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      苦蘵苦素i及提取方法及用圖

      文檔序號(hào):10642850閱讀:757來(lái)源:國(guó)知局
      苦蘵苦素i及提取方法及用圖
      【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了苦蘵苦素I及提取方法及用途,苦蘵苦素I是具有式(I)的結(jié)構(gòu):本發(fā)明的苦蘵苦素I能有效地抑制一氧化氮(NO)的釋放,提示本發(fā)明化合物可作為抗炎的藥物??嗵u苦素I能有效地抑制腫瘤活性。
      【專(zhuān)利說(shuō)明】
      苦藤苦素 I及提取方法及用途
      技術(shù)領(lǐng)域
      [0001]本發(fā)明涉及中藥提取領(lǐng)域,涉及苦藤苦素 I及提取方法及用途。
      【背景技術(shù)】
      [0002]苦藤(Physalis angulata L.),又稱(chēng)燈籠草、天泡子、天泡草、樸樸草、打額泡等, 為前科(Solanaceae)酸衆(zhòng)屬(Physalis)-年生草本植物?!蛾懘ū静荨泛汀吨腥A本草》對(duì)苦藤 的藥用功效有著詳細(xì)的記載,苦藤具有行氣,消脹,利尿,治腹脹,清熱解毒,利尿止血,消腫 散結(jié),可用于治療咽喉腫痛,肺癰,腮腺炎;小便不利,血尿牙齦腫痛,天皰瘡等疾病。民間多 用于治療皰瘡、牙齦腫痛、濕熱黃疸、咽喉紅腫疼痛、肺熱咳嗽等疾病。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)體 內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了苦藤的抗炎(Choi, E.M.;et al.Investigations of antiinflammatory and antinociceptive activities of Piper cubeba,Physalis angulata and Rosa hybrida. Journal of Ethnopharmacology 2003,89,171-175.)、抗腫瘤(He,H·; et al.Physalin A induces apoptotic cell death and protective autophagy in HT1080human fibrosarcoma cells.Journal of Natural Products,2013,76,880-888.)n 抗菌(Si lva,M · T · G · ; et al. Studies on antimicrobial activity , in vitro , of Physalis angulata L.(Solanaceae)fraction and physalin B bringing out the importance of assay determination.Memorias do Instituto Oswaldo Cruz 2005, 100,779-782·)、抗氧化(Choi,E.M.;et al.Effect of some medicinal plants on plasma antioxidant system and lipid levels in rats.Phytotherapy research · 2005,19,382-386 ·)等作用。
      [0003] 但從苦藤中提取苦藤苦素 I,提取方法,及用途尚未見(jiàn)報(bào)道。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0004] 本發(fā)明的目的是提供苦藤苦素 I。
      [0005] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供苦藤苦素 I的提取方法。
      [0006] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供苦藤苦素 I的用途。
      [0007] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供包含權(quán)利要求1的苦藤苦素 I的苦藤提取物。
      [0008] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供苦藤提取物的用途。
      [0009] 本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供含苦藤苦素 I的藥物組合物。
      [0010] 本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供上述藥物組合物的用途。
      [0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
      [0012] 苦藤苦素 I,具有式(I)的結(jié)構(gòu):
      [0013]
      [0014] 苦藤苦素 I的提取方法,包括如下步驟:
      [0015] (1)以苦藤的干燥莖葉為原料,加入原料8-10質(zhì)量倍的體積分?jǐn)?shù)為60 %-80%乙醇 水溶液,回流提取2-3次,每次提取2-3小時(shí),合并得到提取液,減壓回收溶劑,濃縮后得到總 浸膏;
      [0016] (2)將總浸膏分散到5-10質(zhì)量倍的水中,依次用石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取,乙酸 乙酯萃取液減壓回收溶劑,得到乙酸乙酯層浸膏;
      [0017] (3)乙酸乙酯層浸膏經(jīng)硅膠柱色譜分離,以體積比分別為100:1、50:1和30:1的二 氯甲烷一甲醇為洗脫劑梯度洗脫,得到餾分Fr. 1、Fr. 2、Fr. 3;
      [0018] (4)餾分Fr. 3經(jīng)硅膠柱色譜分離,以體積比分別為10:1、8:1和6:1的石油醚一丙酮 為洗脫劑梯度洗脫,得到餾分Fr. 3-1、Fr. 3-2、Fr. 3-3;
      [0019] (5)餾分Fr.3-3經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離,以體積比為1:1的二氯甲烷-甲醇 為洗脫劑等度洗脫,得到餾分Fr. 3-3-1和Fr. 3-3-2;
      [0020] (6)餾分Fr. 3-3-2經(jīng)0DS柱色譜分離,以體積比為1: 9、3 : 7、5:5和8: 2的甲醇-水為 洗脫劑梯度洗脫,得到饋分Fr · 3H-1、Fr · 3m、Fr · 3H-3和Fr · 3-3H;
      [0021] (7)餾分Fr.3-3-2-4經(jīng)硅膠制備薄層色譜分離,以體積比為1:1的二氯甲烷一丙酮 為展開(kāi)劑進(jìn)行制備,得到餾分Fr. 3-3-2-4-1;
      [0022] (8)餾分Fr.3-3-2-4-1經(jīng)制備HPLC色譜,以體積比為1:1的甲醇-水為流動(dòng)相,進(jìn)行 純化,得到式I所示苦藤苦素 I。
      [0023] 苦藤苦素 I在制備抗腫瘤藥物和在制備抑制細(xì)胞釋放N0藥物中的應(yīng)用。
      [0024]包含苦藤苦素 I的苦藤提取物。
      [0025] 苦藤提取物在制備抗腫瘤藥物和在制備抑制細(xì)胞釋放N0藥物中的應(yīng)用。
      [0026] -種藥物組合物,包含苦藤苦素 I或其藥學(xué)上可接受的鹽,和藥學(xué)上可接受的載體 和/或賦形劑。
      [0027] 上述藥物組合物在制備抗腫瘤藥物和在制備抑制細(xì)胞釋放N0藥物中的應(yīng)用。
      [0028]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
      [0029] 本發(fā)明的苦藤苦素 I能有效地抑制一氧化氮(N0)的釋放,提示本發(fā)明化合物可作 為抗炎的藥物??嗵倏嗨?I能有效地抑制腫瘤活性。
      【具體實(shí)施方式】
      [0030] 下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行描述,所描述的實(shí)施例僅僅是本 發(fā)明一部分實(shí)施例,而不是全部的實(shí)施例?;诒景l(fā)明中的實(shí)施例,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在 沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例,都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
      [0031] 實(shí)施例1
      [0032]苦藤苦素 I的提取方法,包括如下步驟:
      [0033] (1)以苦藤(Physalis angulata L.)的干燥莖葉(9.5kg)為原料,加入原料9質(zhì)量 倍的體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇水溶液,回流提取2次,每次提取2小時(shí),合并得到提取液,減壓回 收溶劑,濃縮后得到總浸膏(1370g);
      [0034] (2)將總浸膏分散到5質(zhì)量倍的水中,依次用等體積石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取, 乙酸乙酯萃取液減壓回收溶劑,得到乙酸乙酯層浸膏116g;
      [0035] (3)乙酸乙酯層浸膏經(jīng)硅膠柱色譜分離,以體積比分別為100:1、50:1和30:1的二 氯甲烷一甲醇為洗脫劑梯度洗脫,得到餾分Fr.l、Fr.2、Fr.3(35g);
      [0036] (4)餾分Fr. 3經(jīng)硅膠柱色譜分離,以體積比分別為10:1、8:1和6:1的石油醚一丙酮 為洗脫劑梯度洗脫,得到餾分Fr. 3-1、Fr. 3-2、Fr. 3-3(4.2g);
      [0037] (5)餾分Fr.3-3經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離,以體積比為1:1的二氯甲烷-甲醇 為洗脫劑等度洗脫,得到餾分Fr. 3-3-1和Fr. 3-3-2 (600mg);
      [0038] (6)餾分Fr. 3-3-2經(jīng)0DS柱色譜分離,以體積比為1: 9、3 : 7、5:5和8: 2的甲醇-水為 洗脫劑梯度洗脫,得到餾分Fr · 3-3-2-1、Fr · 3-3-2-2、Fr · 3-3-2-3和Fr · 3-3-2-4( 500mg);
      [0039] (7)餾分Fr.3-3-2-4經(jīng)硅膠制備薄層色譜分離,以體積比為1:1的二氯甲烷一丙酮 為展開(kāi)劑進(jìn)行制備,得到餾分Fr. 3-3-2-4-1;
      [0040] (8)餾分Fr.3-3-2-4-1經(jīng)制備HPLC色譜,以體積比為1:1的甲醇-水為流動(dòng)相,進(jìn)行 純化,得到化合物1(17mg)。
      [0041 ] 化合物1的物理化學(xué)和常數(shù)如下:
      [0042] 化合物 1:無(wú)定型粉末;Μ;; +80.0(c 0.1,Me0H);UV(Me0H)Amax(l〇ge)208(1.4), 220(4.0)nm;IR(KBr)v max 3395,2921,2850,1740,1712,1647,1467,1382,1228,113401150) (MeOH)nm(Δε)247(+5.9),294(-1.1);HRESIME m/z 581.2726[M+Na]+(calcd for C3iH42〇9Na,581 · 2727),確定化合物 1 的分子式為C31H42O9; ^GOOMHz,pyridine-d5)和 13C-NMR (100MHz,pyridine_d5)數(shù)據(jù)表 1 〇
      [0043] 表1化合物1的碳譜和氫譜數(shù)據(jù)
      [0044]
      [0045] 注 ^H-NMRJOOMHz,pyridine_d5; 13C_NMR,100MHz,pyridine_d5〇
      [0046] 通過(guò)理化常數(shù)和現(xiàn)代波譜學(xué)手段(MS和NMR),結(jié)合文獻(xiàn)相關(guān)數(shù)據(jù),鑒定它的結(jié)構(gòu), 化合物1為未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的新化合物,如下所示:
      [0047
      [0048] 實(shí)施例2
      [0049] 苦藤苦素 I的提取方法,包括如下步驟:
      [0050] (1)以苦藤的干燥莖葉為原料,加入原料8質(zhì)量倍的體積分?jǐn)?shù)為80 %乙醇水溶液, 回流提取3次,每次提取2小時(shí),合并得到提取液,減壓回收溶劑,濃縮后得到總浸膏;
      [0051] (2)將總浸膏分散到5質(zhì)量倍的水中,依次用等體積石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取, 乙酸乙酯萃取液減壓回收溶劑,得到乙酸乙酯層浸膏;
      [0052] (3)-(8)同實(shí)施例1(3)_(8)。
      [0053] 實(shí)施例3
      [0054] 苦藤苦素 I的提取方法,包括如下步驟:
      [0055] (1)以苦藤的干燥莖葉為原料,加入原料10質(zhì)量倍的體積分?jǐn)?shù)為60 %乙醇水溶液, 回流提取3次,每次提取2小時(shí),合并得到提取液,減壓回收溶劑,濃縮后得到總浸膏;
      [0056] (2)將總浸膏分散到10質(zhì)量倍的水中,依次用等體積石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取, 乙酸乙酯萃取液減壓回收溶劑,得到乙酸乙酯層浸膏;
      [0057] (3)-(8)同實(shí)施例1(3)_(8)。
      [0058] 實(shí)施例4
      [0059] 苦藤苦素 I抗腫瘤活性檢測(cè)
      [0060] 采用MTT方法,對(duì)苦藤苦素 I進(jìn)行活性檢測(cè),以人前列腺癌細(xì)胞(C4-2B和22Rvl),人 腎癌細(xì)胞(786-0,A-498和ACHN),人黑色素瘤細(xì)胞(A375-S2)為例。上述細(xì)胞均來(lái)購(gòu)置于 ATCCOJSA,電話(huà):800-638-6597,購(gòu)買(mǎi)時(shí)間2014年9 月)
      [0061] 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述細(xì)胞100yL,每孔2X104接種于96孔板中,置⑶ 2培養(yǎng)箱 (37°C,5%C02,飽和濕度)培養(yǎng)。
      [0062] 12小時(shí)后加藥(苦藤苦素 Ι)10μL7孔,樣品的工作液用含10%熱滅活(56°C,30min) 胎牛血清(Gibco,USA)、100U/mL青霉素鈉(Gibco,USA)、100yg/mL鏈霉素(Gibco,USA)的 RPMI 1640(Gibco,USA)或 EMEM(Gibco,USA)培養(yǎng)基液稀釋至終濃度分別為 10,5,2 · 5,1 · 25, 0.625,0.3125,0.15625μΜ,加樣組及空白組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后,加入MTT工作 液,20μ!7孔,3小時(shí)后,棄去培養(yǎng)基,加入DMS0 150μ!7孔,平板搖床上500rpm震搖3分鐘,用 酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的0D值,測(cè)定波長(zhǎng)為490nm,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率,細(xì)胞增殖抑制率=(空白 對(duì)照組0D值-給藥組0D值)/空白對(duì)照組0D值X 100%。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,活性結(jié)果(IC50) 見(jiàn)表2。
      [0063]表2苦藤苦素 I的抗腫瘤活性結(jié)果(IC5Q,yM)
      [0064]
      [0065] 實(shí)施例5
      [0066]苦藤苦素 I抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7釋放一氧化氮(N0)的活性測(cè)試 [0067] 小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7(ATCC)培養(yǎng)于含10%熱滅活(56°C,30min)胎牛血清 (Gibco)、100U/mL 青霉素鈉(Gibco)、100yg/mL 鏈霉素(Gibco)的 RPMI 1640(Gibco)培養(yǎng)液 中,37°C,5 %C02的恒溫培養(yǎng)箱中孵育生長(zhǎng)。由于N0極不穩(wěn)定,在細(xì)胞培養(yǎng)上清液內(nèi)很快代 謝成亞硝酸基(NOf),故采用Griess法測(cè)定樣品中NOf的濃度作為衡量N0水平的指標(biāo)。 Griess 試劑 A: 0 · 1 %N_ 萘乙二胺鹽酸鹽(naphthylethylenediaminedihydrochloride)溶于 水中;Griess試劑B: 1 %對(duì)氨基苯磺酰胺(sulphanilamide)溶于5%H3P〇4中。使用前等體積 混合試劑4和1用1?^1 1640培養(yǎng)液將1^1 264.7細(xì)胞稀釋至5\105〇6118/1^濃度,接種于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔加入200100yL細(xì)胞懸浮液。C0 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh后,每孔加入脂多 糖(lipopolysaccharide,LPS)(Sigma)(終濃度lyg/mL)和DMSO溶解的不同濃度的測(cè)試樣品 0.4yL,同時(shí)設(shè)LPS組(加入LPS,但不加入測(cè)試樣品,對(duì)NO釋放的抑制率為0% )和空白對(duì)照組 (不加入LPS和測(cè)試樣品,僅加入0.4yL DMS0,對(duì)NO釋放的抑制率為100 % ),每個(gè)樣品設(shè)4個(gè) 平行孔。在37°C,5%C02的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,吸取100yL培養(yǎng)液上清至酶標(biāo)板中,離心 (1000 Xg,4°C,3min),加入100yL Griess試劑,室溫避光反應(yīng)lOmin,于酶標(biāo)儀測(cè)定其540nm 處吸光值。用濃度分別為1、5、10、50ym〇VL的NaN02繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)NaN02標(biāo)準(zhǔn)曲線細(xì)胞 培養(yǎng)上清液中NOf的濃度進(jìn)而計(jì)算測(cè)試樣品對(duì)NO釋放的抑制率。
      [0068]表3化合物的抑制N0釋放結(jié)果
      [0069]
      [0070] 含有本發(fā)明所述化合物的組合物的抗炎藥物可以為適用于口服或注射等應(yīng)用形 式,例如,按常規(guī)技術(shù),加入藥物可接受的載體和/或賦形劑制成片劑、膠囊劑、粉劑、糖漿 劑、針劑等。
      [0071 ]化合物具有藥理活性,因此,含有該化合物的組合物也具有藥理活性。
      [0072] 以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其中心思想。應(yīng)當(dāng)指出,對(duì) 于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō),在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干 改進(jìn)和修飾,這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)。
      [0073] 本發(fā)明的苦藤苦素 I、含苦藤苦素 I的提取物、含苦藤苦素 I的組合物能制備治療一 氧化氮代謝異常相關(guān)聯(lián)疾病的藥物。
      [0074] 其相關(guān)聯(lián)的疾病包括:全身炎癥反應(yīng)綜合癥、高血壓、腦血栓、心力衰竭、肝硬化、 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、急性胰腺炎、腹膜炎、膽囊炎、闌尾炎、 糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮炎肌、銀肩病、急性髓性白血病、帕金森癥、早老性癡呆、抑郁 癥、敗血癥、慢性阻塞性肺炎、哮喘、急性胰腺炎、中樞神經(jīng)損傷等。其次,N0代謝異常還與癌 變及癌組織的增生有關(guān),高濃度的N0也會(huì)誘發(fā)基因突變和腫瘤,上述化合物可以抑制N0釋 放,從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。適用的腫瘤例子包括但不限于:各種實(shí)體腫瘤和白血病,如肺 癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、食道癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、膀胱癌、子宮頸癌、黑色素 瘤、睪丸癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、膽管癌、絨毛膜癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維瘤、纖維肉瘤、淋 巴管瘤等。
      【主權(quán)項(xiàng)】
      1. 苦藤苦素 I,其特征是具有式(I)的結(jié)構(gòu):2. 權(quán)利要求1所述苦藤苦素 I的提取方法,其特征在于包括如下步驟: (1) 以苦藤的干燥莖葉為原料,加入原料8-10質(zhì)量倍的體積分?jǐn)?shù)為60% -80 %乙醇水溶 液,回流提取2-3次,每次提取2-3小時(shí),合并得到提取液,減壓回收溶劑,濃縮后得到總浸 膏; (2) 將總浸膏分散到5-10質(zhì)量倍的水中,依次用石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取,乙酸乙酯 萃取液減壓回收溶劑,得到乙酸乙酯層浸膏; (3) 乙酸乙酯層浸膏經(jīng)硅膠柱色譜分離,以體積比分別為100:1、50:1和30:1的二氯甲 烷一甲醇為洗脫劑梯度洗脫,得到餾分Fr. I、Fr. 2、Fr. 3; (4) 餾分Fr. 3經(jīng)硅膠柱色譜分離,以體積比分別為10:1、8:1和6:1的石油醚一丙酮為洗 脫劑梯度洗脫,得到餾分Fr. 3-1、Fr. 3-2、Fr. 3-3; (5) 餾分Fr.3-3經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離,以體積比為1:1的二氯甲烷-甲醇為洗 脫劑等度洗脫,得到餾分Fr. 3-3-1和Fr. 3-3-2; (6) 餾分Fr. 3-3-2經(jīng)ODS柱色譜分離,以體積比為1:9、3: 7、5: 5和8: 2的甲醇-水為洗脫 劑梯度洗脫,得到饋分Fr · 3H-1、Fr · 3m、Fr · 3-3?和Fr · 3-3H; (7) 餾分Fr.3-3-2-4經(jīng)硅膠制備薄層色譜分離,以體積比為1:1的二氯甲烷一丙酮為展 開(kāi)劑進(jìn)行制備,得到餾分Fr. 3-3-2-4-1; (8) 餾分Fr. 3-3-2-4-1經(jīng)制備HPLC色譜,以體積比為1:1的甲醇-水為流動(dòng)相,進(jìn)行純 化,得到式I所示苦藤苦素 I。3. 權(quán)利要求1的苦藤苦素 I在制備抗腫瘤藥物和在制備抑制細(xì)胞釋放NO藥物中的應(yīng)用。4. 包含苦藤苦素 I的苦藤提取物。5. 權(quán)利要求4的苦藤提取物在制備抗腫瘤藥物和在制備抑制細(xì)胞釋放NO藥物中的應(yīng) 用。6. -種藥物組合物,其特征是包含苦藤苦素 I或其藥學(xué)上可接受的鹽,和藥學(xué)上可接受 的載體和/或賦形劑。7. 權(quán)利要求6的藥物組合物在制備抗腫瘤藥物和在制備抑制細(xì)胞釋放NO藥物中的應(yīng) 用。
      【文檔編號(hào)】A61P1/00GK106008657SQ201610341691
      【公開(kāi)日】2016年10月12日
      【申請(qǐng)日】2016年5月20日
      【發(fā)明人】邱峰, 孫成鵬, 陳麗霞, 康寧
      【申請(qǐng)人】天津中醫(yī)藥大學(xué)
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