肺癌診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種肺癌診斷試劑盒，屬于生物科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。所述肺癌診斷試劑盒包括用于檢測肺組織中非磷酸化EphB1表達(dá)水平的試劑。本發(fā)明該公開了檢測肺癌組織中非磷酸化EphB1表達(dá)水平的試劑在制備肺癌診斷用試劑中的用途。通過檢測肺組織中非磷酸化EPHB1表達(dá)水平，可以判斷患肺癌的風(fēng)險，為患者采取相關(guān)的治療措施或者決策提供有效的依據(jù)，對肺癌的診斷和治療具有重大意義。
【專利說明】
肺癌診斷試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種肺癌診斷試劑盒，屬于生物科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。 近50年來許多國家都報道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均 占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完 全明確。
[0003] 患肺癌的原因有多種，包括吸煙、職業(yè)和環(huán)境接觸、電離輻射、既往肺部慢性感染、 遺傳、大氣污染等等；目前認(rèn)為吸煙是肺癌的最重要的高危因素，煙草中有超過3000種化學(xué) 物質(zhì)，其中多鏈芳香烴類化合物(如:苯并芘)和亞硝胺均有很強的致癌活性。多鏈芳香烴類 化合物和亞硝胺可通過多種機制導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞DNA損傷，使得癌基因（如Ras基因）激 活和抑癌基因（如p53，F(xiàn)HIT基因等)失活，進(jìn)而引起細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，最終癌變。
[0004] 為了對肺癌進(jìn)行診斷，一般都綜合運用多種方法。到目前為止，通過對肺部原發(fā) 腫瘤以及轉(zhuǎn)移性腫瘤(包括淋巴結(jié)及其它組織器官)進(jìn)行病理活檢并通過免疫組織化學(xué)方 法進(jìn)行分析是當(dāng)前國際公認(rèn)的疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。此外，還可以結(jié)合胸部X-線攝影、胸部計 算機斷層掃描、纖維支氣管鏡等進(jìn)行輔助診斷。
[0005] 與病理診斷相比，其它輔助診斷方式均有不同的缺陷與不足;如采用胸部計算機 斷層掃描，肺癌的大小必須達(dá)到約〇 . lcm以上才能夠進(jìn)行測定，在這一時期，癌癥很可能已 經(jīng)轉(zhuǎn)移到了其它的組織;再如纖維支氣管鏡雖然可以將內(nèi)鏡插入支氣管直接對肺內(nèi)部進(jìn)行 直接觀察，但對可疑腫瘤部位也僅僅能根據(jù)臨床經(jīng)驗進(jìn)行懷疑，最終準(zhǔn)確診斷還需活檢可 疑組織進(jìn)行病理診斷。
[0006] 國家知識產(chǎn)權(quán)局于2015年6月10日公告的公告號為CN102959398B的發(fā)明專利，該 專利公開了一種含有以HpaR為有效成份的肺癌診斷用標(biāo)記，其使用血液作為檢體，不會給 患者帶來任何負(fù)擔(dān)，其存在以下技術(shù)問題：（1)外周血與局部腫瘤組織相比，無法做到及時 準(zhǔn)確地反映腫瘤的真實情況；（2)外周血無法反映出腫瘤局部微環(huán)境(腫瘤局部微環(huán)境在腫 瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移中扮演著極為重要的角色）；（3)外周血是機體絕大多數(shù)蛋白、因 子等的終末匯集處、機體任何一種損傷或應(yīng)激都可能導(dǎo)致許多蛋白、因子表達(dá)不穩(wěn)定，因此 單一檢測外周血中的某種因子其敏感性和特異性均差強人意。
[0007] 又如公告號為CN104694623A的發(fā)明專利，公開了一種同于肺癌診斷的血漿miRNA 標(biāo)志物及應(yīng)用。所述標(biāo)志物包括miRNA-486、miRNA-150、miRNA-205和miRNA-210,其存在以 下技術(shù)問題:miRNA在血漿中極其容易降解，對血漿的保存要求較高。
[0008] 目前，暫未見有包括有用于檢測肺組織中非磷酸化EphBl表達(dá)水平的試劑的試劑 盒以及檢測肺組織中非磷酸化EPHB1表達(dá)水平的試劑在制備肺癌診斷用試劑中的用途的相 關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明目的之一在于提供一種新的肺癌診斷試劑盒，以解決現(xiàn)有技術(shù)中肺癌診斷 方式不夠高靈敏性、高特異性等問題。
[0010] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 肺癌診斷試劑盒，其特征在于：包括用于檢測肺組織中非磷酸化EphBl表達(dá)水平的試 劑。
[0011]進(jìn)一步地，所述檢測肺組織中非磷酸化EphBl表達(dá)水平為免疫組化檢測方法用試 劑，非磷酸化EphBl是一種激酶。
[0012] 所述檢測肺組織中非磷酸化EphBl表達(dá)水平為Western Blot或ELISA檢測方法用 試劑。
[0013]所述試劑盒內(nèi)的試劑包括:EphBl抗體、抗體稀釋液、抗原修復(fù)液、洗滌液、二抗、 DAB顯色劑和免疫組化筆。
[0014]本發(fā)明的另一個目的是提供檢測肺組織中非磷酸化EphBl表達(dá)水平的試劑在制備 肺癌診斷用試劑中的用途。
[0015]所述檢測肺組織中非磷酸化EphBl表達(dá)水平的試劑為免疫組化檢測方法用試劑。 [0016] 所述檢測肺組織中非磷酸化EphBl表達(dá)水平的試劑為Western Blot或ELISA檢測 方法用試劑。
[0017]本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明通過檢測非磷酸化EphBl表達(dá)水平，根據(jù)肺癌組織與正常肺組織中非磷酸化 EphBl表達(dá)水平的差異，可以判斷出待檢人患肺癌的風(fēng)險:若非磷酸化EphBl高，則患肺癌的 風(fēng)險高，若非磷酸化EphBl低，則患肺癌的風(fēng)險低，非磷酸化EphBl可以作為肺癌早期診斷的 標(biāo)志物，可用于肺癌的輔助診斷，臨床應(yīng)用前景良好，對于肺癌的診斷、治療具有重大意義。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0019] 實施例1 以免疫組化方法為例253例肺癌患者石蠟組織進(jìn)行非磷酸化EphBl表達(dá)水平的檢測，并 以70例肺癌遠(yuǎn)端石蠟組織作為正常對照。
[0020] ( - )試劑來源 EPHB1抗體:購自美國affinity公司，型號為AF5012; Dako HRP標(biāo)記的二抗工作液、抗體稀釋液、顯色劑(DAB)、抗原修復(fù)液、Wash Buffer、免 疫組化筆，均購自丹麥Dako公司。
[0021] (二)臨床資料 選取肺癌患者石蠟切片253例，遠(yuǎn)端對照70例，其臨床資料如下：
上述表格中，其他包括大細(xì)胞癌、腺鱗癌、小細(xì)胞癌。
[0022](三)檢測方法 (I) 封閉過氧化物酶:取石蠟切片進(jìn)行脫蠟，脫至水化后，用3% H202溶液于暗處封閉內(nèi) 源性過氧化物酶，室溫孵育15 min; 脫錯的操作過程如下：二甲苯IlOmin-二甲苯II lOmin-無水乙醇5min-95%乙醇 5min-85%乙醇 5min-75%乙醇 5min。
[0023] (2)蒸餾水漂洗:切片置于蒸餾水中，搖床上洗5 min/次，共三次； (3) 抗原修復(fù):加入pH 8.0的Tris-EDTA或pH 6.0的檸檬酸鈉溶液，在95 °C水浴鍋中水 浴50 min，進(jìn)行抗原修復(fù)； (4) 蒸餾水漂洗:取出切片，自然冷卻至室溫后，用蒸餾水洗三遍，再用Wash Buffer潤 洗一次； (5) 孵育一抗:用免疫組化筆將組織圈住，防止抗體流出，然后在圈內(nèi)滴加EPHB1抗體稀 釋液(抗體稀釋液是抗體與稀釋液按1:200的比例配置而成），4 °C孵育過夜； (6) 蒸餾水漂洗：用蒸餾水洗三遍，Wash Buffer潤洗一次； (7) 滴加二抗:滴加 Dako HRP標(biāo)記的二抗工作液(二抗與稀釋液的比例為1:50)，室溫孵 育60 min; (8) 蒸餾水漂洗:蒸餾水洗，5min/次，共三次； (9) DAB顯色:滴加顯色底物DAB，在顯微鏡下觀察顯色情況，于蒸餾水中終止反應(yīng)； (10) 蘇木素復(fù)染:將切片放入蘇木素染液中染色2 min，l%鹽酸酒精分化后，流水沖洗 10 min； (II) 脫水透明：經(jīng)80%、95%、100%梯度酒精脫水、二甲苯透明，于通風(fēng)廚中干燥； (12)封片：用中性快干膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，DP Controller圖像采集系統(tǒng)采 圖。
[0024](四）免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn) 腫瘤細(xì)胞染色強度*腫瘤細(xì)胞陽性面積為〇~9分； (五) 檢測結(jié)果
由兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)生采用SPSS17軟件對實驗組(肺癌組織)和對照組(遠(yuǎn)端對照 組織)進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到以下結(jié)果，結(jié)果中，陰性為0分，低度陽性為1~3分，高度陽性>3 分。
[0025] 陽性表達(dá)率：
(六) 結(jié)果分析 由以上結(jié)果可以看出，與癌旁正常肺組織相比，肺癌組織的非磷酸化EphBl顯著升高， 說明肺癌與非磷酸化EphBl表達(dá)水平呈正相關(guān)，非磷酸化EphBl的高表達(dá)會顯著提高患肺癌 的可能性。由于癌旁正常肺組織的FRK水平可反映正常人肺組織的非磷酸化EphBl水平，因 此，可以通過檢測待檢人群的非磷酸化EphBl的表達(dá)水平，將肺癌的易感人群篩查出來。
[0026] 實施例2 本實施例給出一種肺癌診斷試劑盒，具體如下： 1、試劑盒的組成 檢測試劑盒(50人份）：
備注:本表格按每張切片滴加各類實驗試劑為lOOyL/張，具體用量可根據(jù)組織大小適 當(dāng)增減。
[0027] 2、試劑盒的使用方法同實施例1。
[0028]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，凡是依 據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化，均落入本發(fā)明的保護 范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 肺癌診斷試劑盒，其特征在于:包括用于檢測肺組織中非磷酸化EphBl表達(dá)水平的試 劑。2. 如權(quán)利要求1所述的肺癌診斷試劑盒，其特征在于：所述檢測肺組織中非磷酸化 EphBl表達(dá)水平為免疫組化檢測方法用試劑。3. 如權(quán)利要求1所述的肺癌診斷試劑盒，其特征在于：所述檢測肺組織中非磷酸化 EphBl表達(dá)水平為Western Blot或ELISA檢測方法用試劑。4. 如權(quán)利要求2所述的肺癌診斷試劑盒，其特征在于:所述試劑盒內(nèi)的試劑包括:EphBl 抗體、抗體稀釋液、抗原修復(fù)液、洗滌液、二抗、DAB顯色劑和免疫組化筆。5. 檢測肺癌組織中非磷酸化EphBl表達(dá)水平的試劑在制備肺癌診斷用試劑中的用途。6. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于：所述檢測肺組織中非磷酸化EphBl表達(dá)水平 的試劑為免疫組化檢測方法用試劑。7. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于：所述檢測肺組織中非磷酸化EphBl表達(dá)水平 的試劑為Western Blot或ELISA檢測方法用試劑。
【文檔編號】G01N33/574GK106053816SQ201610692202
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月19日
【發(fā)明人】何英
【申請人】四川大學(xué)華西第二醫(yī)院