胞可W進(jìn)行至少另外的化學(xué)轉(zhuǎn) 化，或者由于編碼野生型細(xì)胞中不存在的酶的表達(dá)的缺失、添加或改變的DNA，所述遺傳修 飾的細(xì)胞不能進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化。所述遺傳修飾的細(xì)胞可W通過公知的常規(guī)遺傳工程技術(shù)產(chǎn) 生。遺傳修飾的細(xì)胞可W是細(xì)菌或酵母，但優(yōu)選為細(xì)菌。優(yōu)選的細(xì)菌包括大腸桿菌 化scherichia coli)，芽抱桿菌屬物種（Bacillus spp.)(例如枯草芽胞桿菌（Bacillus subti 1 i S ))，幽口彎曲桿菌（Campylobacter pylori )，幽口 螺桿菌（Hel icobacter pylori)，根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)，水生嗜熱鏈球菌（Thermophilus aquaticus)，莖瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans)，豆科根瘤菌（Rhizobium leguminosarum)，淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae)，腦膜炎奈氏球菌（Neisseria meningitis)，乳桿菌屬物種(Xactobacillus spp.)，乳酸菌屬物種(Xactococcus spp.)，腸球菌屬物種巧nterococcus spp.)，雙歧桿菌 屬物種（Bifidobacterium spp.)，芽抱乳桿菌屬物種（Sporolactobacillus spp.)， Micromomospora spp.，微球菌屬物種（Micrococcus spp.)，紅球菌屬物種（Rhodococcus spp.)，假單胞菌(Pseudomonas)，特別是大腸桿菌。
[0038] 在進(jìn)行本發(fā)明第一方面的方法從而W高產(chǎn)量制備y斗L和D化時(shí)，將具有單個(gè)能夠 修飾外源乳糖接受者或從乳糖生物合成2化和D化的途徑中的必需中間體的重組糖基轉(zhuǎn) 移酶(其是1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選為α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)的遺傳修飾的細(xì)胞，在含有 乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用于本發(fā)明的方法的遺傳修飾的細(xì)胞能夠?qū)⒒罨奶呛饲伤岬膸r藻 糖基殘基轉(zhuǎn)移至內(nèi)化的乳糖，并且，在Di^L生產(chǎn)的情況下，還能夠?qū)⒌诙r藻糖基殘基轉(zhuǎn)移 至之前形成巖藻糖基乳糖，優(yōu)選為2'-FL。如果其是重組的，造成上述功能的基因或其相當(dāng) 的DNA序列通過已知技術(shù)，使用表達(dá)載體引入所述細(xì)胞中。異源核酸序列的來源可W是任何 動(dòng)物（包括人）或植物，例如人即T1或即T2基因，來自脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis) 的wcfW基因，來自幽口螺桿菌的化tC基因或來自大腸桿菌的wbsj基因，其全部編碼α1，2-巖 藻糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0039] 當(dāng)進(jìn)行該方法時(shí)，優(yōu)選發(fā)生巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的巖藻糖基化反應(yīng)，其中活化的 糖核巧酸，GDP-Fuc，充當(dāng)供體。遺傳修飾的細(xì)胞能夠通過從頭合成途徑產(chǎn)生GDP-化C。就運(yùn) 點(diǎn)而言，GDP-Fuc在參與GDP-Fuc的從頭生物合成途徑的酶的作用下，W逐步的反應(yīng)順序，從 簡單碳源如甘油、果糖或葡萄糖開始，由細(xì)胞制備（對于單糖代謝的綜述，參見例如 H.H.Freeze和A.D.Elbein:第4章 ：Glycosylation precursors，于：Essentials of Glycobiology，第2版（編輯A.Varki等人），Cold Spring Harbour LaboratoiT Press (2009)。參與GDP-Fuc的從頭生物合成途徑的酶可W天然存在于細(xì)胞中或通過基因技術(shù)或 重組DNA技術(shù)的方式引入細(xì)胞，它們?nèi)渴羌夹g(shù)人員的普通知識(shí)的部分。
[0040] 應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，與體外版本的轉(zhuǎn)移巖藻糖基化相比，通過遺傳修飾的細(xì)胞從頭合 成GDP-Fuc是有利的，因?yàn)槠浔苊馐褂梅浅０嘿F的外源添加的GDP-Fuc，而是，該供體由細(xì)胞 原位形成，并且憐脂酷基核巧離去基團(tuán)在細(xì)胞中循環(huán)。
[0041 ]優(yōu)選地，在進(jìn)行本發(fā)明第一方面的方法時(shí)，遺傳修飾的細(xì)胞在碳基底物如甘油，葡 萄糖，糖原，果糖，麥芽糖，淀粉，纖維素，果膠，幾下質(zhì)，薦糖等的存在下培養(yǎng)，W內(nèi)化加入細(xì) 胞中的乳糖接受者，在所述細(xì)胞中發(fā)生巖藻糖基化。優(yōu)選地，利用甘油和/或葡萄糖和/或果 糖，優(yōu)選甘油培養(yǎng)細(xì)胞。
[0042]本發(fā)明第一方面的方法還包括初始將作為接受者的外源乳糖從培養(yǎng)基轉(zhuǎn)運(yùn)到遺 傳修飾的細(xì)胞中，在那里，其可W被巖藻糖基化W產(chǎn)生2'-化和/或DFL?？沙Ｒ?guī)方式將 乳糖外源加入培養(yǎng)基中，其可W隨后從培養(yǎng)基轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。當(dāng)然，乳糖的內(nèi)化不應(yīng)該影響 基本和重要功能或破壞細(xì)胞的完整性。在一個(gè)實(shí)施方案中，內(nèi)化可W通過被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制發(fā) 生，在此期間乳糖被動(dòng)擴(kuò)散跨過細(xì)胞的質(zhì)膜。通過關(guān)于要內(nèi)化的乳糖的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)空 間的濃度差異引導(dǎo)流動(dòng)，所述乳糖應(yīng)該是從較高濃度的地方通過至較低濃度的區(qū)域，趨于 平衡。在其他實(shí)施方案中，可W借助主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的將乳糖內(nèi)化入細(xì)胞，在此期間，在細(xì)胞 的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或通透酶的影響下，乳糖擴(kuò)散跨過細(xì)胞的質(zhì)膜。乳糖通透酶化acY)對乳糖具有 特異性。優(yōu)選地，外源乳糖的內(nèi)化通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制發(fā)生。
[0043] 第一方面的方法特征在于，使用的遺傳修飾的細(xì)胞缺少可能降解乳糖，2/-化， WL，和在細(xì)胞中制備2 ' -FL和WL所需的代謝中間體的酶活性。就運(yùn)一點(diǎn)，將乳糖水解為半 乳糖和葡萄糖的LacZ基因編碼的β-半乳糖巧酶被缺失(LacZ^因型）。備選地，LacZ^因型 的遺傳修飾的細(xì)胞還可W含有外源LacZ基因編碼的，表達(dá)低的但可檢測水平的β-半乳糖巧 酶活性的功能性β-半乳糖巧酶，從而在發(fā)酵的最后去除任選的殘留的乳糖(參見W0 2012/ 112777)。
[0044] 優(yōu)選使用大腸桿菌菌株，特別是大腸桿菌LacZT+株，其僅具有一種重組糖基轉(zhuǎn)移 酶，其是α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選為由來自幽口螺桿菌的化tC基因編碼的α1,2-巖藻糖 基轉(zhuǎn)移酶。為了 W高產(chǎn)量制備2'-化和D化的混合物，所述方法優(yōu)選包括:a)基于1升的初始 培養(yǎng)體積，向培養(yǎng)基中提供碳源和能源W及至少50,優(yōu)選至少75,更優(yōu)選至少100,甚至更優(yōu) 選至少125克的乳糖。所述方法還優(yōu)選包括:b)優(yōu)選W連續(xù)的方式，向培養(yǎng)基中提供乳糖達(dá) 多于4天，優(yōu)選多至7天。特別優(yōu)選的是，所述方法包括步驟a)和b)二者。還特別優(yōu)選的是，培 養(yǎng)基的最終體積不大于向培養(yǎng)基中提供乳糖W及碳源和能源，優(yōu)選甘油之前的培養(yǎng)基體積 的Ξ倍，更優(yōu)選不大于其兩倍，特別是小于其兩倍。
[0045] 在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的任選地含有化U(2/-0-巖藻糖基-半乳糖巧果糖)和任選地含有 F化(化c(al-2)Fuc(al-2)Gal(m-4)Glc)的2'-FL+D化混合物，優(yōu)選每升的培養(yǎng)基中包含至 少75克，更優(yōu)選至少100克，特別是多至115克。
[0046] 優(yōu)選地，如上文公開的僅具有一種重組糖基轉(zhuǎn)移酶(其是α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶， 優(yōu)選由來自幽口螺旋桿菌的化tC基因編碼)從而W高產(chǎn)量生產(chǎn)y -i^L和Di^L的混合物的遺傳 修飾的大腸桿菌LacZT+株，W W下方式培養(yǎng)：
[0047] (a)通過碳基底物保證的第一階段的指數(shù)細(xì)胞生長，和
[0048] (b)由與連續(xù)加入的乳糖一起連續(xù)加入的碳源和能源限制的第二階段的細(xì)胞生 長。
[0049] 此外優(yōu)選的是在允許具有高細(xì)胞密度的培養(yǎng)物的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)大腸桿菌。此 外優(yōu)選地，還向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑，優(yōu)選異丙基β-D-硫代半乳糖巧(IPTG)。
[0050] 優(yōu)選連續(xù)培養(yǎng)大腸桿菌，優(yōu)選達(dá)至少4天，特別是多至7天，但不多于約9-10天，優(yōu) 選在30至35 Γ的溫度，并且優(yōu)選伴有連續(xù)攬拌，連續(xù)通氣和連續(xù)進(jìn)料碳源和能源W及乳糖。 在運(yùn)樣在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的y -化和D化的混合物中，D化優(yōu)選包含至少2.5m/m%，更優(yōu)選至少 5m/m%，甚至更優(yōu)選至少lOm/m%，特別是至少20m/m%的y-化的重量。
[0051] 根據(jù)W高產(chǎn)量制備2/-化和D化的混合物的另一途徑，大腸桿菌菌株，優(yōu)選大腸桿 菌LacZT+株，其僅具有一種重組糖基轉(zhuǎn)移酶(其是α 1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選由來自幽口 螺旋桿菌的化tC基因編碼），用于發(fā)酵，所述發(fā)酵包括：
[0052] -優(yōu)選W連續(xù)的方式，提供碳源和能源，優(yōu)選甘油，W及乳糖，達(dá)多 [0化3] 于4天，優(yōu)選多至7天。
[0054] 運(yùn)樣在培養(yǎng)基中生產(chǎn)的任選地含有化U和任選地含有F化的y -FL+D化混合物，優(yōu) 選每升的培養(yǎng)基中包含至少75克，更優(yōu)選至少100克，特別是多至115克。
[0055] 優(yōu)選地，如上文公開的僅具有一種重組糖基轉(zhuǎn)移酶(其是α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶， 優(yōu)選由來自幽口螺旋桿菌的化tC基因編碼)從而W高產(chǎn)量生產(chǎn)y -i^L和Di^L的混合物的遺傳 修飾的大腸桿菌LacZT+株，W W下方式培養(yǎng)：
[0056] (a)通過碳基底物保證的第一階段的指數(shù)細(xì)胞生長，和
[0057] (b)由與連續(xù)加入的乳糖一起連續(xù)加入的碳源和能源限制的第二階段的細(xì)胞生 長。
[0058] 此外優(yōu)選的是在允許具有高細(xì)胞密度的培養(yǎng)物的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)大腸桿菌。此 外優(yōu)選地，還向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑，優(yōu)選異丙基β-D-硫代半乳糖巧(IPTG)。
[0059] 在30至35°C的溫度培養(yǎng)大腸桿菌達(dá)至少4天，特別是多至7天，但不多于約9-10天， 并且優(yōu)選伴有連續(xù)攬拌，連續(xù)通氣和連續(xù)進(jìn)料碳源和能源W及乳糖。在運(yùn)樣在培養(yǎng)基中產(chǎn) 生的y -化和D化的混合物中，WL優(yōu)選包含至少2.5m/m%，更優(yōu)選至少5m/m%，甚至更優(yōu)選 至少lOm/m%，特別是至少20m/m%的y -化的重量。
[0060] 根據(jù)更優(yōu)選的W高產(chǎn)量制備y-化和D化的混合物的途徑，大腸桿菌菌株，優(yōu)選大 腸桿菌LacZT+株，其僅具有一種重組糖基轉(zhuǎn)移酶(其是α 1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選由來自 幽口螺旋桿菌的化tC基因編碼），用于發(fā)酵，所述發(fā)酵包括：
[0061] -基于1升的初始培養(yǎng)體積，優(yōu)選W連續(xù)的方式，提供碳源和能源，優(yōu)選甘油，和至 少50,優(yōu)選至少75,更優(yōu)選至少100克的乳糖，優(yōu)選達(dá)多于4天，更優(yōu)選多至7天，優(yōu)選W致培 養(yǎng)基的最終體積不大于培養(yǎng)前的培養(yǎng)基體積的Ξ倍，更優(yōu)選不大于其兩倍，甚至更優(yōu)選小 于其兩倍。
[0062] 在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的任選地含有FLU和任選地含有F化的y -FL+D化混合物優(yōu)選每升 的培養(yǎng)基中包含至