針對(duì)溶酶體酶的底物清除測(cè)定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明尤其提供針對(duì)溶酶體酶的改進(jìn)底物清除測(cè)定，其特別適用于測(cè)量溶酶體酶或其它治療劑用于治療溶酶體貯積疾病的效價(jià)。特定來說，本發(fā)明組合生理相關(guān)底物細(xì)胞測(cè)定和高效的基于閃爍的檢測(cè)方法。
【專利說明】針對(duì)溶酶體酶的底物清除測(cè)定
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)根據(jù)35USC§119(e)要求2014年2月18日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào) 61/941,365的權(quán)益，所述美國臨時(shí)專利申請(qǐng)據(jù)此以引用的方式整體并入本文。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 溶酶體貯積病癥(LSD)是與溶酶體功能障礙相關(guān)的罕見代謝病癥，其通常由缺乏 為代謝溶酶體酶的底物所需的溶酶體酶所致，所述底物諸如脂質(zhì)或糖蛋白（也稱為粘多 糖）。在它們之中，粘多糖貯積癥(MPS)是歸因于遺傳缺乏一種負(fù)責(zé)降解糖胺聚糖(GAG)的溶 酶體酶的一個(gè)家族的LSDXAG是直鏈以及可變硫酸化寡糖鏈，其是細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵組分， 并且也涉及于廣泛范圍的過程中的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中。GAG在溶酶體中病原性積累最終導(dǎo)致 細(xì)胞功能損害和廣泛范圍的癥狀。
[0005] 酶替代療法(ERT)是一種用于治療LSD的重要手段。通常，ERT涉及向其中缺乏溶酶 體酶的受試者全身性施用天然或重組獲得的溶酶體酶。成功的ERT需要可高效清除病原性 底物積累并且恢復(fù)受損細(xì)胞功能的有效力的溶酶體酶。 發(fā)明概要
[0006] 本發(fā)明提供一種尤其用以評(píng)估溶酶體酶用于酶替代療法以及任何其它類型的治 療劑(例如生物制劑(例如蛋白質(zhì)、酶、抗體）、小分子、核酸）用于治療溶酶體貯積疾病的效 價(jià)的準(zhǔn)確、可靠、簡單和高度高效的底物清除測(cè)定平臺(tái)。本發(fā)明部分地基于非常規(guī)組合用于 溶酶體酶和閃爍技術(shù)的生理性底物細(xì)胞測(cè)定。舉例來說，本發(fā)明已證明細(xì)胞，特別是缺乏相 關(guān)內(nèi)源性溶酶體酶的那些，可通過例如在待并入底物中的放射性同位素(例如 35S)存在下使 細(xì)胞生長處于所需細(xì)胞密度(例如約80-98%匯合)下來合成放射性標(biāo)記的生理性底物(例 如GAG)。所述細(xì)胞可成功附著于閃爍基體。細(xì)胞內(nèi)部的放射性標(biāo)記的底物足夠靠近閃爍基 體以發(fā)射導(dǎo)致閃爍事件的電子?？山又砑幽繕?biāo)溶酶體酶至細(xì)胞中。如果酶是有效力的 (即，被適當(dāng)內(nèi)化，遞送至溶酶體中，并且具有酶活性），那么細(xì)胞能夠代謝積累的底物，從而 導(dǎo)致從細(xì)胞降解和釋放放射性標(biāo)記，其可被洗除。因此，與細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)（即閃爍事件)降 低指示溶酶體酶具有效價(jià)。如包括實(shí)施例章節(jié)的本文所述，這個(gè)方法在測(cè)量和定量目標(biāo)溶 酶體酶的效價(jià)(例如相對(duì)效價(jià))方面是驚人準(zhǔn)確的、可重現(xiàn)的以及高效的。舉例來說，生物測(cè) 定的線性是用以衡量測(cè)定獲得在給定范圍內(nèi)正比于生物效價(jià)的準(zhǔn)確測(cè)試結(jié)果的能力的重 要參數(shù)。如實(shí)施例中所示，這個(gè)平臺(tái)測(cè)定已顯示在高準(zhǔn)確度下出乎意料寬泛的線性范圍（例 如至少40-250%)。
[0007] 在本發(fā)明之前，作為暴露于丟失酶的效應(yīng)的積累GAG清除通常需要細(xì)胞的胰蛋白 酶消化，若干離心和洗滌步驟，溶解收集的細(xì)胞以及將溶解產(chǎn)物再混懸于個(gè)別管的閃爍流 體中。因此，1個(gè)樣品通常需要16小時(shí)的實(shí)際操作時(shí)間。相比來說，本發(fā)明巧妙使用閃爍技術(shù) 來使過程簡化。舉例來說，本發(fā)明不涉及胰蛋白酶消化、溶解、離心或再混懸步驟。因?yàn)樯L 培養(yǎng)基中的游離放射性標(biāo)記的衰變對(duì)于閃爍基體產(chǎn)生信號(hào)來說太遠(yuǎn)，所以本發(fā)明的清除測(cè) 定通常也不涉及大量洗滌步驟。此外，本發(fā)明的測(cè)定平臺(tái)可使用多孔閃爍板，例如通常在β 計(jì)數(shù)器上僅需要每板16分鐘讀取時(shí)間的那些96孔閃爍板。因此，這個(gè)測(cè)定平臺(tái)提供顯著增 加的通量以及顯著降低數(shù)量的操作步驟和實(shí)際操作時(shí)間。因此，本發(fā)明提供一種用于在制 造期間的樣品表征和方法開發(fā)的簡單和可靠的品質(zhì)控制工具。它也提供一種可用于使溶酶 體酶或其它治療劑的效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)化以達(dá)成產(chǎn)品核準(zhǔn)、加標(biāo)和/或包裝的分析工具。本文所述的 測(cè)定平臺(tái)也可用于出于診斷和療法監(jiān)測(cè)目的來評(píng)估直接從患者獲得的生物樣品中的酶效 價(jià)。
[0008] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種底物清除測(cè)定，其包括以下步驟:使包含目標(biāo)溶酶體 酶的樣品與含有所述溶酶體酶的用放射性同位素標(biāo)記的底物的細(xì)胞接觸，所述放射性同位 素可由所述溶酶體酶在允許所述溶酶體酶從所述底物裂解、降解或移除所述放射性同位素 的條件下裂解(或降解），其中使所述細(xì)胞附著于閃爍基體以便閃爍事件指示與所述細(xì)胞相 關(guān)的放射性發(fā)射水平；以及通過檢測(cè)閃爍事件來測(cè)量與所述細(xì)胞相關(guān)的放射性發(fā)射水平， 其中相較于在接觸步驟之前的基線放射性發(fā)射水平，放射性發(fā)射水平降低指示所述底物由 所述目標(biāo)溶酶體酶清除。
[0009] 在另一方面，本發(fā)明提供一種測(cè)量溶酶體酶的效價(jià)的方法，其包括以下步驟:使包 含目標(biāo)溶酶體酶的樣品與含有所述溶酶體酶的用放射性同位素標(biāo)記的底物的細(xì)胞接觸，所 述放射性同位素可由所述溶酶體酶在允許所述溶酶體酶從所述底物裂解、降解或移除所述 放射性同位素的條件下裂解(或降解），其中使所述細(xì)胞附著于閃爍基體以便閃爍事件指示 與所述細(xì)胞相關(guān)的放射性發(fā)射水平;相較于在接觸步驟之前的基線閃爍事件，通過檢測(cè)閃 爍事件來測(cè)量與所述細(xì)胞相關(guān)的放射性發(fā)射水平的變化；以及相較于對(duì)照，基于與所述細(xì) 胞相關(guān)的放射性發(fā)射水平的所述變化來確定所述溶酶體酶的所述效價(jià)。
[0010] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞缺乏目標(biāo)內(nèi)源性溶酶體酶。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是由 罹患與缺乏目標(biāo)溶酶體酶相關(guān)的溶酶體貯積疾病的患者獲得的纖維母細(xì)胞。在一些實(shí)施方 案中，溶酶體酶的用放射性同位素標(biāo)記的底物是由細(xì)胞在放射性同位素存在下合成。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，測(cè)量溶酶體酶的效價(jià)的方法進(jìn)一步包括以下步驟:使細(xì)胞生 長至所需匯合度;用放射性同位素處理細(xì)胞以使放射性同位素并入溶酶體酶的新合成底物 中；以及將細(xì)胞接種至具有閃爍基體的孔中以使細(xì)胞附著于閃爍基體。在一些實(shí)施方案中， 底物是糖胺聚糖(GAG)。在一些實(shí)施方案中，放射性同位素是 35S。在一些實(shí)施方案中，通過 用35S_硫酸鈉處理細(xì)胞來標(biāo)記底物。在一些實(shí)施方案中，允許溶酶體酶從底物裂解放射性同 位素的條件包括在37°C下在含5%C0 2的氛圍下孵育細(xì)胞和包含溶酶體酶的樣品。在一些實(shí) 施方案中，測(cè)量溶酶體酶的效價(jià)的方法進(jìn)一步包括在測(cè)量步驟之前洗滌細(xì)胞的步驟。在一 些實(shí)施方案中，通過β計(jì)數(shù)器來檢測(cè)閃爍事件。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，對(duì)照是指示目標(biāo)溶酶體酶的預(yù)定效價(jià)和/或劑量-響應(yīng)曲線的 參照標(biāo)準(zhǔn)。在一些實(shí)施方案中，確定溶酶體酶的效價(jià)的步驟包括使用限定模型計(jì)算相對(duì)效 價(jià)。在一些實(shí)施方案中，確定溶酶體酶的效價(jià)的步驟是定量的。在一些實(shí)施方案中，測(cè)量溶 酶體酶的效價(jià)的方法進(jìn)一步包括確定樣品中目標(biāo)溶酶體酶的總量的步驟。在一些實(shí)施方案 中，該方法進(jìn)一步包括確定目標(biāo)溶酶體酶的比活性。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，測(cè)量溶酶體酶的效價(jià)的方法不涉及細(xì)胞的胰蛋白酶消化。在 一些實(shí)施方案中，該方法不涉及溶解細(xì)胞。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，測(cè)量溶酶體酶的效價(jià)的方法包括在甘露糖-6-磷酸(Μ6Ρ)存在 下進(jìn)行的接觸步驟，并且方法進(jìn)一步包括將清除或效價(jià)與在無 M6P下測(cè)量的對(duì)照進(jìn)行比較 以確定細(xì)胞攝取是否具有M6P依賴性的步驟。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，測(cè)量溶酶體酶的效價(jià)的方法是以高通量形式執(zhí)行，其中多個(gè) 樣品被同時(shí)測(cè)量。在一些實(shí)施方案中，該方法包括使用多孔板，并且各個(gè)別孔的基體是閃爍 基體。在一些實(shí)施方案中，多孔板是6、12、24、48或96孔板。在一些實(shí)施方案中，溶酶體酶是 硫酸酯酶。在一些實(shí)施方案中，硫酸酯酶選自由以下組成的組:艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-艾杜糖醛酸酶、乙酰肝素 Ν-硫酸酯酶、乙酰基-CoA Ν-乙?；D(zhuǎn)移酶、α-Ν-乙酰基葡萄糖胺 糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、Ν-乙?；咸烟前?6-硫酸酯酶及其組合。在一些實(shí)施方案中，硫 酸酯酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。在一些實(shí)施方案中，硫酸酯酶是肝素 Ν-硫酸酯酶。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，測(cè)量溶酶體酶的效價(jià)的方法包括是含有重組產(chǎn)生的目標(biāo)溶酶 體酶的細(xì)胞培養(yǎng)物樣品的樣品。在一些實(shí)施方案中，樣品是由純化方法獲得的含有純化或 部分純化的目標(biāo)溶酶體酶的洗脫物或匯合洗脫物。在一些實(shí)施方案中，樣品是含有目標(biāo)溶 酶體酶的配制藥物產(chǎn)品。在一些實(shí)施方案中，樣品是從患者獲得的組織樣品。在一些實(shí)施方 案中，組織樣品是血液樣品、CSF樣品、尿樣品和/或來自實(shí)體器官的活檢體樣品。
[0017] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于制造目標(biāo)溶酶體酶的方法，其包括根據(jù)本文所 述的方法確定溶酶體酶的效價(jià)的步驟。在一些實(shí)施方案中，確定溶酶體酶的效價(jià)的步驟是 在簽發(fā)批次之前進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括基于確定的溶酶體酶的效價(jià) 來調(diào)整制造條件的步驟。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，用于純化目標(biāo)溶酶體酶的方法包括根據(jù)測(cè)量溶酶體酶的效價(jià) 的方法來確定溶酶體酶的效價(jià)的步驟。在一些實(shí)施方案中，確定溶酶體酶的效價(jià)的步驟是 在簽發(fā)純化批次之前進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括基于確定的溶酶體酶的 效價(jià)來調(diào)整純化條件的步驟。
[0019] 如本文所用，術(shù)語"約"和"大約"作為等效詞加以使用。與或不與約/大約一起用于 本申請(qǐng)中的任何數(shù)字都意圖涵蓋由相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的任何正常波動(dòng)。
[0020] 本發(fā)明的其它特征、目標(biāo)和優(yōu)勢(shì)在隨后詳細(xì)描述中是顯而易知的。然而，應(yīng)了解盡 管指示本發(fā)明的實(shí)施方案，但詳細(xì)描述僅通過說明而非限制方式給出。在本發(fā)明的范圍內(nèi) 的各種變化和修改將根據(jù)詳細(xì)描述而變得為本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易知。
[0021] 附圖簡述
[0022]附圖僅出于說明目的而非出于限制目的。
[0023]圖1說明硫酸乙酰肝素的逐步降解以及為各步驟所需的酶(根據(jù)Essentials of Glycobiology 改編）。
[0024] 圖2顯示用于以在第B至G行之間分布的一個(gè)對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)和三個(gè)樣品進(jìn)行的底物清 除測(cè)定的96孔板設(shè)置的示意圖，其中各行用從第1至12列連續(xù)稀釋的酶濃度處理。
[0025] 圖3描繪對(duì)GAG底物清除測(cè)定的數(shù)據(jù)分析的示例圖，其中使用4參數(shù)邏輯曲線擬合 估計(jì)效價(jià)。
[0026]圖4描繪對(duì)使用酶乙酰肝素 N-硫酸酯酶（圖4A)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（圖4B)和 N-乙?；咸烟前诽擒彰?圖4C)進(jìn)行的GAG底物清除測(cè)定的數(shù)據(jù)分析的示例圖。
[0027]圖5描繪顯示歷經(jīng)寬泛線性范圍的相對(duì)效價(jià)準(zhǔn)確度的示例圖。
[0028]圖6描繪顯示用酶乙酰肝素 -N-硫酸酯酶（圖6A)和艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（圖6B) 進(jìn)行GAG清除的歷經(jīng)寬泛線性范圍的相對(duì)效價(jià)準(zhǔn)確度的示例圖。
[0029] 圖7描繪顯示甘露糖-6-磷酸介導(dǎo)的內(nèi)化的示例圖，其中從硫酸酯酶移除磷酸使它 在GAG清除測(cè)定中的活性降低。
[0030] 圖8描繪顯示在5mM甘露糖-6-磷酸存在下對(duì)艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)依賴性 GAG清除的完全抑制的示例圖。甘露糖-6-磷酸結(jié)合甘露糖-6-磷酸受體，從而阻斷治療性酶 的結(jié)合以及隨后內(nèi)化和迀移至溶酶體中。
[0031] 圖9描繪顯示甘露糖-6-磷酸劑量依賴性抑制艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（I2S)依賴 性GAG清除的示例圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 本發(fā)明尤其提供針對(duì)溶酶體酶的改進(jìn)底物清除測(cè)定，其特別適用于測(cè)量溶酶體酶 或其它治療劑用于治療溶酶體貯積疾病的效價(jià)。特定來說，本發(fā)明組合生理相關(guān)底物細(xì)胞 測(cè)定和高效的基于閃爍的檢測(cè)方法。如本文所用，術(shù)語"效價(jià)"體現(xiàn)細(xì)胞攝取、細(xì)胞內(nèi)溶酶體 迀移和/或酶活性。在一些情況下，相較于對(duì)照或參照標(biāo)準(zhǔn)的定量效價(jià)也被稱為"相對(duì)效 價(jià)"。
[0033] 本發(fā)明的各個(gè)方面詳細(xì)描述于以下章節(jié)中。章節(jié)的使用不意圖限制本發(fā)明。各章 節(jié)可適用于本發(fā)明的任何方面。在本申請(qǐng)中，除非另外陳述，否則使用"或"意指"和/或"。 [0034]溶酶體酶和底物
[0035] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的發(fā)明方法可用于測(cè)量任何溶酶體酶，特別是已牽涉 于溶酶體貯積疾病中的那些。在一些實(shí)施方案中，溶酶體酶也被稱為替代酶或治療性酶。如 本文所用，替代酶或治療性酶可包括可起替代溶酶體貯積疾病中缺乏或丟失的溶酶體酶的 至少部分活性的作用的任何酶或蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，替代酶或治療性酶能夠降低 溶酶體中的積累物質(zhì)或可挽救或改善一種或多種溶酶體貯積疾病癥狀。
[0036] 對(duì)溶酶體貯積疾病的遺傳病因?qū)W、臨床表現(xiàn)和分子生物學(xué)的詳細(xì)綜述詳述于 Scriver等編，The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease，第7補(bǔ)充版， 第II卷，McGraw Hill ,(1995)中。它們的相應(yīng)底物例示于下表中：
[0037]表1示例性溶酶體酶和底物
[0038]
[0039]
[0040]
[0041] -般來說，溶酶體酶的生理相關(guān)底物是脂質(zhì)和糖蛋白（也稱為粘多糖或糖胺聚糖 (GAG))。如本文所用，術(shù)語"生理相關(guān)底物"是指溶酶體酶的在缺乏所述酶的患者中積累的 底物。在本申請(qǐng)中，除非明確另外指示，否則術(shù)語"底物"和"生理相關(guān)底物"可互換使用。
[0042] 通常，GAG是由重復(fù)二糖單元組成的長未分支多糖。如表1中所示，粘多糖貯積癥中 涉及的一種類型的GAG是硫酸乙酰肝素。正常硫酸乙酰肝素清除需要由許多溶酶體酶在終 末非還原性末端逐步降解寡糖鏈，所述溶酶體酶包括但不限于艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-艾杜糖醛酸酶、乙酰肝素 Ν-硫酸酯酶、乙?；?CoA Ν-乙?；D(zhuǎn)移酶、α-Ν-乙?；咸烟前?糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、Ν-乙?；咸烟前?6-硫酸酯酶。硫酸乙酰肝素的逐步降解連同 為各步驟所需的酶一起圖解于圖1中（根據(jù)Essentials of Glycobiology改編）。因此，在一 些實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于測(cè)量硫酸酯酶，包括但不限于本文所述的各種特定硫酸酯酶。
[0043] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于測(cè)量天然存在的溶酶體酶，包括直接從天然來 源(例如從細(xì)胞、動(dòng)物、植物或患者)獲得的那些內(nèi)源性酶。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可用 于測(cè)量通過任何可用手段重組或化學(xué)產(chǎn)生的溶酶體酶，包括但不限于通過利用被工程改造 以表達(dá)補(bǔ)充酶編碼核酸的宿主細(xì)胞系統(tǒng)來重組產(chǎn)生的溶酶體酶，或通過使內(nèi)源性基因活化 來產(chǎn)生的溶酶體酶，或通過化學(xué)合成來部分或完全制備的溶酶體酶。在一些實(shí)施方案中，本 發(fā)明可用于測(cè)量融合或綴合于溶酶體靶向部分(例如IGF-I、IGF-II、RAP、p97及其變體、同 源物或片段)和/或具有改變的糖基化樣式(例如增加或降低的M6P或雙M6P水平）的溶酶體 酶。
[0044] 標(biāo)記生理性底物
[0045]通常，用可檢測(cè)信號(hào)標(biāo)記適于本發(fā)明的生理相關(guān)底物以有助于檢測(cè)。在一些實(shí)施 方案中，用可由目標(biāo)溶酶體酶裂解的可檢測(cè)信號(hào)標(biāo)記特別適于本發(fā)明的生理相關(guān)底物。各 種方法可用于合成和標(biāo)記生理性底物。在特定實(shí)施方案中，生理相關(guān)底物由細(xì)胞或生物體 合成，并且在合成期間并有可檢測(cè)信號(hào)。作為一非限制性實(shí)例，以下說明基于細(xì)胞的系統(tǒng)。
[0046] 鉭患
[0047] 各種細(xì)胞類型可用于合成適于本發(fā)明的生理性底物。合適的細(xì)胞可為粘著細(xì)胞類 型或非粘著細(xì)胞類型兩者。這包括原代細(xì)胞和永生化細(xì)胞系，包括已用于標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)的 那些細(xì)胞。
[0048] -特別適用的細(xì)胞類型是其中目標(biāo)溶酶體酶的底物積累的細(xì)胞類型，例如可合成 但不能降解或完全降解底物的細(xì)胞類型。因此，在一些實(shí)施方案中，適于本發(fā)明的細(xì)胞是缺 乏目標(biāo)溶酶體酶(例如硫酸酯酶）的細(xì)胞。舉例來說，適于本發(fā)明的細(xì)胞可缺乏目標(biāo)溶酶體 酶，或具有降低的酶活性或表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，合適的細(xì)胞由罹患由缺乏目標(biāo)溶酶體 酶所致的溶酶體貯積疾病的人患者或其它生物體(例如非人動(dòng)物，諸如靈長類動(dòng)物、大鼠、 小鼠、狗、豬、綿羊等)獲得。合適的細(xì)胞可由包括但不限于腦、肝、肺、心臟、腎、皮膚、肌肉的 組織來源獲得。合適的細(xì)胞也可為上皮、內(nèi)皮、間質(zhì)和神經(jīng)外胚層細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中， 合適的細(xì)胞是由人患者或其它生物體獲得的纖維母細(xì)胞。在某些其它實(shí)施方案中，合適的 細(xì)胞是由人患者或其它生物體獲得的神經(jīng)元。
[0049] 在一些實(shí)施方案中，合適的細(xì)胞也可通過標(biāo)準(zhǔn)基因剔除技術(shù)或通過反義或干擾 RNA技術(shù)使目標(biāo)內(nèi)源性溶酶體酶消減來產(chǎn)生。所述合適的細(xì)胞可為原核(例如細(xì)菌)或真核 細(xì)胞，包括植物、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的非限制性實(shí)例 包括BALB/c小鼠骨髓瘤株系（NS0/1，ECACC編號(hào) ：85110503);人視網(wǎng)膜母細(xì)胞（PER.C6， CruCell,Leiden,The Netherlands);由SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1 株系（C0S-7，ATCC CRL 1651); 人胚腎株系(被亞克隆來達(dá)成懸浮培養(yǎng)生長的293或293細(xì)胞，Graham等，J.Gen Virol.，36: 59，1977);人纖維肉瘤細(xì)胞系（例如!11'1080);幼小倉鼠腎細(xì)胞(8冊(cè)4了0^(^10) ;中國倉 鼠卵巢細(xì)胞+/_DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc .Natl ·Acad· Sci .USA,77:4216，1980);小 鼠塞爾托利細(xì)胞(TM4，Mather，Biol · Reprod ·，23:243-251，1980);猴腎細(xì)胞（CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76，ATCC CRL-1 587);人宮頸癌細(xì)胞(HeLa，ATCC CCL 2);犬腎 細(xì)胞(MDCK，ATCC CCL 34);水牛大鼠肝細(xì)胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442);人肺細(xì)胞(W138， ATCC CCL 75);人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065);小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51);TRI 細(xì)胞(Mather等，Annals N· Y· Acad · Sci ·，383:44-68，1982) ;MRC 5細(xì)胞;FS4細(xì)胞；和人肝細(xì) 胞瘤株系(Hep G2)。
[0050] 標(biāo)記的細(xì)胞合成底物
[0051] -般來說，標(biāo)記細(xì)胞合成底物涉及使本文所述的合適的細(xì)胞在可并入底物中以提 供可檢測(cè)信號(hào)的物質(zhì)或試劑存在下生長。在一些實(shí)施方案中，使細(xì)胞從冷凍狀態(tài)解凍，并且 在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下擴(kuò)增達(dá)到預(yù)定所需細(xì)胞密度。合適的細(xì)胞密度可通過匯合度來確 定。舉例來說，合適的細(xì)胞密度可為至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 匯合的。在一 些實(shí)施方案中，合適的細(xì)胞密度可在大約25%至100%、30%至95%、35%至90%、40%至 85%、45%至80%、50%至75%、50%至99%、50%至98%、50%至97%、50%至96%、60%至 99%、60%至98%、60%至97%、60%至96%、70%至99%、70%至98%、70%至97%、70%至 96%、80%至99%、80%至98%、80%至97%、80%至96%、40%至50%、45%至55%、50%至 60%、55%至65%、60%至70%、65%至75%、70%至80%、75%至85%、80%至90%、85%至 95%、或90%至100%匯合的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，合適的細(xì)胞密度可為多達(dá)約50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 匯合的。在一 些實(shí)施方案中，合適的細(xì)胞密度可通過每孔(例如6、12、24、48或96孔板的每孔)細(xì)胞數(shù)目來 確定。舉例來說，合適的細(xì)胞密度可為每孔至少約500、1，000、1，500、2，000、2，500、3，000、 3,500、4,000、4,500、5,000、5,500、6,000、6,500、7,000、7,500、8,000、8,500、9,000、9， 500、10,000、12,500、15,000、17,500、20,000、22,500、25,000、27,500、30,000、35,000、40， 000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95， 000、100,000個(gè)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，合適的細(xì)胞密度可在大約每孔500-100,000個(gè)細(xì) 胞;每孔1，000-90，000個(gè)細(xì)胞;每孔2，000-80，000個(gè)細(xì)胞;每孔3，000-70，000個(gè)細(xì)胞;每孔 4，000-60，000個(gè)細(xì)胞;每孔5，000-50，000個(gè)細(xì)胞;每孔6，000-40，000個(gè)細(xì)胞;每孔7，000-30，000個(gè)細(xì)胞;每孔8，000-27，500個(gè)細(xì)胞;每孔9，000-25，000個(gè)細(xì)胞;每孔 10，000-25，000 個(gè)細(xì)胞;每孔12，500-25，000個(gè)細(xì)胞;每孔15，000-25，000個(gè)細(xì)胞;每孔15，000-22，500個(gè)細(xì) 胞;或每孔15,000-20，000個(gè)細(xì)胞的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，合適的細(xì)胞密度可為多達(dá) 每孔約 5,000、5,500、6,000、6,500、7,000、7,500、8,000、8,500、9,000、9,500、10,000、12， 500、15,000、17,500、20,000、22,500、25,000、27,500、30,000、35,000、40,000、45,000、50， 000、55，000、60，000、65，000、70，000、75，000、80，000、85，000、90，000、95，000、100,000個(gè) 細(xì)胞。
[0052]接著用可并入新合成的底物中，并且發(fā)射可檢測(cè)信號(hào)的物質(zhì)或試劑處理細(xì)胞。在 一些實(shí)施方案中，所述合適的物質(zhì)或試劑提供可并入新合成的底物中的放射性同位素。在 一些實(shí)施方案中，合適的放射性同位素包括在水性介質(zhì)中發(fā)射具有多達(dá)2000μπι的平均射程 的電子的那些同位素。作為非限制性實(shí)例，合適的放射性同位素包括 3H、125I、14C、35S、45Ca、 33p、32p、55Fe、109cd_l Cr。
[0053]在一些實(shí)施方案中，含有35S的物質(zhì)或試劑用于產(chǎn)生由細(xì)胞合成的放射性標(biāo)記的生 理性底物，諸如GAG。作為一非限制性實(shí)例，可在所需細(xì)胞密度(例如約95%匯合)時(shí)添加35S-硫酸鈉至生長培養(yǎng)基中以產(chǎn)生放射性標(biāo)記的GAG(例如放射性標(biāo)記的硫酸乙酰肝素）。
[0054]附著于閃爍基體
[0055]可將含有放射性標(biāo)記的底物的細(xì)胞接種至含有閃爍基體的容器中以便細(xì)胞可附 著于所述閃爍基體。可用于使細(xì)胞生長，并且具有閃爍基體的任何容器都適于本發(fā)明。這包 括燒瓶、陪替氏培養(yǎng)皿(Petr i di sh)、錐形小瓶、拋棄式袋和多孔板。容器的至少一個(gè)表面 充當(dāng)閃爍基體(也被稱為閃爍基板或閃爍層），其含有當(dāng)由電離輻射激發(fā)時(shí)展現(xiàn)發(fā)光的閃爍 體物質(zhì)。通常，閃爍基板或盤(如全塑組織培養(yǎng)器皿）需要表面改性以適合于細(xì)胞附著和/或 生長。處理優(yōu)選涉及使用高電壓等離子體放電，即一種明確確定的用于產(chǎn)生帶負(fù)電荷的塑 性表面的方法（Arnste in，C · F ·和Hartmann，P.A，J.Clini cal Microbial ·，2，1，46-54， (1975))。對(duì)于許多細(xì)胞類型，這個(gè)表面適于生長目的與測(cè)定目的兩者。然而，可通過將一定 范圍的額外涂料涂覆于裝置的培養(yǎng)表面來進(jìn)一步改進(jìn)細(xì)胞附著或生長。這些可包括：（i)帶 正電荷或負(fù)電荷的化學(xué)涂料，諸如聚賴氨酸或其它生物聚合物(McKeehan，W. L.和Ham, R.G.J.Cell Bioi.，71，727-734，（1976));(^)細(xì)胞外基質(zhì)的組分，包括膠原蛋白、層粘連 蛋白、纖維結(jié)合蛋白（Kleinman，Η·Κ·等，Anal .Biochem.，166，1-13，（ 1987))和（iii)由在塑 性表面上培養(yǎng)的細(xì)胞敷設(shè)的天然分泌的細(xì)胞外基質(zhì)(Freshney，R. I.)。此外，閃爍基板可用 諸如凝集素或粘著分子的試劑涂布以使得能夠附著細(xì)胞膜或通常懸浮生長的細(xì)胞類型。先 前已描述用于用所述試劑涂布塑性器皿的方法，參見例如8 〇1此，0.1'.和1^〇118，1?.0.， J.Immunol·，123,808,（1979)。
[0056]合適的閃爍基體優(yōu)選是透光的，以允許使用倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)的細(xì)胞，以 及使得物質(zhì)能夠以最大效率傳輸在給定波長下的光。此外，即使在暴露于來自放射性同位 素的入射辟畫射之后以及在為使板滅菌所需的嚴(yán)格輻射條件下，基體也保留它的光學(xué)性質(zhì)。 [0057]合適的閃爍基體可由含有閃爍體的任何透明材料，例如基于鑭系金屬化合物的閃 爍玻璃組成。在某些形式中，基板由任何塑性材料組成，其中構(gòu)成聚合物的單體單元通常包 括苯基或萘基部分，以吸收來自與表面緊密鄰近的放射性核素的入射輻射能量。一示例性 塑性基板由向其中并入閃爍物質(zhì)的聚苯乙烯或聚乙烯基甲苯組成。合適的閃爍物質(zhì)可包括 芳族烴，諸如對(duì)三聯(lián)苯、對(duì)四聯(lián)苯和它們的衍生物，以及噁唑和1，3,4_噁二唑的衍生物，諸 如2-(4-叔丁基苯基)-5-(4-聯(lián)苯基)-1，3，4-噁二唑和2，5-二苯基噁唑。也包括在聚合組合 物中的可為波長轉(zhuǎn)換劑，諸如1，4-雙(5-苯基-2-噁唑基)苯、9，10-二苯基蒽、1，4-雙(2-甲 基苯乙烯基)-苯等。波長轉(zhuǎn)換劑的功能在于吸收由閃爍物質(zhì)發(fā)射的光，并且再發(fā)射更好匹 配于閃爍計(jì)數(shù)器中使用的光敏感性檢測(cè)器的波長更長的光。
[0058] 具有適于本發(fā)明的閃爍基體的額外裝置以及其制備和使用方法例如描述于美國 專利號(hào)5，665，562和美國專利號(hào)5，989，854中，所述美國專利各自以引用的方式并入本文。
[0059] 根據(jù)本發(fā)明，由附著或粘著于閃爍基體的細(xì)胞合成的放射性標(biāo)記的生理性底物發(fā) 射的放射性發(fā)射物足夠靠近閃爍基體以導(dǎo)致發(fā)光，其可通過用于觀察閃爍事件的檢測(cè)手段 來檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，由細(xì)胞合成的放射性標(biāo)記的生理性底物的衰變?cè)谒越橘|(zhì)中 發(fā)射電子(例如具有多達(dá)2000μηι(例如多達(dá) 1800μηι、1600μηι、1400μηι、1200μηι、1000μηι、800μηι、 600μπι、400μπι或200μπι)的平均射程），其足以導(dǎo)致可通過諸如β計(jì)數(shù)器的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)手段檢測(cè) 的閃爍事件。生長培養(yǎng)基中的未結(jié)合或游離放射性標(biāo)記通常太遠(yuǎn)離于孔的閃爍基體的表 面，輻射能量消散至水性環(huán)境中，并且放射性蛻變將保持未被檢測(cè)器檢測(cè)。因此，由閃爍基 體產(chǎn)生的閃爍事件指示與附著或粘著于基體的細(xì)胞相關(guān)的放射性發(fā)射水平，其轉(zhuǎn)而指示細(xì) 胞內(nèi)放射性標(biāo)記的生理性底物的量?？稍谔砑尤苊阁w酶之前測(cè)量與含有放射性標(biāo)記的底物 的細(xì)胞相關(guān)的基線放射性發(fā)射水平。
[0060] 用于測(cè)量閃爍事件的裝置和方法可涉及使用非侵襲性技術(shù)，即不損害細(xì)胞的完整 性或活力的技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)量。各種β計(jì)數(shù)器，諸如Microbeta 2β計(jì)數(shù)器（由PerkinElmer制 造），可用于實(shí)施本發(fā)明。
[0061] 底物清除測(cè)定
[0062] 一旦一層細(xì)胞粘著或附著于閃爍基體，即可添加含有目標(biāo)溶酶體酶的樣品以進(jìn)行 底物清除測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，合適的樣品可含有純化溶酶體酶。舉例來說，合適的樣 品可為含有目標(biāo)溶酶體酶的配制藥物產(chǎn)品的樣品。合適的樣品也可含有部分純化或未純化 的溶酶體酶。舉例來說，由重組制造方法獲得的含有從培養(yǎng)的細(xì)胞分泌的目標(biāo)溶酶體酶的 細(xì)胞培養(yǎng)基樣品可直接用于本發(fā)明的清除測(cè)定中?；蛘?，可使用產(chǎn)生目標(biāo)溶酶體酶的重組 細(xì)胞的溶解產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，可使用由純化方法獲得的樣品，例如像來自色譜法 和/或過濾步驟的洗脫物或匯合洗脫物。在一些實(shí)施方案中，合適的樣品可為直接取自患者 的生物樣品，包括但不限于血液樣品、腦脊髓液(CSF)樣品、尿樣品和來自實(shí)體器官（例如 腦、肝、肺、心臟、腎、皮膚或肌肉）的組織提取物。在一些實(shí)施方案中，可同時(shí)測(cè)定具有滴定 量的酶的多個(gè)樣品以產(chǎn)生劑量-響應(yīng)曲線來有助于計(jì)算酶的相對(duì)效價(jià)。
[0063] 通常，在允許溶酶體酶被內(nèi)化，并且適當(dāng)遞送至溶酶體中的條件下孵育含有溶酶 體酶的樣品和細(xì)胞以便溶酶體酶可起降解積累的底物以從底物移除放射性同位素的作用。 通常，標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件可用于這個(gè)目的。舉例來說，可在37°C下在含有含濕氣的95%空 氣/5 % C02氛圍的孵育器中持續(xù)預(yù)定時(shí)期（例如約5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、 30分鐘、60分鐘、2小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、10小時(shí)、15小時(shí)、20小時(shí)、25小時(shí)、30小時(shí)、35小時(shí)或更 久)孵育細(xì)胞。
[0064] 預(yù)期降解放射性標(biāo)記的底物(例如35S標(biāo)記的GAG)導(dǎo)致放射性同位素(例如35S)從 底物裂解。因此，裂解的放射性同位素從細(xì)胞釋放至生長培養(yǎng)基中。進(jìn)一步預(yù)期生長培養(yǎng)基 中的游離放射性標(biāo)記的衰變太遠(yuǎn)離于閃爍基體以致不能產(chǎn)生信號(hào)(例如閃爍事件），并且僅 有細(xì)胞內(nèi)剩余的未降解的放射性標(biāo)記的底物的衰變將繼續(xù)發(fā)射信號(hào)。因此，與細(xì)胞相關(guān)的 放射性發(fā)射水平的降低指示溶酶體酶具有效價(jià)。與細(xì)胞內(nèi)剩余底物相關(guān)的較低放射性信號(hào) 指示較大量的內(nèi)化活性酶(即較高效價(jià)）。
[0065] 因?yàn)樯L培養(yǎng)基中的游離放射性標(biāo)記太遠(yuǎn)離于閃爍基體以致不能產(chǎn)生信號(hào)(例如 閃爍事件），所以本發(fā)明不涉及在測(cè)量剩余放射性發(fā)射信號(hào)之前的大量洗滌步驟。然而，在 一些實(shí)施方案中，在測(cè)量剩余放射性發(fā)射信號(hào)的步驟之前進(jìn)行洗滌步驟。
[0066] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清除研究可用于表征細(xì)胞攝取、細(xì)胞內(nèi)溶酶體迀移 和/或酶活性。舉例來說，為表征細(xì)胞攝?。磧?nèi)化)過程，可在候選攝取抑制劑存在下進(jìn)行 本發(fā)明的清除測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，為確定細(xì)胞攝取(即內(nèi)化)是否通過甘露糖-6-磷酸 受體而發(fā)生，可在或不在連同樣品一起添加 M6P殘余物至生長培養(yǎng)基中的情況下進(jìn)行本文 所述的清除測(cè)定。如果M6P殘余物的存在使與細(xì)胞相關(guān)的放射性發(fā)射水平的降低減小，那么 這指示細(xì)胞攝取過程依賴于甘露糖-6-磷酸受體。類似地，IGF-I、IGF-II、RAP或p97可作為 候選抑制劑用于確定細(xì)胞攝?。磧?nèi)化)是否分別通過這些肽靶向部分中的任一個(gè)而發(fā)生。 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清除測(cè)定可用于表征通過其它受體而發(fā)生的細(xì)胞攝取，所述 受體包括但不限于胰島素受體或LDL受體。
[0067] 高通量形式
[0068] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的底物清除測(cè)定可在高通量平臺(tái)上進(jìn)行。高通量平臺(tái) 特別適用于以多個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。在某些實(shí)施方案中，高通量測(cè)定可包括以下步驟： (a)向具有閃爍基體的多個(gè)孔中提供如本文所述的其中GAG積累的細(xì)胞以便所述細(xì)胞附著 或粘著于所述閃爍基體，（b)向含有所述細(xì)胞的所述多個(gè)孔同時(shí)或依序提供多個(gè)含有目標(biāo) 溶酶體酶的樣品，（c)進(jìn)行如本文所述的底物清除測(cè)定，以及(d)同時(shí)或依序測(cè)量和收集來 自所述多個(gè)孔中的各個(gè)的放射性發(fā)射信號(hào)以測(cè)定溶酶體酶的相對(duì)效價(jià)。在一些實(shí)施方案 中，例如6、12、24、48、96、384或1536孔板的多孔板可用于高通量測(cè)定。在一些實(shí)施方案中， 可使用96孔Cytostar T ?閃爍板（由PerkinElmer制造）。
[0069] 數(shù)據(jù)分析和定量
[0070] 在一些實(shí)施方案中，在添加酶至各孔中之前和之后，從含有已將放射性同位素并 入新形成的底物(例如GAG)中的細(xì)胞的閃爍板收集閃爍數(shù)據(jù)。當(dāng)酶由細(xì)胞內(nèi)化時(shí)，它裂解放 射性標(biāo)記的GAG，其從細(xì)胞被釋放。一般來說，相較于基線信號(hào)，在酶處理之后由閃爍檢測(cè)器 檢測(cè)的放射性同位素信號(hào)降低指示有效力的酶被內(nèi)化并遞送至溶酶體酶。較低信號(hào)指示較 大量的內(nèi)化和功能性酶(例如較大效價(jià))。
[0071] 在一些實(shí)施方案中，可相較于對(duì)照來定量溶酶體酶的效價(jià)。如本文所用，相對(duì)于對(duì) 照的定量效價(jià)也被稱為相對(duì)效價(jià)。在一些實(shí)施方案中，合適的對(duì)照是指示目標(biāo)溶酶體酶的 預(yù)定效價(jià)的參照標(biāo)準(zhǔn)。可通過獲取樣品的效價(jià)與參照批次的效價(jià)的比率來測(cè)定相對(duì)效價(jià)。 這可通過獨(dú)立地測(cè)定參照批次的效價(jià)和樣品的效價(jià)，接著獲取比率，或通過使用等效性或f 檢驗(yàn)進(jìn)行平行線分析來實(shí)現(xiàn)?？捎玫臉?biāo)準(zhǔn)曲線擬合軟件，諸如GraphPadPrism、Excel-fit、Stegmann PLA、StatLIA等，可用于數(shù)據(jù)分析。在一些實(shí)施方案中，合適的對(duì)照是使用相 同測(cè)定由含有已知量的目標(biāo)溶酶體酶的對(duì)照樣品獲得的放射性發(fā)射水平。在一些實(shí)施方案 中，合適的對(duì)照是通過以滴定量的酶操作相同測(cè)定所獲得的劑量-響應(yīng)曲線。在一些實(shí)施方 案中，使用一種或多種以上對(duì)照的組合。
[0072] 在一些實(shí)施方案中，使用多孔板以便可同時(shí)從一個(gè)或多個(gè)測(cè)試樣品、一個(gè)或多個(gè) 對(duì)照或標(biāo)準(zhǔn)樣品和/或多個(gè)具有連續(xù)稀釋的酶濃度的滴定樣品收集閃爍數(shù)據(jù)（即放射性同 位素信號(hào)）。用于數(shù)據(jù)分析的各種軟件在本領(lǐng)域中是可用的，并且可用于分析數(shù)據(jù)，定量和 計(jì)算相對(duì)效價(jià)。在一些實(shí)施方案中，多參數(shù)邏輯曲線擬合可用于分析數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方案 中，曲線的可用于分析數(shù)據(jù)的合適的參數(shù)包括但不限于曲線的頂點(diǎn)、彎曲的底點(diǎn)、曲線的斜 率、曲線的拐點(diǎn)、由曲線確定的EC 50或這些參數(shù)的組合?？墒褂萌魏?、3、4、5個(gè)或更多個(gè)合 適的參數(shù)。舉例來說，4參數(shù)邏輯曲線可適于各參照標(biāo)準(zhǔn)、對(duì)照和測(cè)試樣品。進(jìn)行基于來自所 比較的各對(duì)曲線的斜率參數(shù)之間的差異的平行性等效性檢驗(yàn)。如果通過平行性檢驗(yàn)，那么 受限模型(共有斜率以及上部和下部漸近線參數(shù))適于兩個(gè)曲線，從而允許計(jì)算相對(duì)效價(jià)。
[0073] 生物測(cè)定的線性是測(cè)定獲得在給定范圍內(nèi)正比于生物效價(jià)的測(cè)試結(jié)果的能力。為 確定線性，可通過預(yù)先稀釋參照標(biāo)準(zhǔn)至指定濃度來產(chǎn)生具有各種效價(jià)的"已知"樣品。以這 個(gè)方式，稀釋線性用作效價(jià)的替代。將來自具有預(yù)期相對(duì)效價(jià)值的稀釋線性樣品的數(shù)據(jù)繪 制在X軸上并將觀察相對(duì)效價(jià)繪制在Y軸上，以及相對(duì)于線性回歸來擬合數(shù)據(jù)提供對(duì)線性的 估計(jì)。如實(shí)施例中所示，本發(fā)明的平臺(tái)測(cè)定具有出乎意料寬泛范圍的線性范圍。在一些實(shí)施 方案中，本發(fā)明的測(cè)定在約10-400%、20-350%、30-300%、40-250%、或50-200%相對(duì)效價(jià) 的范圍內(nèi)是線性的。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的測(cè)定在約40-240%相對(duì)效價(jià)的范圍內(nèi)是 線性的。
[0074] 在一些實(shí)施方案中，確定各樣品中溶酶體酶的總量以使計(jì)算的效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)化。
[0075] 應(yīng)用
[0076] 本發(fā)明尤其提供一種用于樣品表征和/或方法開發(fā)的簡單和可靠的品質(zhì)控制工 具。舉例來說，本發(fā)明可特別適用于在制造和/或純化過程期間評(píng)估溶酶體酶或其它生物制 劑的效價(jià)。在一些實(shí)施方案中，用于制造溶酶體酶的方法可包括通過使用本文所述的底物 清除測(cè)定來測(cè)定溶酶體酶的效價(jià)所進(jìn)行的品質(zhì)控制步驟。舉例來說，基于測(cè)定溶酶體酶的 效價(jià)的所述品質(zhì)控制步驟可在簽發(fā)由制造方法獲得的批次之前進(jìn)行。本發(fā)明也可用于比較 或評(píng)估通過方法開發(fā)過程獲得的酶效價(jià)變化?？墒褂帽疚乃龅牡孜锴宄郎y(cè)定在多個(gè)時(shí)間 點(diǎn)多次測(cè)試由不同培養(yǎng)方法獲得的兩個(gè)或更多個(gè)樣品。在這個(gè)情況下，由一種制造方法獲 得的樣品可用作由不同方法獲得的另一樣品的對(duì)照。在一些實(shí)施方案中，基于根據(jù)本發(fā)明 測(cè)定的酶效價(jià)，可調(diào)整一個(gè)或多個(gè)制造條件。
[0077] 類似地，用于純化溶酶體酶的方法可包括使用本文所述的底物清除測(cè)定來確定溶 酶體酶的效價(jià)的步驟。舉例來說，可在簽發(fā)純化批次之前進(jìn)行這種步驟。本發(fā)明也可用于比 較或評(píng)估通過純化方法開發(fā)過程獲得的酶效價(jià)變化?？墒褂帽疚乃龅牡孜锴宄郎y(cè)定在多 個(gè)時(shí)間點(diǎn)多次測(cè)試由不同純化方法獲得的兩個(gè)或更多個(gè)樣品。在這個(gè)情況下，由一種純化 方法獲得的樣品可用作由不同方法獲得的另一樣品的對(duì)照。在一些實(shí)施方案中，基于根據(jù) 本發(fā)明確定的酶效價(jià)，可調(diào)整一個(gè)或多個(gè)純化條件。
[0078] 此外，本發(fā)明可用于表征溶酶體酶或其它治療劑的效價(jià)和/或使所述效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)化 以達(dá)成產(chǎn)品核準(zhǔn)、加標(biāo)和/或包裝。
[0079] 此外，本發(fā)明也可用于出于診斷和療法監(jiān)測(cè)目的來評(píng)估直接從患者獲得的生物樣 品中的酶效價(jià)。
[0080] 實(shí)施例
[0081] 實(shí)施例1-GAG底物清除測(cè)定
[0082]這個(gè)實(shí)施例說明用于標(biāo)記細(xì)胞合成的生理性底物(例如GAG)的示例性方法、酶清 除測(cè)定、以及用于根據(jù)本發(fā)明確定相對(duì)效價(jià)的數(shù)據(jù)分析。
[0083] 標(biāo)記細(xì)胞合成的GAG
[0084]在測(cè)定的第一周，解凍患者纖維母細(xì)胞(其中GAG積累的細(xì)胞類型），接著使其生長 直至細(xì)胞已擴(kuò)增至預(yù)定細(xì)胞密度。接著，在第14天開始，用lmCi 35S-硫酸鈉處理95%匯合的 患者細(xì)胞48小時(shí)以便它們將放射性同位素并入新形成的GAG中。接著在25,000個(gè)細(xì)胞/孔下 將細(xì)胞接種至96孔Cytostar T ?(PerkinElmer)閃爍板中。一旦附著于閃爍板，即用滴定量 的酶同時(shí)對(duì)細(xì)胞給藥。接著在37°C下以及在5%C0 2下孵育它們。一旦酶被內(nèi)化，它即裂解放 射性標(biāo)記的GAG，其從細(xì)胞被釋放并被洗除。較低35S信號(hào)指示較大量的內(nèi)化功能性酶。
[0085]數(shù)據(jù)分析
[0086] 這個(gè)底物清除測(cè)定測(cè)量相對(duì)效價(jià)，其體現(xiàn)攝取、適當(dāng)細(xì)胞內(nèi)溶酶體迀移和酶活性。 在一個(gè)96孔板上，對(duì)照、多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和多個(gè)樣品可在連續(xù)稀釋的酶濃度下操作（圖2)。4參數(shù)邏 輯曲線適于各參照標(biāo)準(zhǔn)、對(duì)照和測(cè)試樣品。進(jìn)行基于來自所比較的各對(duì)曲線的斜率參數(shù)之 間的差異的平行性等效性檢驗(yàn)，并且如果通過平行性檢驗(yàn)，那么受限模型(共有斜率以及上 部和下部漸近線參數(shù))適于兩個(gè)曲線，此允許計(jì)算相對(duì)效價(jià)(圖3和4)。
[0087] 線性
[0088] 生物測(cè)定的線性是測(cè)定獲得在給定范圍內(nèi)正比于生物效價(jià)的測(cè)試結(jié)果的能力。為 確定線性，可通過預(yù)先稀釋參照標(biāo)準(zhǔn)至指定濃度來產(chǎn)生具有各種效價(jià)的"已知"樣品。以這 個(gè)方式，稀釋線性用作效價(jià)的替代。將來自具有預(yù)期相對(duì)效價(jià)值的稀釋線性樣品的數(shù)據(jù)繪 制在X軸上并將觀察相對(duì)效價(jià)繪制在Y軸上，以及相對(duì)于線性回歸來擬合數(shù)據(jù)提供對(duì)線性的 估計(jì)。如圖5和6中以及表2中所見，這個(gè)測(cè)定在出乎意料寬泛的線性范圍內(nèi)顯示準(zhǔn)確度。從 41 % RP至243 % RP的樣品可彼此進(jìn)行比較。
[0089] 為確定測(cè)定的精確度，即盡管存在操作間和操作內(nèi)偏差，但測(cè)定獲得準(zhǔn)確結(jié)果的 能力，多個(gè)分析員進(jìn)行稀釋線性檢驗(yàn)。根據(jù)各次操作考慮的因素包括進(jìn)行測(cè)定的時(shí)日、分析 員、細(xì)胞收集濃度和 35S批次。計(jì)算各稀釋線性水平下的％GCV，并且確定這個(gè)特定測(cè)定的中 間精確度是10.3%。操作間差異取決于諸如進(jìn)行測(cè)定的時(shí)日、分析員、細(xì)胞收集濃度和35S批 次的因素，而操作內(nèi)差異取決于諸如測(cè)試樣品在板上的位置的影響和吸移連貫性的因素， 對(duì)于所有稀釋線性水平，>75%以及直至95%的差異歸因于操作內(nèi)因素。由41 %RP至243% RP計(jì)算的％GCV確認(rèn)這個(gè)方法跨越線性范圍是精確的，從而支持41 -243 % RP的方法范圍。
[0090] 表 2
[0091]
[0092] 可重現(xiàn)性和特異性
[0093] 表3中的數(shù)據(jù)顯示在極小可變性下的可重現(xiàn)性，如可以低標(biāo)準(zhǔn)偏差所見。確定的測(cè) 定對(duì)照在歷經(jīng)長久時(shí)期的多個(gè)實(shí)驗(yàn)中重現(xiàn)預(yù)期效價(jià)值。另外，當(dāng)使確定的對(duì)照暴露于應(yīng)激 條件，諸如H 202、低pH(例如4.0)或光暴露時(shí)，RP%降低。這證明測(cè)定是可重現(xiàn)的，并且能夠指 示酶歷經(jīng)延長時(shí)期具有穩(wěn)定性。
[0094] 表 3
[0095] _6]~甘露糖_6^磷酸依賴性細(xì)胞攝取^
' '
[0097] 在用以確定內(nèi)化(或細(xì)胞攝取)是否通過甘露糖-6-磷酸受體而特異性發(fā)生的這個(gè) 特定實(shí)施例中，添加5mM甘露糖-6-磷酸(M6P)至生長培養(yǎng)基中，并且如上所述進(jìn)行GAG清除 測(cè)定。甘露糖-6-磷酸結(jié)合甘露糖-6-磷酸受體，從而阻斷酶的結(jié)合以及隨后內(nèi)化和迀移至 溶酶體中。如圖7和8中所示，觀察到在5mM甘露糖-6-磷酸存在下對(duì)硫酸酯酶依賴性GAG清除 的完全抑制。
[0098] 在用以顯示受體特異性的另一實(shí)施例中，一定范圍的可溶性M6P劑量用于與I2S競 爭攝取。特異性測(cè)試顯示使用50、5、0.5、0.05和OmM M6P達(dá)成的劑量依賴性攝取抑制（圖9)。 當(dāng)高濃度的可溶性M6P占據(jù)M6P受體時(shí)，發(fā)生較少重組功能性I2S酶攝取，從而導(dǎo)致 35S標(biāo)記的 GAG從細(xì)胞的清除較低，如根據(jù)高測(cè)定信號(hào)顯而易知。在高M(jìn)6P濃度下觀察到對(duì)GAG清除的抑 制確認(rèn)I2S攝取主要由表面表達(dá)的M6P受體介導(dǎo)。
[0099] 配制影響
[0100] 為確定配制緩沖液是否影響35s標(biāo)記的GAG的清除，將重組I2S混懸于三種不同配制 緩沖液中，并且如上所述進(jìn)行GAG清除測(cè)定。下表4中所示，測(cè)試的制劑都未顯示對(duì)GAG的清 除具有可測(cè)量影響。
[0101] 表4
[0102]
[0103] 穩(wěn)健性
[0104] 為評(píng)估本發(fā)明的測(cè)定的穩(wěn)健性，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(D0E)研究被設(shè)計(jì)以考查因素變化對(duì)該 方法的影響。這個(gè)研究包括以下三種不同因素的變化:細(xì)胞數(shù)目/孔、 35S放射性標(biāo)記孵育時(shí) 間和劑量處理孵育時(shí)間。在研究中，評(píng)估最大信號(hào)/最小GAG清除。各次操作包括四個(gè)板，其 測(cè)試測(cè)定對(duì)照和樣品相對(duì)于測(cè)定陽性對(duì)照的覆蓋該方法的線性范圍的三個(gè)效價(jià)水平(41% RP、100 % RP和243 % RP)。確定幾何平均值、95 % CI、％%相對(duì)準(zhǔn)確度。在穩(wěn)健性評(píng)估內(nèi) 觀察到的％GCV值與10.3%的觀察精確度GCV-致。另外，平均％相對(duì)準(zhǔn)確度在97.8-107% 內(nèi)，其與由稀釋線性數(shù)據(jù)測(cè)量的％相對(duì)準(zhǔn)確度一致。這些數(shù)據(jù)指示所有測(cè)試條件都顯示對(duì) 觀察相對(duì)效價(jià)不具有影響，因此測(cè)定是穩(wěn)健的和準(zhǔn)確的。
[0105] 因此，本發(fā)明的底物清除測(cè)定可用于有效表征細(xì)胞攝取過程。
[0106] 盡管本文所述的某些化合物、組合物和方法已根據(jù)某些實(shí)施方案特定描述，但以 下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明化合物而非意圖限制本發(fā)明化合物。
[0107] 除非明確相反指示，否則如本文在說明書中以及在權(quán)利要求中所用的冠詞"一(a， an)"應(yīng)被理解為包括復(fù)數(shù)個(gè)指示物。除非相反指示或另外根據(jù)上下文顯而易知，否則如果 一個(gè)、超過一個(gè)或所有群組成員存在于、用于給定產(chǎn)品或過程中或另外與給定產(chǎn)品或過程 相關(guān)，那么在群組的一個(gè)或多個(gè)成員之間包括"或"的權(quán)利要求或描述被視為是符合的。本 發(fā)明包括其中群組的恰好一個(gè)成員存在于、用于給定產(chǎn)品或過程中或另外與給定產(chǎn)品或過 程相關(guān)的實(shí)施方案。本發(fā)明也包括其中超過一個(gè)或整個(gè)群組成員存在于、用于給定產(chǎn)品或 過程中或另外與給定產(chǎn)品或過程相關(guān)的實(shí)施方案。此外，應(yīng)了解除非另外指示或除非將為 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易知將出現(xiàn)矛盾或不一致，否則本發(fā)明涵蓋其中來自一個(gè)或多個(gè) 所列權(quán)利要求的一個(gè)或多個(gè)限制、要素、條款、描述性術(shù)語等被引入附屬于同一基礎(chǔ)權(quán)利要 求(或當(dāng)相關(guān)時(shí)任何其它權(quán)利要求）的另一權(quán)利要求中的所有變化形式、組合和排列。當(dāng)要 素呈現(xiàn)為清單(例如呈馬庫什(Markush)群組或類似形式)時(shí)，應(yīng)了解也公開具有要素的各 子群組，并且任何要素都可從群組移除。應(yīng)了解，一般來說，當(dāng)本發(fā)明或本發(fā)明的方面被提 及為包含特定要素、特征等時(shí)，某些本發(fā)明的實(shí)施方案或本發(fā)明的方面由所述要素、特征等 組成，或基本上由所述要素、特征等組成。出于簡明的目的，那些實(shí)施方案尚未在每種情況 下都在本文中一字不差地明確闡述。也應(yīng)了解本發(fā)明的任何實(shí)施方案或方面都可從權(quán)利要 求明確排除，無論是否在說明書中敘述特定排除。本文引用來描述發(fā)明背景以及提供關(guān)于 它的實(shí)施的額外細(xì)節(jié)的出版物、網(wǎng)站和其它參考資料據(jù)此以引用的方式并入本文。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測(cè)量溶酶體酶的效價(jià)的方法，其包括以下步驟： 使包含目標(biāo)溶酶體酶的樣品與含有所述溶酶體酶的用放射性同位素標(biāo)記的底物的細(xì) 胞接觸，所述放射性同位素可由所述溶酶體酶在允許所述溶酶體酶從所述底物裂解所述放 射性同位素的條件下裂解，其中使所述細(xì)胞附著于閃爍基體以便閃爍事件指示與所述細(xì)胞 相關(guān)的放射性發(fā)射水平； 相較于在接觸步驟之前的基線閃爍事件，通過檢測(cè)閃爍事件來測(cè)量與所述細(xì)胞相關(guān)的 放射性發(fā)射水平的變化;以及 相較于對(duì)照，基于與所述細(xì)胞相關(guān)的放射性發(fā)射水平的所述變化來確定所述溶酶體酶 的所述效價(jià)。2. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞缺乏目標(biāo)內(nèi)源性溶酶體酶。3. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是由罹患與缺乏所述目標(biāo)溶酶 體酶相關(guān)的溶酶體貯積疾病的患者獲得的纖維母細(xì)胞。4. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述溶酶體酶的用所述放射性同位素標(biāo) 記的所述底物是由所述細(xì)胞在所述放射性同位素存在下合成。5. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括以下步驟： 使細(xì)胞生長至所需匯合度； 用所述放射性同位素處理所述細(xì)胞以便所述放射性同位素并入所述溶酶體酶的新合 成的底物中；以及 將所述細(xì)胞接種至具有所述閃爍基體的孔中以便所述細(xì)胞附著于所述閃爍基體。6. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述底物是糖胺聚糖(GAG)。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述放射性同位素是35S。8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中通過用35S-硫酸鈉處理所述細(xì)胞來標(biāo)記所述底物。9. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中允許所述溶酶體酶從所述底物裂解所述 放射性同位素的所述條件包括在37°C下在含5%C0 2的氛圍下孵育所述細(xì)胞和包含所述溶 酶體酶的所述樣品。10. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括在測(cè)量步驟之前 洗滌所述細(xì)胞的步驟。11. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過β計(jì)數(shù)器來檢測(cè)所述閃爍事件。12. 如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述對(duì)照是指示所述目標(biāo)溶酶體酶的 預(yù)定效價(jià)和/或劑量-響應(yīng)曲線的參照標(biāo)準(zhǔn)。13. 如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中確定所述溶酶體酶的所述效價(jià)的步驟 包括使用受限模型計(jì)算相對(duì)效價(jià)。14. 如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中確定所述溶酶體酶的所述效價(jià)的所述 步驟是定量的。15. 如權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括確定所述樣品中 的所述目標(biāo)溶酶體酶的總量的步驟。16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括確定所述目標(biāo)溶酶體酶的比 活性。17. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法不涉及所述細(xì)胞的胰蛋白酶 消化。18. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法不涉及所述細(xì)胞的溶解。19. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述接觸步驟是在甘露糖-6-磷酸 (M6P)存在下進(jìn)行，并且其中所述方法進(jìn)一步包括將清除或效價(jià)與在無 M6P下測(cè)量的對(duì)照進(jìn) 行比較以確定細(xì)胞攝取是否具有M6P依賴性的步驟。20. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法是以高通量形式執(zhí)行，其中多 個(gè)樣品被同時(shí)測(cè)量。21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中使用多孔板，并且其中各個(gè)別孔的基體是所述閃爍 基體。22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述多孔板是6、12、24、48、96、384或1536孔板。23. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述溶酶體酶是硫酸酯酶。24. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述硫酸酯酶選自由以下組成的組:艾杜糖醛酸-2_硫酸酯酶、α-艾杜糖醛酸酶、乙酰肝素 N-硫酸酯酶、乙?；?CoA N-乙?；D(zhuǎn)移酶、α-Ν-乙 ?；咸烟前诽擒彰浮⑵咸烟侨┧崦?、Ν-乙?；咸烟前?6-硫酸酯酶及其組合。25. 如權(quán)利要求23或24所述的方法，其中所述硫酸酯酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。26. 如權(quán)利要求23或24所述的方法，其中所述硫酸酯酶是肝素 Ν-硫酸酯酶。27. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品是含有重組產(chǎn)生的所述目標(biāo) 溶酶體酶的細(xì)胞培養(yǎng)物樣品。28. 如權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品是由純化方法獲得的含有純 化或部分純化的目標(biāo)溶酶體酶的洗脫物或匯合洗脫物。29. 如權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品是含有所述目標(biāo)溶酶體酶的 配制藥物產(chǎn)品。30. 如權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品是從患者獲得的組織樣品。31. 如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述組織樣品是血液樣品、CSF樣品、尿樣品和/或 來自實(shí)體器官的活檢體樣品。32. -種用于制造目標(biāo)溶酶體酶的方法，其包括根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方 法確定所述溶酶體酶的效價(jià)的步驟。33. 如權(quán)利要求32所述的方法，其中確定所述溶酶體酶的所述效價(jià)的步驟是在簽發(fā)批 次之前進(jìn)行。34. 如權(quán)利要求32或33所述的方法，其進(jìn)一步包括基于確定的所述溶酶體酶的效價(jià)來 調(diào)整制造條件的步驟。35. -種用于純化目標(biāo)溶酶體酶的方法，其包括根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項(xiàng)所述的方 法確定所述溶酶體酶的效價(jià)的步驟。36. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中確定所述溶酶體酶的所述效價(jià)的步驟是在簽發(fā)純 化批次之前進(jìn)行。37. 如權(quán)利要求35或36所述的方法，其進(jìn)一步包括基于確定的所述溶酶體酶的效價(jià)來 調(diào)整純化條件的步驟。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105980859SQ201580008136
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2015年2月18日
【發(fā)明人】V·克哈杰拉尼
【申請(qǐng)人】夏爾人類遺傳性治療公司