本發(fā)明涉及裂藻微生物，尤其是涉及誘導(dǎo)裂藻微生物在含宿主藻的半固體平板上形成趨化環(huán)的方法。

背景技術(shù)：

微藻能源，由于其可再生性，已引起了公眾及科學(xué)研究的廣泛興趣(Stephens et al.,2010；Wang et al.,2012)。與作為能源原料的部分高等植物相比，藻類生物質(zhì)具有更高的生長速率及可對污染物和溫室氣體CO₂進(jìn)行生物固定等優(yōu)點(diǎn)(Prajapati et al.,2013)。在諸多進(jìn)行研究的產(chǎn)能微藻中，三角褐指藻由于其生長速率快，可適應(yīng)于海水環(huán)境及可大規(guī)模培養(yǎng)，油脂產(chǎn)量高，尤其是其全基因組也已公開化等優(yōu)點(diǎn)，成為微藻能源研究中一種重要的模式藻種(Bowler et al.,2008)。

盡管如此，在將微藻轉(zhuǎn)化為可用的生物燃料過程中，科學(xué)家們?nèi)悦媾R著諸多困難和挑戰(zhàn)，其中重要的一點(diǎn)就是微藻細(xì)胞的破碎。目前已有利用病毒或細(xì)菌等微生物方法來裂解微藻細(xì)胞壁以釋放藻體內(nèi)的油脂等有益成分的研究報道，如Cheng等(Cheng et al.,2013)利用病毒裂解自養(yǎng)小球藻的細(xì)胞壁，使得儲藏在胞內(nèi)的淀粉釋放出來，再利用大腸桿菌對釋放的淀粉等有益物質(zhì)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，從而獲得生物乙醇。利用微生物的方法來破碎藻細(xì)胞，從成本、方便程度及規(guī)?；潭葋砜矗浔葌鹘y(tǒng)的物理化學(xué)方法更有優(yōu)勢。

在水環(huán)境中，細(xì)菌的趨化性是一種普遍現(xiàn)象，浮游植物如藻類會釋放一些分泌物，某些細(xì)菌在感知到營養(yǎng)物的存在后會向其移動。如Lovejoy等(Lovejoy et al.,1998)曾報道一種殺藻細(xì)菌Pseudoalteromonas會在目標(biāo)藻周圍形成高濃度的分布區(qū)域，即趨化環(huán)。Sonnenschein等(Sonnenschein et al.,2012)人則發(fā)現(xiàn)菌株Marinobacter adhaerens的趨化性介導(dǎo)了其與硅藻Thalassiosira weissflogii的直接接觸。由于目前有關(guān)溶藻細(xì)菌的研究主要是在水華或赤潮調(diào)控及治理等方面，且大多數(shù)的報道是有關(guān)間接殺藻方式，即細(xì)菌通過釋放一類化合物來殺死藻細(xì)胞。而有關(guān)利用細(xì)菌直接殺藻，尤其是能源微藻的研究則是少之又少。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的是提供團(tuán)聚拉布倫茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531。

本發(fā)明的第二目的是提供一種裂藻微生物裂解液的制備方法。

本發(fā)明的第三目的是提供一種裂藻微生物裂解液在裂解產(chǎn)油微藻細(xì)胞壁中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四目的是提供一種誘導(dǎo)裂藻微生物在含宿主藻的半固體平板上形成趨化環(huán)的方法。

所述團(tuán)聚拉布倫茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531已于2016年7月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編：430072，保藏中心保藏編號為CCTCC NO：M 2016378。

所述裂藻微生物裂解液的制備方法，包括以下步驟：

1)將對數(shù)期生長的三角褐指藻原液接種于滅菌的f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得藻液；

2)將步驟1)所得藻液滅菌，得液體PTF培養(yǎng)基；

3)將團(tuán)聚拉布倫茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531接種于步驟2)所得的液體PTF培養(yǎng)基培養(yǎng)，得菌液；

4)將步驟3)所得菌液與濃縮后的藻液混合后倒雙層平板，具體方法如下：

配制瓊脂濃度為1.2％的f/2培養(yǎng)基作為下層培養(yǎng)基，配制瓊脂濃度為0.7％的f/2培養(yǎng)基為上層培養(yǎng)基并分裝至5mL/管；取50mL處于對數(shù)生長周期的藻液于4000g離心5min后倒去上清，用1mL的滅菌f/2培養(yǎng)基重懸沉淀形成濃縮藻液；將步驟3)得到的菌液和濃縮藻液與50℃上層培養(yǎng)基按照體積比為100μL︰1mL︰5mL混合后倒入下層培養(yǎng)基上，待瓊脂凝固后倒置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯的空斑現(xiàn)象；

5)挖取步驟4)出現(xiàn)的單個空斑，用f/2培養(yǎng)基浸泡，按照1︰10的體積比加入到新鮮的生長至對數(shù)期的三角褐指藻藻液中，感染一周后得裂解液；

6)將步驟5)得到的裂解液按步驟4)重新倒雙層平板，再按步驟5)獲得變澄清的裂藻微生物裂解液。

在步驟1)中，所述接種的接種量可按對數(shù)期生長的三角褐指藻原液︰f/2培養(yǎng)基＝1︰10；所述f/2培養(yǎng)基的組成可為：75mg NaNO₃,5mg NaH₂PO₄·H₂O，4.36mg Na₂EDTA·2H₂O，3.15mg FeCl₃·6H₂O，0.01mg CoCl₂·6H₂O，0.18mg MnCl₂·4H₂O，0.006mg NaMoO₄·2H₂O，0.1mg thiamine·HCl，0.5μg vitamin B₁₂，0.5μg biotin，溶解于1L經(jīng)0.45μm膜過濾的海水中；所述培養(yǎng)可于20±1℃，12h光照，12h黑暗，50μmol photons m^-2s^-1光照強(qiáng)度條件下培養(yǎng)14d。

在步驟2)中，所述滅菌的條件可為：121℃，21min。

在步驟3)中，所述培養(yǎng)的條件可置于27℃搖床，180rpm震蕩培養(yǎng)10d。

所述裂藻微生物裂解液可在裂解產(chǎn)油微藻細(xì)胞壁中應(yīng)用。

本發(fā)明獲得新鮮的感染效果良好的裂解液，該裂解液能夠裂解包括三角褐指藻，自養(yǎng)小球藻等幾種能源微藻，能夠應(yīng)用于利用微生物方法破碎藻細(xì)胞壁使得藻內(nèi)如油脂、淀粉等有益物質(zhì)釋放，進(jìn)而有助于生物轉(zhuǎn)化為生物燃料。

配制半固體培養(yǎng)基的瓊脂濃度為0.18％，適合于裂解液中的裂藻微生物的運(yùn)動，適合于趨化環(huán)現(xiàn)象的觀察。

所述誘導(dǎo)裂藻微生物在含宿主藻的半固體平板上形成趨化環(huán)的方法，包括以下步驟：

1)配制寡營養(yǎng)的MM₂液體培養(yǎng)基，加入瓊脂后滅菌；

在步驟1)中，所述寡營養(yǎng)的MM₂液體培養(yǎng)基的組成可為：1L陳海水中含有18mM(NH₄)₂SO₄、1μM FeSO₄.7H₂O、100μL 1M KH₂PO₄/Na₂HPO₄緩沖液；所述寡營養(yǎng)的MM₂液體培養(yǎng)基與瓊脂的配比可為100mL︰0.18g；所述滅菌可置于高壓滅菌鍋內(nèi)按照121℃滅菌21min。

2)待步驟1)中滅菌培養(yǎng)基的溫度降至50℃后，向其中加入裂藻微生物裂解液，混合后倒平板，得半固體瓊脂平板；

在步驟2)中，所述倒平板可按15mL/板倒平板。

3)對處于對數(shù)生長期的三角褐指藻藻液，離心后取1mL上清液置于滅菌的1.5mL離心管中，得到處理液A；將離心得到的藻體沉淀重懸于滅菌的3mL MM₂液體培養(yǎng)基中得到濃縮的藻液，取1mL作為處理液B；另取1mL置于高壓滅菌鍋內(nèi)按照121℃滅菌21min，得到處理液C；取1mL濃縮的藻液置于超聲破碎儀中按照功率120W，工作時間5s︰間歇時間5s,80次循環(huán)來對藻體進(jìn)行破碎，得到處理液D；取1mL的新鮮的藻裂解液，作為處理液E；以滅菌的Milli-Q水為對照；

4)取步驟3)中的藻液處理液A、處理液B、處理液C、處理液D、處理液E和對照組的Milli-Q各10μL加于步驟2)得到的半固體瓊脂平板的中心位置，然后置于黑暗、溫度20℃的環(huán)境下2天，直至在半固體瓊脂平板的中心位置出現(xiàn)明顯的趨化環(huán)為止。

所述團(tuán)聚拉布倫茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531能夠在三角褐指藻的藻平板上形成直徑約2cm的空斑，并且隨著時間的延長，空斑區(qū)域會延伸至整個平板。

本發(fā)明獲得新鮮的感染效果良好的裂解液，該裂解液能夠裂解包括三角褐指藻，自養(yǎng)小球藻等幾種能源微藻，能夠應(yīng)用于利用微生物方法破碎藻細(xì)胞壁使得藻內(nèi)如油脂、淀粉等有益物質(zhì)釋放，進(jìn)而有助于生物轉(zhuǎn)化為生物燃料。

附圖說明

圖1為團(tuán)聚拉布倫茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531在三角褐指藻平板上形成的逐漸擴(kuò)大的空斑。

圖2為團(tuán)聚拉布倫茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531在滴加有藻體的半固體瓊脂平板上形成的趨化環(huán)。

圖3為團(tuán)聚拉布倫茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531在滴加有不同處理藻體的半固體瓊脂平板上形成的趨化環(huán)的直徑大小。

具體實施方式

以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不限于下述實施例。

實施例1：團(tuán)聚拉布倫茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531在三角褐指藻的空斑形成

1)按照1︰10的接種量，將對數(shù)期生長的三角褐指藻原液接種于滅菌的f/2培養(yǎng)基中，于20±1℃，12h光照，12h黑暗，50μmol photons/m²s-1光照強(qiáng)度條件下培養(yǎng)14d以獲得較濃的藻液；

2)將步驟1)中所得的藻液進(jìn)行高壓滅菌(121℃,21min)以獲得液體的PTF培養(yǎng)基，并按照4mL/管分裝于玻璃試管中；

3)將團(tuán)聚拉布倫茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531接種于步驟2)所得的培養(yǎng)基中，置于27℃搖床，180rpm震蕩培養(yǎng)10d；

4)配制瓊脂濃度為1.2％的f/2固體培養(yǎng)基作為下層培養(yǎng)基，配制瓊脂濃度為0.7％的f/2培養(yǎng)基為上層培養(yǎng)基并分裝至5mL/管；

5)取50mL處于對數(shù)生長周期的藻液于4000g離心5min后倒去上清，用1mL的滅菌f/2培養(yǎng)基重懸沉淀形成濃縮的藻液；

6)將步驟3)得到的菌液，步驟5)得到的濃縮藻液與步驟4)得到的50℃上層培養(yǎng)基按照體積比為100μL︰1mL︰5mL進(jìn)行混合迅速均勻倒入到下層培養(yǎng)基上，待瓊脂凝固后倒置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10d至出現(xiàn)明顯的空斑現(xiàn)象。

實施例2：裂藻微生物裂解液的制備

1)挖取實施例1中出現(xiàn)的直徑較大的單個空斑，用滅菌的f/2培養(yǎng)基浸泡過夜；

2)按照1︰10的體積比例將浸泡液加入到新鮮的生長至對數(shù)期的三角褐指藻藻液中，感染一周形成新鮮的裂藻效果很好已經(jīng)變澄清的裂解液；

3)將步驟2)獲得的裂解液按照雙層平板法重新倒雙層平板，將得到的空斑重新感染新鮮的三角褐指藻藻液，以使得團(tuán)聚拉布倫茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531能夠同時在藻液及藻平板上保持穩(wěn)定的感染活性。

實施例3：趨化環(huán)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)

1)配制100mL寡營養(yǎng)的MM₂液體培養(yǎng)基，并向其中添加0.18g的瓊脂，以使得瓊脂的終濃度為0.18％，將此培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋內(nèi)按照121℃滅菌21min；

2)按照實施例2中裂解液的制備方法獲得新鮮的裂解效果較好的裂解液；

3)待步驟1)中滅菌培養(yǎng)基的溫度降至50℃后，向其中加入步驟2)得到的裂解液10mL，充分混合后按照15mL/板倒平板，待冷卻后備用；

4)滴加10μL新鮮的藻液于步驟3)得到的半固體平板中間；另取一半固體平板并于中間滴加滅菌的Milli-Q水作為對照；

5)將步驟4)后得到的平板放置于黑暗，溫度20℃的環(huán)境下2天，直至在平板的中心位置出現(xiàn)明顯的趨化環(huán)為止。

實施例4：團(tuán)聚拉布倫茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531在不同藻體營養(yǎng)下的趨化環(huán)直徑大小

1)配制100mL寡營養(yǎng)的MM₂液體培養(yǎng)基，并向其中添加0.18g的瓊脂，以使得瓊脂的終濃度為0.18％，將此培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋內(nèi)按照121℃滅菌21min；

2)按照權(quán)利要求2中裂解液的制備方法獲得新鮮的裂解效果較好的裂解液；

3)待步驟1)中滅菌培養(yǎng)基的溫度降至50℃后，向其中加入步驟2)得到的裂解液10mL，充分混合后按照15mL/板倒平板，待冷卻后備用；

4)對500mL處于對數(shù)生長期的三角褐指藻藻液，于5000g離心10min，取部分上清液置于滅菌的1.5mL離心管中，得到處理液A；將離心得到的藻體沉淀重懸于滅菌的3mL MM₂液體培養(yǎng)基中得到濃縮的藻液，取1mL作為處理液B；另取1mL置于高壓滅菌鍋內(nèi)按照121℃滅菌21min，得到處理液C；取1mL濃縮的藻液置于超聲破碎儀((NingBo Scientiz Biotechnological Co.,Ltd,China)中按照功率120W，工作時間5s︰間歇時間5s，80次循環(huán)來對藻體進(jìn)行破碎，得到處理液D；取1mL的新鮮的藻裂解液，作為處理液E；以滅菌的Milli-Q水為對照；

5)取步驟4)中的藻液處理液A、處理液B、處理液C、處理液D、處理液E及對照組的Milli-Q各10μL小心滴加于步驟3)得到的半固體瓊脂平板的中心位置；

6)將步驟5)后得到的平板放置于黑暗，溫度20℃的環(huán)境下2天，直至在平板的中心位置出現(xiàn)明顯的趨化環(huán)，再分別測量趨化環(huán)的直徑大小。根據(jù)趨化環(huán)直徑大小結(jié)果顯示，高壓滅菌對藻細(xì)胞的破壞最為徹底而趨化環(huán)直徑也最大。

團(tuán)聚拉布倫茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531在三角褐指藻平板上形成的逐漸擴(kuò)大的空斑參見圖1，團(tuán)聚拉布倫茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531在滴加有藻體的半固體瓊脂平板上形成的趨化環(huán)參見圖2，團(tuán)聚拉布倫茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531在滴加有不同處理藻體的半固體瓊脂平板上形成的趨化環(huán)的直徑大小參見圖3。

本發(fā)明所述宿主藻為三角褐指藻(Phacodactylum tricornutum)。通過雙層平板法獲得裂藻微生物在宿主藻平板上形成的空斑，然后挖取空斑，并用滅菌f/2培養(yǎng)基浸泡過夜后，加入到新鮮的生長至對數(shù)期的三角褐指藻液中感染一周以形成裂解液；離心宿主藻液收集藻細(xì)胞，將藻細(xì)胞通過超聲破碎儀或高壓滅菌方法破碎藻細(xì)胞以釋放營養(yǎng)物質(zhì)，并滴加在混合有裂解液的半固體瓊脂平板上，以觀察趨化性現(xiàn)象。該裂藻微生物的裂解液能裂解三角褐指藻細(xì)胞，促進(jìn)藻內(nèi)有益物質(zhì)如油脂等的釋放，對其裂藻特點(diǎn)及趨化性的研究使其在微藻能源的開發(fā)利用及裂藻機(jī)制方面具有重要的意義和實用價值。