一種基于組織支架的三維視杯來源神經(jīng)樣細(xì)胞的鈉離子通道檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于干細(xì)胞組織工程領(lǐng)域及神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于組織支架的三維視杯來源神經(jīng)樣細(xì)胞的鈉離子通道檢測方法。
【背景技術(shù)】
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[0002]青光眼是一組威脅和損害視神經(jīng)及其視覺通路，最終導(dǎo)致視覺功能損害，主要與病理性眼壓升高有關(guān)的臨床征群或眼病。其視神經(jīng)病變的特征是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)的漸進(jìn)性喪失以及其軸突與大腦中樞連接的損害。目前臨床上降低眼內(nèi)壓的主要治療，雖可以減緩疾病進(jìn)展，但并不能完全阻止病情的進(jìn)一步發(fā)展，尤其是對于晚期青光眼的患者更是收效甚微。因此，有必要尋找一種新的治療策略，減緩或阻止進(jìn)行性的RGC損害。
[0003]現(xiàn)已有許多研究通過運用干細(xì)胞及組織工程學(xué)技術(shù)，對青光眼神經(jīng)保護(hù)和細(xì)胞替代兩方面進(jìn)行了積極的嘗試并取得了較大進(jìn)展。但干細(xì)胞移植中存在諸多復(fù)雜和關(guān)鍵的問題:如細(xì)胞生長部位難以精確控制；移植細(xì)胞不能完全生長分化且難以與宿主細(xì)胞有效整合，形成功能性突觸鏈接;移植入眼內(nèi)的細(xì)胞存活率較低等等。將干細(xì)胞和組織工程學(xué)有機結(jié)合，可增進(jìn)或改善視網(wǎng)膜受損組織修復(fù)的形態(tài)及功能為確保移植體系的質(zhì)量，有必要對接種于組織支架進(jìn)行體外培養(yǎng)分化的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)及功能的評估和檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0004]本發(fā)明的目的是提供一種基于組織支架的三維視杯來源神經(jīng)樣細(xì)胞的鈉離子通道檢測方法，利用該方法可以直接反映神經(jīng)支架上生長的神經(jīng)樣細(xì)胞鈉離子通道蛋白的表達(dá)情況，為后續(xù)功能電位的檢測奠定基礎(chǔ)并提供依據(jù)，可作為神經(jīng)支架功能評價的一項重要指標(biāo)。
[0005]本發(fā)明的基于組織支架的三維視杯來源神經(jīng)樣細(xì)胞的鈉離子通道檢測方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0006]將人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜的神經(jīng)纖維層消化為單細(xì)胞，以該單細(xì)胞作為種子細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基重懸后接入包被基質(zhì)膠Matrigel的聚乳酸-羥基乙酸聚合物支架上，于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含有神經(jīng)營養(yǎng)因子和維持濃度的視網(wǎng)膜分化營養(yǎng)液組成的培養(yǎng)基;對培養(yǎng)到一定時期的聚乳酸-羥基乙酸聚合物支架上的神經(jīng)樣細(xì)胞進(jìn)行鈉離子通道檢測，檢測其神經(jīng)基礎(chǔ)功能。
[0007]所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為:每ml含有bFGF 10ng、BDNF 20ng、CNTF 20ng、N2supplement lng、非必須氨基酸lng、肝素2yg，余量為DMEM/F12培養(yǎng)基，所述的DMEM/F12培養(yǎng)基是由DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基按照體積比1:1混合而成。
[0008]所述的培養(yǎng)是在37°C、5 % C02，飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0009]所述的將人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜的神經(jīng)纖維層消化為單細(xì)胞是將人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜的神經(jīng)纖維層放入D-Hanks液中，分離組織，離棄視網(wǎng)膜組織中色素沉著部分，保留金黃色的組織部分的神經(jīng)纖維層，將分離的神經(jīng)纖維層組織用PBS沖洗，吸除PBS后用accutase細(xì)胞消化液消化細(xì)胞團(tuán)成單細(xì)胞后加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基終止消化，混懸液離心去上清后，得到種子細(xì)胞。
[0010]所述的鈉離子通道檢測是將神經(jīng)樣細(xì)胞在組織膜片培養(yǎng)條件下，進(jìn)行鈉離子通道蛋白的免疫熒光鑒定。具體優(yōu)選是將培養(yǎng)到一定時期的聚乳酸-羥基乙酸聚合物支架上的神經(jīng)樣細(xì)胞，吸除其培養(yǎng)基，用PBS洗滌后，用固定液固定，再棄固定液，用PBS洗滌，然后加入PB液，打孔封閉，孵育一抗、二抗、然后DAPI染核，置于載玻片上，加入抗熒光猝滅劑，將蓋玻片蓋在猝滅劑上，活細(xì)胞顯微鏡下觀察細(xì)胞鈉離子通道染色。
[0011]本發(fā)明人團(tuán)隊前期已成功將人源性的iPSc細(xì)胞誘導(dǎo)分化為人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜(Xiufeng Zhong,et al.Generat1n of three-dimens1nal retinal tissue withfunct1nal photoreceptors from human iPSCs,Nat Commun.2014 Jun 10;5:4047)。本發(fā)明將hiPSC來源的三維視網(wǎng)膜組織中的神經(jīng)層細(xì)胞接種于PLGA組織膜片，構(gòu)建了一個人iPS源性的可降解神經(jīng)支架。通過前期實驗觀察發(fā)現(xiàn)，同一批神經(jīng)層細(xì)胞分別接種于PLGA膜片及普通蓋玻片上，其生長分化的形態(tài)并不完全相同。因此對該體系的評估，選擇直接對PLGA膜片上培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行鈉離子通道免疫熒光染色，更加真實的反映組織膜片上細(xì)胞的狀態(tài)，為進(jìn)一步對膜片上細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗檢測功能電位提供依據(jù)及基礎(chǔ)。
【附圖說明】
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[0012]圖1是本發(fā)明對PLGA膜片上細(xì)胞進(jìn)行了DAPI染色，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，可顯示細(xì)胞核的位置及形態(tài)；
[0013]圖2是本發(fā)明PLGA膜片上的細(xì)胞在誘導(dǎo)分化前經(jīng)GFP轉(zhuǎn)染，細(xì)胞呈綠色熒光，可顯示細(xì)胞整體形態(tài)；
[0014]圖3是本發(fā)明對PLGA膜片上的細(xì)胞進(jìn)行了Ant1-Nav1.1抗體染色，鈉離子通道蛋白呈紅色熒光，可顯示細(xì)胞鈉離子通道蛋白是否表達(dá)，表達(dá)位置等；
[0015]圖4是本發(fā)明將PLGA膜片上同一視野下細(xì)胞的免疫熒光的不同彩色通道圖像進(jìn)行合成，即將同一視野下細(xì)胞核的藍(lán)色熒光圖像、細(xì)胞的綠色熒光圖像及鈉離子通道蛋白的紅色熒光圖像合并，在同一副圖中顯示鈉離子通道蛋白的表達(dá)情況。
【具體實施方式】
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[0016]以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0017]實施例1:
[0018]一、人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜分離消化:
[0019]1、采用機械分離的辦法，將培養(yǎng)50-60天的人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜(具體制備方法參考文南犬:Xiufeng Zhong,et al.Generat1n of three-dimens1nal retinal tissuewith funct1nal photoreceptors from human iPSCs,Nat Commun.2014Jun 10；5:4047)的神經(jīng)纖維層放入D-Hanks液中，于50倍正置顯微鏡下使用0.45mm針頭分離組織，離棄視網(wǎng)膜組織中色素沉著部分(色素層)，保留金黃色的組織部分(神經(jīng)纖維層)；將分離的神經(jīng)纖維層組織使用移液管轉(zhuǎn)移至3.5cm培養(yǎng)皿，使用PBS沖洗10分鐘；吸除PBS后用accutase細(xì)胞消化液消化細(xì)胞，置于37°C培養(yǎng)箱中30min;過程后期可將細(xì)胞吸入離心管吹打，在10倍正置顯微鏡下見細(xì)胞團(tuán)被消化成單細(xì)胞后加入2ml誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基終止消化。將混懸液離心(1000轉(zhuǎn)/5min)后吸出上清，得到種子細(xì)