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      茯苓多糖的提取方法

      文檔序號:9342305閱讀:1960來源:國知局
      茯苓多糖的提取方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明屬于生物提取技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及茯苓多糖的提取方法。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 茯苓多糖是茯苓的重要化學(xué)成分之一,近代臨床及藥理研究表明,茯苓多糖具有 很好的抗腫瘤作用,該多糖具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,還能增強(qiáng)細(xì)胞 的免疫反應(yīng)并激活機(jī)體對腫瘤的免疫檢測系統(tǒng),具有一定的抗腫瘤功效。然而,茯苓多糖由 于提取工藝落后,得到的產(chǎn)品呈黃褐色,這是由于茯苓多糖中色素含量較多,影響了茯苓多 糖的色澤,不僅如此,常規(guī)工藝提取的茯苓多糖對小鼠 Lewis肺癌腫瘤的抑制有效率僅為 19. 6%~35%〇

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種茯苓多糖的提取方法,該方法得到的茯苓多 糖純度高,且抗腫瘤活性好。
      [0004] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案是茯苓多糖的提取方法,包括以下步驟:
      [0005] 1)將茯苓破碎,用6~12倍重量80~95v%乙醇回流提取2~3次,每次回流 2~3h,過濾,取濾渣備用;
      [0006] 2)將濾渣用6~12倍重量的水回流提取2~3次,每次提取2~3h,過濾,收集 濾液備用;
      [0007] 3)將濾液濃縮至60°C下相對密度為I. 1~1. 3的浸膏,加入乙醇沉淀,離心得沉 淀;
      [0008] 4)將沉淀依次用2~4倍重量的無水乙醇、丙酮分別洗滌,將洗滌后的沉淀用2~ 4倍蒸餾水溶解,過截留分子量為6萬的中空纖維膜,收集濃縮液,然后將濃縮液過截留分 子量為10萬的中空纖維膜,收集透過液離心,過濾,取濾液備用;
      [0009] 5)取濾液噴霧干燥,即為茯苓多糖。
      [0010] 步驟3)中,往浸膏中加入90~95v%的乙醇至乙醇含量為80~85v%。
      [0011] 步驟4)中,洗滌后的沉淀溶于蒸餾水后,先過截留分子量為6萬的中空纖維膜,這 樣活性分子量低于6萬的多糖以及低聚糖、單糖和色素均隨著透過液流出,收集的濃縮液 過截留分子量為10萬的中空纖維膜,大分子蛋白質(zhì)以及分子量高于10萬的多糖被截留,收 集透過液。
      [0012] 本發(fā)明兩次過中空纖維膜,不僅可以最大程度地去除雜質(zhì)和色素,以保證成品純 度和色澤,且提取得到的茯苓多糖分子量在6萬~10萬之間,其抗腫瘤活性比其他區(qū)間范 圍內(nèi)的多糖活性要高。
      【具體實(shí)施方式】
      [0013] 以下具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述,但不作為對本發(fā)明的限定。
      [0014] 實(shí)施例1
      [0015] 1)將茯苓破碎,用6倍重量80v%乙醇回流提取2次,每次回流2h,過濾,取濾渣備 用;
      [0016] 2)將濾渣用6倍重量的水回流提取2次,每次提取2h,過濾,收集濾液備用;
      [0017] 3)將濾液濃縮至60°C下相對密度為I. 1的浸膏,往浸膏中加入90v%的乙醇至乙 醇含量為80v%沉淀,離心,得到沉淀;
      [0018] 4)將沉淀依次用2倍重量的無水乙醇、丙酮分別洗滌,將洗滌后的沉淀用2倍蒸餾 水溶解,過截留分子量為6萬的中空纖維膜,收集濃縮液,然后將濃縮液過截留分子量為10 萬的中空纖維膜,收集透過液離心,過濾,取濾液備用;
      [0019] 5)取濾液噴霧干燥,即為茯苓多糖。用苯酚-硫酸法測定多糖含量為90. 9%,顏 色為白色。
      [0020] 對照組
      [0021] 1)將茯苓破碎,用6倍重量80v%乙醇回流提取2次,每次回流2h,過濾,取濾渣備 用;
      [0022] 2)將濾渣用6倍重量的水回流提取2次,每次提取2h,過濾,收集濾液備用;
      [0023] 3)將濾液濃縮至60°C下相對密度為I. 1的浸膏,往浸膏中加入90v%的乙醇至乙 醇含量為80v%沉淀,離心,得到沉淀;
      [0024] 4)將沉淀依次用2倍重量的無水乙醇、丙酮分別洗滌,將洗滌后的沉淀用2倍蒸餾 水溶解,上D303型大孔樹脂,用水洗脫至流出液無色透明,收集流出液,濃縮,噴霧干燥,即 為茯苓多糖。用苯酚-硫酸法測定多糖含量為86. 0%,顏色為淺黃色。
      [0025] 實(shí)施例2
      [0026] 1)將茯苓破碎,用12倍重量95v%乙醇回流提取3次,每次回流3h,過濾,取濾渣 備用;
      [0027] 2)將濾渣用12倍重量的水回流提取3次,每次提取3h,過濾,收集濾液備用;
      [0028] 3)將濾液濃縮至60°C下相對密度為1. 3的浸膏,往浸膏中加入95v%的乙醇至乙 醇含量為85v%沉淀,離心,得到沉淀;
      [0029] 4)將沉淀依次用4倍重量的無水乙醇、丙酮分別洗滌,將洗滌后的沉淀用4倍蒸餾 水溶解,過截留分子量為6萬的中空纖維膜,收集濃縮液,然后將濃縮液過截留分子量為10 萬的中空纖維膜,收集透過液離心,過濾,取濾液備用;
      [0030] 5)取濾液噴霧干燥,即為茯苓多糖。用苯酚-硫酸法測定多糖含量為91. 3%,顏 色為白色。
      [0031] 實(shí)施例3
      [0032] 1)將茯苓破碎,用10倍重量90v%乙醇回流提取2次,每次回流2h,過濾,取濾渣 備用;
      [0033] 2)將濾渣用10倍重量的水回流提取2次,每次提取2h,過濾,收集濾液備用;
      [0034] 3)將濾液濃縮至60°C下相對密度為1. 2的浸膏,往浸膏中加入95v%的乙醇至乙 醇含量為85v%沉淀,離心,得到沉淀;
      [0035] 4)將沉淀依次用3倍重量的無水乙醇、丙酮分別洗滌,將洗滌后的沉淀用3倍蒸餾 水溶解,過截留分子量為6萬的中空纖維膜,收集濃縮液,然后將濃縮液過截留分子量為10 萬的中空纖維膜,收集透過液離心,過濾,取濾液備用;
      [0036] 5)取濾液噴霧干燥,即為茯苓多糖。用苯酚-硫酸法測定多糖含量為91. 6%,顏 色為白色。
      [0037] 為驗(yàn)證本發(fā)明的茯苓多糖具有較強(qiáng)的免疫促進(jìn)作用,現(xiàn)進(jìn)行以下動物實(shí)驗(yàn)。
      [0038] 1、抗Lewis肺癌活性實(shí)驗(yàn)
      [0039] 取清潔級C57BL/6小鼠30只,小鼠體重18~20g,隨機(jī)分為3組,每組10只,分別 為實(shí)驗(yàn)組,陰性對照組和陽性對照組。
      [0040] 取生長旺盛的小鼠 Lewis肺癌腫瘤細(xì)胞以常規(guī)方法制成勻漿約1~2X 107cfu/ml 的癌細(xì)胞懸浮液,于每只小鼠的右腋皮下接種〇. 2ml癌細(xì)胞懸浮液,24h后,各組開始每日 口服給藥一次,實(shí)驗(yàn)組給藥實(shí)施例1的茯苓多糖,陰性對照組給藥生理鹽水,陽性對照組給 藥對照例1的茯苓多糖,給藥劑量見下表1,連續(xù)給藥10天。停藥后次日處死所有動物,截 取足趾稱重并計算腫瘤抑制率。腫瘤生長抑制率按下列公式計算,抑制率(%) = (陰性對 照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組/陽性對照組瘤重)/陰性對照組瘤重X 100。
      [0041 ]表 1
      [0043] 注:與陰性對照組相比,*p < 0· 05,**p < 0· 01。
      [0044] 由上表可知,米用常規(guī)方法提取的獲等多糖對小鼠 Lewi s肺癌的抑制率達(dá) 32. 85%,而本發(fā)明提取的茯苓多糖對小鼠 Lewis肺癌的抑制率高達(dá)56. 25%,明顯優(yōu)于常 規(guī)茯苓多糖。
      [0045] 2、抗C-26結(jié)腸癌活性實(shí)驗(yàn)
      [0046] 取清潔級C57BL/6小鼠30只,小鼠體重18~20g,隨機(jī)分為3組,每組10只,分別 為實(shí)驗(yàn)組,陰性對照組和陽性對照組。
      [0047] 取生長旺盛的小鼠 C-26結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞以常規(guī)方法制成勻漿約1~2 X IO7Cfu/ ml的癌細(xì)胞懸浮液,于每只小鼠的右腋皮下接種0. 2ml癌細(xì)胞懸浮液,24h后,各組開始每 日口服給藥一次,實(shí)驗(yàn)組給藥實(shí)施例1的茯苓多糖,陰性對照組給藥生理鹽水,陽性對照組 給藥對照例1的茯苓多糖,給藥劑量見下表2,連續(xù)給藥10天。停藥后次日處死所有動物, 截取足趾稱重并計算腫瘤抑制率。腫瘤生長抑制率按下列公式計算,抑制率(%) =(陰性 對照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組/陽性對照組瘤重)/陰性對照組瘤重X 100。
      [0048] 表 2

      [0050] 注:與陰性對照組相比,,*p < 0· 05,**p < 0· 01。
      [0051] 由上表可知,采用常規(guī)方法提取的茯苓多糖對小鼠 C-26結(jié)腸癌的抑制率達(dá) 26. 75%,而本發(fā)明提取的茯苓多糖對小鼠 Lewis肺癌的抑制率高達(dá)54. 52%,明顯優(yōu)于常 規(guī)茯苓多糖。
      【主權(quán)項】
      1. 茯苓多糖的提取方法,其特征在于:包括以下步驟: 1) 將茯苓破碎,用6~12倍重量80~95v%乙醇回流提取2~3次,每次回流2~ 3h,過濾,取濾渣備用; 2) 將濾渣用6~12倍重量的水回流提取2~3次,每次提取2~3h,過濾,收集濾液 備用; 3) 將濾液濃縮至60°C下相對密度為I. 1~1. 3的浸膏,加入乙醇沉淀,離心得沉淀; 4) 將沉淀依次用2~4倍重量的無水乙醇、丙酮分別洗滌,將洗滌后的沉淀用2~4倍 蒸餾水溶解,過截留分子量為6萬的中空纖維膜,收集濃縮液,然后將濃縮液過截留分子量 為10萬的中空纖維膜,收集透過液離心,過濾,取濾液備用; 5) 取濾液噴霧干燥,即為茯苓多糖。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的茯苓多糖的提取方法,其特征在于:步驟3)中,往浸膏中加 入90~95v%的乙醇至乙醇含量為80~85v%。
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種茯苓多糖的提取方法,包括以下步驟:1)將茯苓乙醇提取,取濾渣備用;2)將濾渣水提,收集濾液備用;3)將濾液濃縮浸膏,乙醇沉淀,離心得沉淀;4)將沉淀依次無水乙醇、丙酮分別洗滌,將洗滌后的沉淀用蒸餾水溶解,過截留分子量為6萬的中空纖維膜,收集濃縮液,然后將濃縮液過截留分子量為10萬的中空纖維膜,收集透過液離心,過濾,取濾液備用;5)取濾液噴霧干燥,即為茯苓多糖。本發(fā)明的茯苓多糖純度高,色澤潔白,且抗腫瘤活性強(qiáng)。
      【IPC分類】C08B37/00
      【公開號】CN105061627
      【申請?zhí)枴緾N201510542528
      【發(fā)明人】文繼承
      【申請人】桂林茗興生物科技有限公司
      【公開日】2015年11月18日
      【申請日】2015年8月31日
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