100-120份； (2)用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)斜面培養(yǎng)基的pH值為7-8，進行轉(zhuǎn)種繼代培養(yǎng)24-36h后收集，再用生理鹽水洗下菌苔，轉(zhuǎn)移至無菌容器中，充分振蕩后，過濾，制成懸浮液，于60-70°C下加熱懸浮液8-12min，靜置過夜后，以1500-1700r/min的速度離心15-25min，取上清液，再3800-4000r/min的速度離心5-10min，棄去上清液，如此反復(fù)離心洗滌3-5次后，用生理鹽水將離心沉淀懸浮成枯草芽孢桿菌菌泥，調(diào)整其0D600值至0.25-0.35，于0_4°C下貯存、備用； (3)按瓊脂指示劑溶液與枯草芽孢桿菌菌泥的體積比為3-4:1加入瓊脂指示劑溶液，于60-70°C下混合均勻，得反應(yīng)液，將所述反應(yīng)液0.2-0.4mL分別裝入孔板的每一孔或微量反應(yīng)器中，每孔或微量反應(yīng)器中的枯草芽孢桿菌達到0.5-1.5 X 18Cfu，蓋上鋁塑膜并進行熱合封口，于60-70°C倒置20-40min后，順置冷卻至常溫，并裝入鋁塑袋，防潮和避光保存，制成檢測試劑盒;所述瓊脂指示劑溶液按照重量份的原料包括:瓊脂1.5-3.5份、溴甲酚紫0.0008-0.0012份、氫氧化鈉0.02-0.04份、蛋白胨1.0_1.5份、牛肉膏粉2.5_3.5份、氯化鈉0.4-0.6份、蒸餾水93-95份； (4)在得到的所述試劑盒的每孔或微量反應(yīng)器中加入牛奶樣品0.05-0.25mL，用鋁塑膜仔細密封，于50-60°C的水浴或恒溫箱中恒溫反應(yīng)2.3-2.5h，陰性樣品的試劑盒每孔或微量反應(yīng)器中由藍色變成黃色，變色范圍pH為5.0-6.0，表示抗生素殘留呈陰性；陽性樣品不變色，表示抗生素殘留呈陽性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中抗生素殘留的檢測方法，其特征在于，所述斜面培養(yǎng)基按照重量份的原料包括:蛋白胨2.5-3.5份、牛肉膏粉2.8-3.2份、酵母膏5.2-5.8份、瓊脂12-18份、氯化鈉0.45-0.55份、葡萄糖1.2-1.8份、磷酸氫二鉀0.015-0.025份、蒸餾水105-115 份。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中抗生素殘留的檢測方法，其特征在于，所述斜面培養(yǎng)基按照重量份的原料包括:蛋白胨3份、牛肉膏粉3份、酵母膏5.5份、瓊脂15份、氯化鈉0.5份、葡萄糖1.5份、磷酸氫二鉀0.02份、蒸餾水110份。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中抗生素殘留的檢測方法，其特征在于，所述瓊脂指示劑溶液按照重量份的原料包括:瓊脂2-3份、溴甲酚紫0.0009-0.0011份、氫氧化鈉0.025-0.035份、蛋白胨1.1-1.4份、牛肉膏粉2.8-3.2份、氯化鈉0.45-0.55份、蒸餾水93.5-94.5份。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中抗生素殘留的檢測方法，其特征在于，述瓊脂指示劑溶液按照重量份的原料包括:瓊脂2.5份、溴甲酚紫0.001份、氫氧化鈉0.03份、蛋白胨1.2份、牛肉膏粉3份、氯化鈉0.5份、蒸餾水94份。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中抗生素殘留的檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中氫氧化鈉溶液的濃度為1-2mo I/L。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛奶中抗生素殘留的檢測方法，具體步驟如下：將枯草芽孢桿菌的菌株接種于斜面培養(yǎng)基上進行優(yōu)化培養(yǎng)；進行轉(zhuǎn)種繼代培養(yǎng)后收集，再用生理鹽水洗下菌苔，轉(zhuǎn)移至無菌容器中，充分振蕩后，過濾，制成懸浮液后制成菌泥；加入瓊脂指示劑溶液，將所述反應(yīng)液裝入孔板的每一孔或微量反應(yīng)器中；在得到的所述試劑盒的每孔或微量反應(yīng)器中加入牛奶樣品，用鋁塑膜仔細密封，水浴或恒溫箱中恒溫反應(yīng)后檢查是否變色。本發(fā)明中枯草芽孢桿菌的菌株穩(wěn)定，易保存和制備，能耐受加工過程中的熱，在粗放的保存條件下也不易失活，操作簡便、靈敏度高、成本低，快速檢測，高通量檢測，不需要昂貴的檢測設(shè)備，檢測限低。
【IPC分類】G01N21/78
【公開號】CN105675604
【申請?zhí)枴緾N201610194687
【發(fā)明人】梁蔚蔚, 張寶同
【申請人】山東五洲檢測有限公司
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年3月31日