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      寡糖的發(fā)酵生產(chǎn)的制作方法_4

      文檔序號(hào):9916106閱讀:來源:國知局
      藻糖基轉(zhuǎn)移酶的遺傳修飾的細(xì)胞,在含有乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本發(fā)明的方法中使用的 遺傳修飾的細(xì)胞能夠?qū)⒒罨奶呛饲伤岬膸r藻糖基殘基轉(zhuǎn)移至內(nèi)化的乳糖。如果其是重組 的,通過已知技術(shù)將造成上述功能的基因或其相當(dāng)?shù)腄NA序列,使用表達(dá)載體引入所述細(xì)胞 中。異源核酸序列的來源可W是任何動(dòng)物(包括人)或植物,例如人即Τ1或即Τ2基因,來自脆 弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)的wcfW基因,來自幽口螺桿菌的futC基因或來自大腸桿 菌的wbsj基因,其全部編碼α 1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。
      [0092] 當(dāng)進(jìn)行本發(fā)明的第Ξ個(gè)方面時(shí),優(yōu)選發(fā)生巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的巖藻糖基化反 應(yīng),其中活化的糖核巧酸,GDP-Fuc,充當(dāng)供體。遺傳修飾的細(xì)胞能夠通過從頭合成途徑產(chǎn)生 GDP-化C。就運(yùn)點(diǎn)而言,GDP-Fuc在參與GDP-化C的從頭生物合成途徑的酶的作用下,W逐步 的反應(yīng)順序,從簡單碳源如甘油、果糖或葡萄糖開始,由細(xì)胞制備(對(duì)于單糖代謝的綜述,參 見例如H.H.Freeze和A.D.E化ein:第4章 :Glycosylation precursors,于:Essentials of Glycobiology,第2版(編輯A.Varki等人),Cold Spring Harbour LaboratoiT Press (2009)。參與GDP-Fuc的從頭生物合成途徑的酶可W天然存在于細(xì)胞中或通過基因技術(shù)或 重組DNA技術(shù)的方式引入細(xì)胞,它們?nèi)渴羌夹g(shù)人員的普通知識(shí)的部分。
      [0093] 應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是,與體外版本的轉(zhuǎn)移巖藻糖基化相比,通過遺傳修飾的細(xì)胞從頭合 成GDP-Fuc是有利的,因?yàn)槠浔苊馐褂梅浅0嘿F的外源添加的GDP-Fuc,而是,該供體由細(xì)胞 原位形成,并且憐脂酷基核巧離去基團(tuán)在細(xì)胞中循環(huán)。
      [0094] 優(yōu)選地,在進(jìn)行本發(fā)明第Ξ個(gè)方面時(shí),遺傳修飾的細(xì)胞在碳基底物如甘油,葡萄 糖,糖原,果糖,麥芽糖,淀粉,纖維素,果膠,幾下質(zhì),薦糖等的存在下培養(yǎng),W內(nèi)化加入細(xì)胞 中的乳糖接受者,在所述細(xì)胞中發(fā)生巖藻糖基化。優(yōu)選地,在碳源和能源,如甘油和/或葡萄 糖和/或果糖,優(yōu)選甘油上培養(yǎng)細(xì)胞。
      [00%]本發(fā)明第Ξ方面的方法還包括初始將作為接受者的外源乳糖從培養(yǎng)基轉(zhuǎn)運(yùn)到遺 傳修飾的細(xì)胞中,在那里,其可W被巖藻糖基化W產(chǎn)生2'-FL??沙R?guī)方式將乳糖外源 加入培養(yǎng)基中,其可W隨后從培養(yǎng)基轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。當(dāng)然,乳糖的內(nèi)化不應(yīng)該影響基本和重 要功能或破壞細(xì)胞的完整性。在一個(gè)實(shí)施方案中,內(nèi)化可W通過被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制發(fā)生,在此期 間乳糖被動(dòng)擴(kuò)散跨過細(xì)胞的質(zhì)膜。通過關(guān)于要內(nèi)化的乳糖的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)空間的濃度差 異引導(dǎo)流動(dòng),所述乳糖應(yīng)該是從較高濃度的地方通過至較低濃度的區(qū)域,趨于平衡。在其他 實(shí)施方案中,可W借助主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制將乳糖內(nèi)化入細(xì)胞,在此期間,在細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或通 透酶的影響下,乳糖擴(kuò)散跨過細(xì)胞的質(zhì)膜。乳糖通透酶化acY)對(duì)乳糖具有特異性。優(yōu)選地, 外源乳糖的內(nèi)化通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制發(fā)生。
      [0096] 本發(fā)明第Ξ方面的方法特征在于,使用的遺傳修飾的細(xì)胞缺少可能降解乳糖,2'- FL,和在細(xì)胞中制備2'-化所需的代謝中間體的酶活性。就運(yùn)一點(diǎn),將乳糖水解為半乳糖和 葡萄糖的由LacZ基因編碼的β-半乳糖巧酶被缺失(LacZ^因型)。備選地,1^曰〇2毒因型的遺 傳修飾的細(xì)胞還可W含有外源LacZ基因編碼的,表達(dá)低的但可檢測(cè)水平的β-半乳糖巧酶活 性的功能性β-半乳糖巧酶,從而在發(fā)酵的最后去除任選的殘留的乳糖(參見W02012/ 112777)。
      [0097] 優(yōu)選地,如上文公開的大腸桿菌,優(yōu)選大腸桿菌LacZT+株,其具有重組糖基轉(zhuǎn)移酶 (其是α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,優(yōu)選由來自幽口螺旋桿菌的化tC基因編碼)從而W高產(chǎn)量生 產(chǎn)2 化的遺傳修飾,W W下方式培養(yǎng):
      [0098] (a)通過碳基底物保證的第一階段的指數(shù)細(xì)胞生長,和
      [0099] (b)由與連續(xù)加入的乳糖一起連續(xù)加入的碳源和能源限制的第二階段的細(xì)胞生 長。
      [0100] 此外優(yōu)選的是在允許具有高細(xì)胞密度的培養(yǎng)物的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)大腸桿菌。此 外優(yōu)選地,還向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑,優(yōu)選異丙基β-D-硫代半乳糖巧(IPTG)。
      [0101 ]優(yōu)選,使用大腸桿菌菌株,特別是大腸桿菌LacZT+株,其具有α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移 酶,優(yōu)選α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,所述巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶由幽口螺旋桿菌的化tC基因編碼。為 了 W高產(chǎn)量制備2'-FL,所述方法優(yōu)選包括:a)基于1升的初始培養(yǎng)體積,向培養(yǎng)基中提供, 碳源和能源和至少50,優(yōu)選至少75,更優(yōu)選至少100,甚至更優(yōu)選至少125克的乳糖。所述方 法還優(yōu)選包括:b)優(yōu)選W連續(xù)的方式向培養(yǎng)基中提供乳糖達(dá)多于4天,優(yōu)選多至7天。特別優(yōu) 選的是,所述方法包含步驟a)和b)二者。還特別優(yōu)選的是,培養(yǎng)基的最終體積不大于向培養(yǎng) 基中提供乳糖W及碳源和能源,優(yōu)選甘油之前的培養(yǎng)基體積的Ξ倍,更優(yōu)選不大于其兩倍, 特別是小于其兩倍。
      [0102] 在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的2'-化優(yōu)選在每升的培養(yǎng)基中包含至少65克,更優(yōu)選至少80克, 特別是多至90克。
      [0103] 優(yōu)選地,如上文公開的具有重組α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(優(yōu)選由來自幽口螺旋桿菌 的化tC基因編碼)從而W高產(chǎn)量生產(chǎn)2'-化的遺傳修飾的大腸桿菌LacZ-Y+株,下方式培 養(yǎng):
      [0104] (a)通過碳基底物保證的第一階段的指數(shù)細(xì)胞生長,和
      [0105] (b)由與連續(xù)加入的乳糖一起連續(xù)加入的碳源和能源限制的第二階段的細(xì)胞生 長。
      [0106] 此外優(yōu)選的是在允許具有高細(xì)胞密度的培養(yǎng)物的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)大腸桿菌。此 外優(yōu)選地,還向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑,優(yōu)選異丙基β-D-硫代半乳糖巧(IPTG)。
      [0107] 優(yōu)選在30至35 Γ的溫度優(yōu)選連續(xù)培養(yǎng)大腸桿菌,并且優(yōu)選伴有連續(xù)攬拌,連續(xù)通 氣和連續(xù)進(jìn)料碳源和能源W及乳糖。
      [0108] 根據(jù)另一個(gè)W高產(chǎn)量制備2 '斗L的方式,大腸桿菌菌株,優(yōu)選大腸桿菌LacZT+株, 其具有由來自幽口螺旋桿菌的化tC基因編碼的α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,優(yōu)選α1,2-巖藻糖基 轉(zhuǎn)移酶,用于發(fā)酵,所述發(fā)酵包括:
      [0109] -優(yōu)選W連續(xù)的方式,提供碳源和能源,優(yōu)選甘油,W及乳糖,達(dá)多于4天,優(yōu)選多至 7天。
      [0110] 運(yùn)樣在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的2'斗L優(yōu)選每升的培養(yǎng)基包含至少65克,更優(yōu)選至少80克, 特別是多至90克。
      [0111] 優(yōu)選地,如上文公開的具有α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(優(yōu)選由來自幽口螺旋桿菌的 化tC基因編碼)從而W高產(chǎn)量生產(chǎn)2'-FL的遺傳修飾的大腸桿菌LacZ-Y+株,下方式培 養(yǎng):
      [0112] (a)通過碳基底物保證的第一階段的指數(shù)細(xì)胞生長,和
      [0113] (b)由與連續(xù)加入的乳糖一起連續(xù)加入的碳源和能源限制的第二階段的細(xì)胞生 長。
      [0114] 此外優(yōu)選的是在允許具有高細(xì)胞密度的培養(yǎng)物的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)大腸桿菌。此 外優(yōu)選地,還向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑,優(yōu)選異丙基β-D-硫代半乳糖巧(IPTG)。
      [0115] 在30至35°C的溫度,將大腸桿菌培養(yǎng)達(dá)至少4天,特別是多至7天,但不多于約9-10 天,并且優(yōu)選伴有連續(xù)攬拌,連續(xù)通氣和連續(xù)進(jìn)料碳源和能源W及乳糖。
      [0116] 根據(jù)更優(yōu)選的W高產(chǎn)量制備2'-化的方式,大腸桿菌菌株,優(yōu)選大腸桿菌LacZT+ 株,其具有由來自幽口螺旋桿菌的化tC基因編碼的α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,優(yōu)選α1,2-巖藻 糖基轉(zhuǎn)移酶,用于發(fā)酵,所述發(fā)酵包括:
      [0117] -優(yōu)選W連續(xù)的方式,提供碳源和能源,優(yōu)選甘油,和基于1升的初始培養(yǎng)體積的至 少50,優(yōu)選至少75,更優(yōu)選至少100克的乳糖,優(yōu)選達(dá)多于4天,更優(yōu)選多至7天,優(yōu)選W致最 終的培養(yǎng)基體積不大于培養(yǎng)前的培養(yǎng)基體積的Ξ倍,更優(yōu)選不大于其兩倍,甚至更優(yōu)選小 于其兩倍。
      [0118] 運(yùn)樣在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的2'斗L優(yōu)選每升的培養(yǎng)基包含至少65克,更優(yōu)選至少80克, 特別是多至90克。
      [0119] 優(yōu)選地,如上文公開的具有α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(優(yōu)選由來自幽口螺旋桿菌的 化tC基因編碼)從而W高產(chǎn)量生產(chǎn)2'-FL的遺傳修飾的大腸桿菌LacZ-Y+株,下方式培 養(yǎng):
      [0120] (a)通過碳基底物保證的第一階段的指數(shù)細(xì)胞生長,和
      [0121] (b)由與連續(xù)加入的乳糖一起連續(xù)加入的碳源和能源限制的第二階段的細(xì)胞生 長。
      [0122] 此外優(yōu)選的是在允許具有高細(xì)胞密度的培養(yǎng)物的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)大腸桿菌。此 外優(yōu)選地,還向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑,優(yōu)選異丙基β-D-硫代半乳糖巧(IPTG)。
      [0123] 優(yōu)選在30至35°C的溫度,將大腸桿菌培養(yǎng)達(dá)至少4天,特別是多至7天,但不多于約 9-10天,并且優(yōu)選伴有連續(xù)攬拌,連續(xù)通氣和連續(xù)進(jìn)料碳源和能源W及乳糖。
      [0124] 在培養(yǎng)大腸桿菌的最后,不論按照何種途徑,2'-化可能作為產(chǎn)物積累在細(xì)胞內(nèi)和 細(xì)胞外基質(zhì)中。所述產(chǎn)物可能W被動(dòng)方式被轉(zhuǎn)運(yùn)到上清中,即,其可W向外部擴(kuò)散跨過細(xì)胞 膜。轉(zhuǎn)運(yùn)可W由一種或多種糖流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白促進(jìn),所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白即促進(jìn)來自細(xì)胞的糖衍生 物外流至上清中的蛋白。糖外流轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可W外源或內(nèi)源存在,并且可W在發(fā)酵條件下過 表達(dá),從而增強(qiáng)產(chǎn)生的2'斗L的輸出。對(duì)要分泌的產(chǎn)物的糖部分的特異性可W通過已知的重 組DNA技術(shù)的方式突變來改變。優(yōu)選地,2 化在細(xì)胞外基質(zhì)中積累。
      [0125] 可W隨后W常規(guī)方式從水性培養(yǎng)基(在其中制備混合物)中分離2'斗L產(chǎn)物。
      [0126] 從培養(yǎng)基中分離2'-化的第一步驟優(yōu)選包括使培養(yǎng)基澄清,W去除懸浮的顆粒和 污染物,特別是細(xì)胞,細(xì)胞成分,不可溶的代謝物和培養(yǎng)遺傳修飾的細(xì)胞產(chǎn)生的碎片。在該 步驟中,可常規(guī)方式使含有2'斗L的水性培養(yǎng)基澄清。優(yōu)選地,通過離屯、和/或過濾使培 養(yǎng)基澄清。
      [0127] 從培養(yǎng)基中分離2'-化產(chǎn)物的第二步驟優(yōu)選包括,優(yōu)選在將其澄清之后,從水性培 養(yǎng)基中基本上去除所有蛋白,W及膚,氨基酸,RNA和DNA和可能干擾后續(xù)分離步驟的任何內(nèi) 毒素和糖脂。在該步驟中,可常規(guī)方式從培養(yǎng)基中去除蛋白和相關(guān)雜質(zhì)。優(yōu)選通過超 濾,切向流高效過濾,切向流超濾,親和色譜,離子交換色譜,疏水相互作用色譜和/或凝膠 過濾(即,尺寸排
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