阻色譜），特別是通過色譜，更特別是通過離子交換色譜或疏水相互作用色 譜從培養(yǎng)基去除蛋白和相關(guān)雜質(zhì)。除了尺寸排阻色譜，通過色譜介質(zhì)或選擇的膜保留蛋白 和相關(guān)雜質(zhì)，而y -化留在水性培養(yǎng)基中。
[0128] 如果需要，在將蛋白和相關(guān)雜質(zhì)從培養(yǎng)基去除后，可W隨后將水性培養(yǎng)基中的2'- 化與任何碳水化合物型污染物分離。運可W通過將培養(yǎng)基進行色譜分離來適當進行。該分 離可W在填充有常規(guī)酸性陽離子交換樹脂的色譜分離柱中進行。酸性陽離子交換樹脂可W 是單價的或雙價的陽離子形式并且優(yōu)選為H%K%Na+，Mg2+或Ca2+形式，特別是Ca2+。色譜分離 可常規(guī)方式在2至9的溶液pH進行，W將2'斗L與碳水化合物型雜質(zhì)分開。色譜分離中使 用的洗脫劑優(yōu)選為水，特別是除鹽的水，但也可W使用鹽水溶液。也可W使用醇，如乙醇，和 水醇混合物。分離的2'-化可W用作嬰兒配方奶粉中的補充成分和用于治療新生嬰兒中的 多種疾病。 實施例
[0129] W高產(chǎn)量產(chǎn)生2'-化和DFL
[0130] 細菌菌株和接種物制備：
[0131 ]根據(jù)W0 01/04341 和Droui 1 lard等人Angew. ^em. Iht. Ed. Eng. 45，1778(2006)，通 過缺失可能降解乳糖，寡糖產(chǎn)物和它們的代謝中間體的基因，和其他的lacZJacA和wcaj基 因，維持參與GDP-巖藻糖生物合成的manB，manC，gmd和wcaG基因，并且插入幽口螺旋桿菌 化.pylori)化tC基因用于α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，作為僅有的糖基轉(zhuǎn)移酶，從大腸桿菌K株 構(gòu)建改造的大腸桿菌。
[0132] -般發(fā)酵步驟：
[0133] 在120°C將葡萄糖，甘油，異丙基硫代-β-D-化喃半乳糖巧(IPTG)和乳糖分別滅菌。
[0134] 在含有1.51的礦質(zhì)培養(yǎng)基的31發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)(Samain等人J.Biotechnol.72， 33( 1999))。將溫度保持在33 °C并且用28 %畑4〇聞尋抑調(diào)至6.8。接種物(基礎(chǔ)培養(yǎng)基體積的 1%)存在于LB培養(yǎng)基和生產(chǎn)菌株的培養(yǎng)物中。指數(shù)生長階段從接種開始，并且直到最初加 入到培養(yǎng)基中的碳源（葡萄糖17.5g/l)耗盡終止。在指數(shù)期的最后加入誘導(dǎo)劑（異丙基硫 代-β-D-化喃半乳糖巧，IPTG，l-2ml的50mg/ml溶液）。隨后使用11的含有溶解于水中的500g 甘油和160-200g乳糖的進料溶液獲得分批補料(fed-batch)，將其在4-7天期間加至培養(yǎng)物 中。在發(fā)酵的最后，產(chǎn)生在68-114旨/1變化的2/-化濃度，并且2'化+0化混合物中在80:20至 88:12之間變化的y-化:DFL比例。在該混合物中巖藻糖基化的半乳糖巧果糖化U(2/-0-巖 藻糖基-半乳糖巧果糖)不大于1%，并且在該混合物中FFL(Ric(al-2)Ric(al-2)Gal(i31-4) Glc)也不多于1 %。
[0135] 純化；
[0136] 在發(fā)酵的最后，將培養(yǎng)物在20-25°C在4500-6000巧m離屯、25-40min。使用H+型樹脂 將上清保持并酸化至pH 3。運導(dǎo)致蛋白沉淀。將樹脂通過傾析(decan化tion)回收，并且將 沉淀的蛋白通過在4500-6000rpm在20-25 °C離屯、25-40min來去除。將上清通過H+型離子交 換樹脂柱并且立即通過游離堿型陰離子交換樹脂柱來中和。將化合物用水或乙醇水溶液洗 脫。收集含有產(chǎn)物的級分，濃縮并冷凍干燥/結(jié)晶/沉淀。
[0137] 化合物的鑒定：
[0138] 與W0 2010/115935中公開的那些十分一致，通過冊LC，使用參考化合物和其1h和 1化NMR譜鑒定2'-FL。
[0139] 通過LC-MS和應(yīng)R鑒定DFL?；跇藴室痪S（1h，i3C)和二維同源相關(guān)和異源相關(guān) (曲QC0SY，2D-T0CSY，2DN0ESY，1護1化 gHSQCAD，1h-13C gHMBCAD)測量的詳細分析分配其 1h 和1化共振。在實驗誤差內(nèi)，譜數(shù)據(jù)(參見表1)與文獻（Ishiz址a等人J.化rbohy化.化em. 18， 523( 1999))中報道的那些一致。
[0140]
[0141] 表1.對于DFL在〇2〇中的iH和1?共振分配，化。C，在400MHz (α/β比是9/11)
[0142] 通過LC-MS和NMR鑒定化U(2/ -0-巖藻糖基-半乳糖巧果糖）。通過使用標準一維和 二維 1H-1h 和 1護1化關(guān)聯(lián)實驗（gCOSY，2DT0CSY，1H-13C-巧 SQCAD，iH-UC-gHMBCAD)進行共振分 配。在25°C在DMS0中的平衡同分異構(gòu)比為β-巧喃糖/β-化喃糖/α-巧喃糖= 55/40/5。
[0143]
[0144] 表2.對2^-0-巖藻糖基-半乳糖巧果糖在DMSO中的iH和1化共振分配，25 °C，在 400MHz (β-巧喃糖異構(gòu)體）
[0145] 同樣，通過LC-MS和NMR，使用標準的一維和二維iH-iH和1護1化關(guān)聯(lián)實驗(gC0SY，iH -"C-gHSQCAD)鑒定 FFL(化 c(al-2)Fuc(al-2)Gal(m-4)Glc)。圖 1和2分別顯示其 iH 和 1化 NMR 譜。
【主權(quán)項】
1. 獲得2' -FL和DFL的混合物的方法，其包括以下步驟:在含有乳糖的水性培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)具有編碼單個糖基轉(zhuǎn)移酶的重組基因的遺傳修飾的細胞，優(yōu)選大腸桿菌(E.coli)細胞， 更優(yōu)選LacZ飛+大腸桿菌細胞，所述糖基轉(zhuǎn)移酶是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移 酶，其能夠修飾乳糖或在從乳糖生物合成2'-FL或DFL的途徑中的中間體，并且其對于從乳 糖合成2' -FL或DFL是必需的;所述方法特征在于： -優(yōu)選以連續(xù)的方式，向培養(yǎng)基中加入至少50,優(yōu)選至少75,更優(yōu)選至少100,甚至更優(yōu) 選至少125克的乳糖/1升的初始培養(yǎng)體積，以致培養(yǎng)基的最終體積不大于培養(yǎng)前的培養(yǎng)基 的體積的三倍，優(yōu)選不大于兩倍，更優(yōu)選小于兩倍;或 Η尤選以連續(xù)的方式，向培養(yǎng)基中加入乳糖多于4天，優(yōu)選多至7天;或 -優(yōu)選以連續(xù)的方式，向培養(yǎng)基中加入至少50,優(yōu)選至少75,更優(yōu)選至少100,甚至更優(yōu) 選至少125克的乳糖/1升的初始培養(yǎng)體積，多于4天，優(yōu)選多至7天，以致培養(yǎng)基的最終體積 不大于培養(yǎng)前的培養(yǎng)基的體積的三倍，優(yōu)選不大于兩倍，更優(yōu)選小于兩倍。2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中還將碳源和能源，優(yōu)選甘油，優(yōu)選連續(xù)地，優(yōu)選與乳糖一 起加入培養(yǎng)基中。3. 權(quán)利要求1或2所述的方法，其中在第二階段將乳糖加入培養(yǎng)基中之前，通過將碳基 底物，優(yōu)選葡萄糖，加入培養(yǎng)基中以提供第一階段的指數(shù)細胞生長。4. 權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中，在培養(yǎng)步驟期間，所述遺傳修飾的細胞將 2' -FL和DFL的混合物分泌到培養(yǎng)基的細胞外空間中。5. 權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中每升的所述培養(yǎng)基獲得至少75,優(yōu)選至少 1 〇〇，特別是至少115克的Y -FL和DFL的混合物。6. 權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述2' -FL和DFL的混合物還含有FLU(2'-〇-巖藻糖基-半乳糖苷果糖)或 FFL(Fuc(al-2)Fuc(al-2)Gal(m_4)Glc)，或 FLU 和 FFL 二者。7. 獲得巖藻糖，特別是L-巖藻糖的方法，其包括將以下各項進行用酸起始或由巖藻糖 苷酶介導(dǎo)的水解的步驟： -2' -FL和/或DFL，優(yōu)選至少DFL，從包含2' -FL和DFL的混合物分離，所述混合物可通過 權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法獲得并且其中DFL的重量包括2Y-FL的重量的優(yōu)選至少 2.5%，更優(yōu)選至少5%，甚至更優(yōu)選至少10%，特別是至少20%。8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述水解用強酸，優(yōu)選硫酸進行。9. 從乳糖獲得2' -FL的方法，其包括以下步驟:在水性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，具有編碼巖藻糖 基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的重組基因的遺傳修飾的細胞，優(yōu)選大腸桿菌細胞，更 優(yōu)選LacZ1 +大腸桿菌細胞，所述巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，能夠修飾乳糖 或在從乳糖生物合成2Z-FL的途徑中的中間體，并且對于從乳糖合成2Z-FL是必需的；所述 方法特征在于： -優(yōu)選以連續(xù)的方式，向培養(yǎng)基中加入至少50,優(yōu)選至少75,更優(yōu)選至少100,甚至更優(yōu) 選至少125克的乳糖/1升的初始培養(yǎng)體積，以致培養(yǎng)基的最終體積不大于培養(yǎng)前的培養(yǎng)基 體積的三倍，優(yōu)選不大于兩倍，更優(yōu)選小于兩倍;或 Η尤選以連續(xù)的方式，將乳糖加入培養(yǎng)基中多于4天，優(yōu)選多至7天;或 -優(yōu)選以連續(xù)的方式，向培養(yǎng)基中加入至少50,優(yōu)選至少75,更優(yōu)選至少100,甚至更優(yōu) 選至少125克的乳糖/1升的初始培養(yǎng)體積，多于4天，優(yōu)選多至7天，以致培養(yǎng)基的最終體積 不大于培養(yǎng)前的培養(yǎng)基體積的三倍，優(yōu)選不大于兩倍，更優(yōu)選小于兩倍。10. 權(quán)利要求9所述的方法，其中還將碳源和能源，優(yōu)選甘油，優(yōu)選連續(xù)地，優(yōu)選與乳糖 一起加入培養(yǎng)基中。11. 權(quán)利要求9或10所述的方法，其中在第二階段將乳糖加入培養(yǎng)基中之前，通過將碳 基底物，優(yōu)選葡萄糖，加入培養(yǎng)基中以提供第一階段的指數(shù)細胞生長。12. 權(quán)利要求9至11中任一項所述的方法，其中在培養(yǎng)步驟期間，所述遺傳修飾的細胞 將2' -FL的混合物分泌到培養(yǎng)基的細胞外空間中。13. 權(quán)利要求9至12中任一項所述的方法，其中每升的培養(yǎng)基獲得至少65克，優(yōu)選至少 80克，特別是至少90克的2Y-FL。14. 混合物，其包含2Y-FL和 -DFL+FLU或 -DFL+FFL或 -DFL+FLU+FFL〇 15. FFL。
【專利摘要】本申請公開了通過利用乳糖培養(yǎng)具有編碼單個巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的重組基因的遺傳修飾的細胞，以高產(chǎn)量制備2′-FL和DFL的混合物的方法。可以將得到的2′-FL和DFL的混合物進行用酸起始的或由巖藻糖苷酶介導(dǎo)的水解，從而以高產(chǎn)量產(chǎn)生巖藻糖。
【IPC分類】C12P19/44, C12P19/18, C12P1/04
【公開號】CN105683387
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】久洛·戴卡尼, 波利娜·佩爾蒂埃-潘, 多勞·莫爾納-加博爾, 馬庫斯·赫德羅斯
【申請人】格禮卡姆股份公司
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年9月5日