本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤是威脅人類健康的重大疾病，實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向治療，降低治療藥物對正常組織和器官的傷害對攻克腫瘤疾病這一重大難題具有重大意義?；熕幬?，放療藥物，光動力學(xué)治療藥物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療，能夠在一定程度上抑制腫瘤的生長。但是，在腫瘤治療的過程中使用的藥物通常不具有選擇性，為實(shí)現(xiàn)腫瘤的有效抑制，需要加大治療藥物的用量。而腫瘤治療過程中的強(qiáng)毒副作用不僅極大的降低了腫瘤治療的效果，同時(shí)也降低了腫瘤患者的生活質(zhì)量。因此，實(shí)現(xiàn)腫瘤治療藥物的靶向運(yùn)輸，以達(dá)到對腫瘤的有效抑制，一直是生物醫(yī)學(xué)和生物材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

腫瘤靶向藥物運(yùn)輸一般可分為主動靶向和被動靶向。通過腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)的蛋白或者受體，利用抗體或者其他小分子靶向基團(tuán)實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)輸稱為主動靶向。利用腫瘤區(qū)域的“增強(qiáng)穿透和滯留”效應(yīng)，納米藥物載體可以實(shí)現(xiàn)對腫瘤區(qū)域的富集成為被動靶向。但是，致密的腫瘤環(huán)境、腫瘤區(qū)域高滲透壓以及人體的免疫系統(tǒng)將極大的限制傳統(tǒng)靶向藥物載體對腫瘤的靶向運(yùn)輸和穿透，從而使主動靶向和被動靶向都面臨著極大的應(yīng)用難題。

近年來，利用循環(huán)細(xì)胞作為藥物載體，通過載體細(xì)胞對腫瘤環(huán)境的趨向性，避過免疫系統(tǒng)的清除，實(shí)現(xiàn)腫瘤的穿透，從而實(shí)現(xiàn)藥物對腫瘤的靶向運(yùn)輸。傳統(tǒng)的細(xì)胞藥物載體是通過載體細(xì)胞對治療藥物的內(nèi)吞和擴(kuò)散實(shí)現(xiàn)藥物的包載和釋放的，極大的限制了這種細(xì)胞藥物載體的應(yīng)用意義。首先，這種細(xì)胞藥物載體對細(xì)胞和藥物的要求較高，所以通常只能用單核細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞作為細(xì)胞載體，同時(shí)只能局限于光熱治療和某些化療藥物的運(yùn)輸；其次，藥物對載體細(xì)胞的毒性導(dǎo)致載體細(xì)胞不能實(shí)現(xiàn)長時(shí)間的體內(nèi)循環(huán)；再次，由于內(nèi)吞藥物處于復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，而載體細(xì)胞中諸如溶酶體和內(nèi)涵體中的活性酶將導(dǎo)致藥物在載體細(xì)胞中的降解，同時(shí)也難以實(shí)現(xiàn)藥物從載體細(xì)胞亞細(xì)胞器中的逃逸；最后，藥物的帶電性質(zhì)、親疏水性也極大的影響細(xì)胞載體的載藥率。因此，設(shè)計(jì)一種通用的細(xì)胞藥物載體，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)對各種類和多種藥物的腫瘤靶向運(yùn)輸，對實(shí)現(xiàn)腫瘤的協(xié)同治療，精確治療，降低毒副作用和實(shí)現(xiàn)個(gè)性化治療具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一目的是提供一種腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體，所述的細(xì)胞藥物載體由嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物和載體細(xì)胞組成，嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物嵌入載體細(xì)胞細(xì)胞膜，通過載體細(xì)胞對腫瘤的趨向性實(shí)現(xiàn)藥物傳遞。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物，由親水性聚精氨酸、烷基鏈和鍵合藥物組成，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式通式如式(Ⅰ)所示：

其中m＝5-8；n＝1-6；R為鍵合藥物，是光動力學(xué)治療光敏劑、化療藥物或者熒光分子的任意一種。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物，其為棕櫚酸-賴氨酸(喜樹堿)-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸、棕櫚酸-賴氨酸(原卟啉)-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸和棕櫚酸-賴氨酸(熒光素)-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸中的任意一種。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體，所述的細(xì)胞藥物載體由兩種嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物和載體細(xì)胞組成，兩種嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物同時(shí)嵌入載體細(xì)胞細(xì)胞膜，所述的兩種嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物的鍵合藥物為光動力學(xué)治療光敏劑、化療藥物或者熒光分子中的任意兩種。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體的載體細(xì)胞為循環(huán)細(xì)胞。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體的載體細(xì)胞，為紅細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞，白細(xì)胞。

本發(fā)明提供的腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體在制備腫瘤成像的試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體在制備化療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體在制備光動力學(xué)治療光敏劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體在制備同時(shí)能夠完成腫瘤成像和化療的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體在制備同時(shí)能夠完成腫瘤光動力學(xué)治療和化療的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體在制備同時(shí)能夠完成腫瘤光動力學(xué)治療和腫瘤成像的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的原理是：通過對細(xì)胞膜有嵌入作用的烷基鏈和對細(xì)胞膜有吸附作用的帶正電多肽鏈段結(jié)合形成細(xì)胞膜嵌合物，將小分子藥物通過化學(xué)鍵合到嵌合物側(cè)基形成嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物。將嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物嵌入到循環(huán)細(xì)胞的細(xì)胞膜中，實(shí)現(xiàn)藥物的運(yùn)載。嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物嵌入到載體細(xì)胞細(xì)胞膜后將不會影響載體細(xì)胞對腫瘤的趨向性。同時(shí)，利用循環(huán)細(xì)胞對腫瘤的趨向性，實(shí)現(xiàn)藥物對腫瘤的靶向運(yùn)輸。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例證實(shí)了腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體中嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物可以作為化療藥物在載體細(xì)胞上嵌入及運(yùn)輸，并在一定時(shí)間內(nèi)具有一定的穩(wěn)定性。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例證實(shí)了腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體中嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物可以作為光動力學(xué)治療光敏劑在載體細(xì)胞上嵌入及運(yùn)輸，并在一定時(shí)間內(nèi)具有一定的穩(wěn)定性。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例證實(shí)了腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體中嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物可以作為熒光成像分子在載體細(xì)胞上嵌入及運(yùn)輸，并在一定時(shí)間內(nèi)具有一定的穩(wěn)定性。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例證實(shí)了腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體中嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物可以嵌入到巨噬細(xì)胞、干細(xì)胞及紅細(xì)胞的細(xì)胞膜上。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例證實(shí)了腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體中嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物可以作為熒光成像分子和光動力學(xué)治療光敏劑在載體細(xì)胞上同時(shí)嵌入及運(yùn)輸，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的成像和治療。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例證實(shí)了腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體中嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物可以作為化療藥物和光動力學(xué)治療光敏劑在載體細(xì)胞上的同時(shí)嵌入及運(yùn)輸，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的協(xié)同治療。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例證實(shí)了腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體中嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物作為光動力學(xué)治療光敏劑在載體細(xì)胞上的嵌入及運(yùn)輸，對載體細(xì)胞沒有毒性，相對于內(nèi)吞形式的運(yùn)輸更具生物相容性。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例證實(shí)了腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體中嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物作為光動力學(xué)治療光敏劑在載體細(xì)胞上的嵌入及運(yùn)輸，光敏劑的載藥量隨嵌細(xì)胞膜光敏劑鍵合物與載體細(xì)胞的共培養(yǎng)時(shí)間增加而增大。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例證實(shí)了腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體中嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物作為光動力學(xué)治療光敏劑在載體細(xì)胞上的嵌入及運(yùn)輸，光敏劑的載藥量隨載體細(xì)胞與共培養(yǎng)的嵌細(xì)胞膜光敏劑鍵合物的濃度增加而增大。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例證實(shí)了腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體中嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物作為光動力學(xué)治療光敏劑在載體細(xì)胞上的嵌入及運(yùn)輸，載體細(xì)胞膜表面嵌入藥物鍵合物后對，載體細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的趨向性不受影響。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例證實(shí)了腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體中嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物作為光動力學(xué)治療光敏劑在載體細(xì)胞上的嵌入及運(yùn)輸，嵌膜細(xì)胞載體對腫瘤具有靶向性。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例證實(shí)了腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體中嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物作為光動力學(xué)治療光敏劑在載體細(xì)胞上的嵌入及運(yùn)輸，嵌膜細(xì)胞載體治療對腫瘤生長具有抑制效果。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例證實(shí)了腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體中嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物作為光動力學(xué)治療光敏劑在載體細(xì)胞上的嵌入及運(yùn)輸，嵌膜細(xì)胞載體在腫瘤治療過程中，小鼠體重不變，具有較小的毒副作用。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例證實(shí)了腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體中嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物作為光動力學(xué)治療光敏劑在載體細(xì)胞上的嵌入及運(yùn)輸，嵌膜細(xì)胞載體治療對腫瘤體積生長具有抑制效果。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例證實(shí)了腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體中嵌細(xì)胞膜藥物鍵合物作為光動力學(xué)治療光敏劑在載體細(xì)胞上的嵌入及運(yùn)輸，嵌膜細(xì)胞載體治療對腫瘤重量生長具有抑制效果。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：1)利用細(xì)胞膜藥物嵌合物可以降低藥物對于載體細(xì)胞的細(xì)胞毒性。2)該細(xì)胞膜嵌合物具有通用性，可以用作化療藥物，光敏劑以及熒光分子的運(yùn)載。3)嵌膜細(xì)胞藥物鍵合物對載體細(xì)胞的腫瘤趨向性沒有影響。4)嵌膜細(xì)胞藥物載體可以實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向運(yùn)輸。5)這種腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體中的細(xì)胞膜嵌合物制備簡單，提純?nèi)菀?，載體細(xì)胞的獲得也較容易。6)這種嵌膜細(xì)胞載體可以實(shí)現(xiàn)對腫瘤同時(shí)進(jìn)行診斷和治療或協(xié)同治療等。

附圖說明

圖1：嵌細(xì)胞膜喜樹堿鍵合物對巨噬細(xì)胞的嵌膜及其對時(shí)間的穩(wěn)定性圖。

圖2：嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物對巨噬細(xì)胞的嵌膜及其對時(shí)間的穩(wěn)定性圖。

圖3：嵌細(xì)胞膜鍵合物分別嵌入巨噬細(xì)胞，干細(xì)胞和紅細(xì)胞以及嵌細(xì)胞膜熒光素鍵合物嵌入巨噬細(xì)胞對時(shí)間的穩(wěn)定性圖。

A嵌細(xì)胞膜喜樹堿鍵合物、嵌細(xì)胞膜熒光素鍵合物，嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物分別嵌入巨噬細(xì)胞圖；

B嵌細(xì)胞膜喜樹堿鍵合物、嵌細(xì)胞膜熒光素鍵合物，嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物分別嵌入干細(xì)胞圖；

C嵌細(xì)胞膜喜樹堿鍵合物、嵌細(xì)胞膜熒光素鍵合物，嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物分別嵌入紅細(xì)胞圖；

D嵌細(xì)胞膜熒光素鍵合物嵌入巨噬細(xì)胞對時(shí)間的穩(wěn)定性圖。

圖4.嵌細(xì)胞膜熒光素鍵合物和嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物對巨噬細(xì)胞的嵌膜圖。

圖5：嵌細(xì)胞膜喜樹堿鍵合物和嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物對巨噬細(xì)胞的嵌膜圖。

圖6：嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物和原卟啉對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性圖。

圖7：嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物對巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜嵌膜能力隨培養(yǎng)時(shí)間的變化圖。

圖8：嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物對巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜嵌膜能力隨嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物濃度梯度的變化圖。

圖9：嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物巨噬細(xì)胞載體趨向性能力測試圖。

圖10：嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物巨噬細(xì)胞載體對腫瘤的靶向能力圖。

圖11：各種條件下的腫瘤體積隨時(shí)間的變化圖。

圖12：各種條件下的小鼠體重隨時(shí)間變化圖。

圖13：各種條件下小鼠培養(yǎng)12天后剝離腫瘤的實(shí)物圖。

圖14：各種條件下小鼠培養(yǎng)12天后的腫瘤重量(克數(shù))圖。

具體實(shí)施方式

通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

【實(shí)施例1】嵌細(xì)胞膜鍵合物的合成

嵌細(xì)胞膜鍵合物(棕櫚酸-賴氨酸(喜樹堿)-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸),(棕櫚酸-賴氨酸(原卟啉)-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸)和(棕櫚酸-賴氨酸(熒光素)-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸)的合成：

(1)往裝有10mL重蒸過的N,N-二甲基甲酰胺的反應(yīng)器中加入0.5g氯樹脂(1.01mmol/g)，待氯樹脂在N,N-二甲基甲酰胺中溶脹2小時(shí)后抽除N,N-二甲基甲酰胺。

(2)將FMOC保護(hù)氨基和Pbf保護(hù)胍基的精氨酸(樹脂活性位點(diǎn)的4倍當(dāng)量)、N,N-二異丙基乙胺(氨基酸的8倍當(dāng)量)溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺中，再加到反應(yīng)器中室溫反應(yīng)2小時(shí)將半胱氨酸鍵合到樹脂上，抽除溶劑，N,N-二甲基甲酰胺洗滌2～4次。

(3)往反應(yīng)器中加入20％(V/V)哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(即哌啶與N,N-二甲基甲酰胺體積比為2:8)溶液10mL，室溫反應(yīng)15分鐘后，抽除溶劑；重復(fù)加入哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液進(jìn)行反應(yīng)以切落FMOC保護(hù)基，反應(yīng)結(jié)束后，抽除溶劑，用N,N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂2～4次。

(4)將精基酸(樹脂活性位點(diǎn)的4倍當(dāng)量)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(樹脂活性位點(diǎn)的4.8倍當(dāng)量)、1-羥基苯并三氮唑(樹脂活性位點(diǎn)的4.8倍當(dāng)量)、N,N-二異丙基乙胺(樹脂活性位點(diǎn)的8倍當(dāng)量)溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入反應(yīng)器中室溫反應(yīng)2小時(shí)將賴氨酸鍵合上去，抽除溶劑，用N,N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂2～4次。

(5)將剩下的精氨酸，精氨酸按照步驟(3)(4)逐一依次鍵合上去。

(6)按照步驟(3)脫除FMOC保護(hù)基，將FMOC保護(hù)氨基和Dde保護(hù)側(cè)基氨基的氨基酸(樹脂活性位點(diǎn)的4倍當(dāng)量)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(樹脂活性位點(diǎn)的4.8倍當(dāng)量)、1-羥基苯并三氮唑(樹脂活性位點(diǎn)的4.8倍當(dāng)量)、N,N-二異丙基乙胺(樹脂活性位點(diǎn)的8倍當(dāng)量)溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入反應(yīng)器中室溫反應(yīng)2小時(shí)將賴氨酸鍵合上去，抽除溶劑，用N,N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂2～4次。

(7)按照步驟(3)脫除FMOC保護(hù)基，將棕櫚酸(樹脂活性位點(diǎn)的4倍當(dāng)量)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(樹脂活性位點(diǎn)的4.8倍當(dāng)量)、1-羥基苯并三氮唑(樹脂活性位點(diǎn)的4.8倍當(dāng)量)、N,N-二異丙基乙胺(樹脂活性位點(diǎn)的8倍當(dāng)量)溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入反應(yīng)器中室溫反應(yīng)2小時(shí)將賴氨酸鍵合上去，抽除溶劑，用N,N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂2～4次。

(8)脫除Dde保護(hù)基，往反應(yīng)器中加入2％(V/V)水合肼/N,N-二甲基甲酰胺(即哌啶與N,N-二甲基甲酰胺體積比為2:98)溶液10mL，室溫反應(yīng)7分鐘后，抽除溶劑；重復(fù)加入水合肼/N,N-二甲基甲酰胺以切落Dde保護(hù)基，反應(yīng)結(jié)束后，抽除溶劑，用N,N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂2～4次。

(9)將原卟啉或者羧基化喜樹堿或者5(6)-羧基熒光素(樹脂活性位點(diǎn)的4倍當(dāng)量)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(樹脂活性位點(diǎn)的4.8倍當(dāng)量)、1-羥基苯并三氮唑(樹脂活性位點(diǎn)的4.8倍當(dāng)量)、N,N-二異丙基乙胺(樹脂活性位點(diǎn)的8倍當(dāng)量)溶于N,N-二甲基甲酰胺中，分別加入反應(yīng)器中室溫反應(yīng)4小時(shí)光敏劑或者化療藥物或者熒光分子鍵合上去，抽除溶劑，用N,N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂2～4次。

(10)N,N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂2～4次，甲醇洗滌2～4次，二氯甲烷洗滌2～4次。

(11)往反應(yīng)器中加入由如下體積百分含量的組分組成的溶液于室溫下作用2h以切落氨樹脂上的多肽鍵合物及側(cè)基：95％三氟乙酸、5％水。

(12)收集切落液，旋蒸，真空干燥得到產(chǎn)物，于-20℃避光保存。

以下實(shí)施例2-12中均以實(shí)施例1中合成的嵌細(xì)胞膜鍵合物為例。

【實(shí)施例2】嵌細(xì)胞膜喜樹堿鍵合物對巨噬細(xì)胞的嵌膜及其對時(shí)間的穩(wěn)定性

將巨噬細(xì)胞以1×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種，37℃條件下在1mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24小時(shí)后，將嵌細(xì)胞膜喜樹堿鍵合物溶解在培養(yǎng)基中，向巨噬細(xì)胞中加入1mL含有嵌細(xì)胞膜喜樹堿鍵合物(30微摩爾/升)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)2小時(shí)后，將含有嵌細(xì)胞膜喜樹堿鍵合物的培養(yǎng)基吸出，有PBS緩沖溶液將細(xì)胞洗滌三次后加入新的培養(yǎng)基，用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的喜樹堿的熒光強(qiáng)度。

結(jié)果如圖1所示，嵌細(xì)胞膜喜樹堿鍵合物能夠有效的嵌入巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜中，同時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞膜表面的熒光強(qiáng)度只有較弱減少，證明了嵌細(xì)胞膜喜樹堿鍵合物在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定性。

【實(shí)施例3】嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物對巨噬細(xì)胞的嵌膜及其對時(shí)間的穩(wěn)定性

將巨噬細(xì)胞以1×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種，37℃條件下在1mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24小時(shí)后，將嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物溶解在培養(yǎng)基中，向巨噬細(xì)胞中加入1mL含有嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物(30微摩爾/升)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)2小時(shí)后，將含有嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物的培養(yǎng)基吸出，有PBS緩沖溶液將細(xì)胞洗滌三次后加入新的培養(yǎng)基，用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的原卟啉的熒光強(qiáng)度。

結(jié)果如圖2所示，嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物能夠有效的嵌入巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜中，同時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞膜表面的熒光強(qiáng)度只有較弱減少，證明了嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定性。

【實(shí)施例4】嵌細(xì)胞膜鍵合物分別嵌入巨噬細(xì)胞，干細(xì)胞和紅細(xì)胞以及嵌細(xì)胞膜熒光素鍵合物嵌入巨噬細(xì)胞對時(shí)間的穩(wěn)定性

將紅細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，干細(xì)胞分別以1×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種，37℃條件下在1mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24小時(shí)后，將嵌細(xì)胞膜熒光素鍵合物，嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物，嵌細(xì)胞膜喜樹堿鍵合物分別溶解在培養(yǎng)基中，分別向紅細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，干細(xì)胞中加入1mL含有嵌細(xì)胞膜熒光素鍵合物(30微摩爾/升)，嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物(30微摩爾/升)，嵌細(xì)胞膜喜樹堿鍵合物(30微摩爾/升)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)2小時(shí)后，將含有嵌細(xì)胞膜鍵合物的培養(yǎng)基吸出，有PBS緩沖溶液將細(xì)胞洗滌三次后加入新的培養(yǎng)基，用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光素的熒光強(qiáng)度。

結(jié)果如圖3所示，嵌細(xì)胞膜鍵合物能夠有效的嵌入紅細(xì)胞，干細(xì)胞和巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜中，證明了嵌細(xì)胞膜鍵合物的通用性。同時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞膜表面的熒光強(qiáng)度只有較弱減少，證明了嵌細(xì)胞膜熒光素鍵合物在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定性。

【實(shí)施例5】嵌細(xì)胞膜熒光素鍵合物和嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物同時(shí)對巨噬細(xì)胞的嵌膜及其對時(shí)間的穩(wěn)定性

將巨噬細(xì)胞以1×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種，37℃條件下在1mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24小時(shí)后，將嵌細(xì)胞膜熒光素鍵合物和嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物溶解在培養(yǎng)基中，向巨噬細(xì)胞中加入1mL含有嵌細(xì)胞膜熒光素鍵合物和嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物(分別為30微摩爾/升)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)2小時(shí)后，將含有嵌細(xì)胞膜熒光素鍵合物和嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物的培養(yǎng)基吸出，有PBS緩沖溶液將細(xì)胞洗滌三次后加入新的培養(yǎng)基，用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光素和原卟啉的熒光強(qiáng)度。

結(jié)果如圖4所示，嵌細(xì)胞膜熒光素鍵合物和嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物能夠同時(shí)有效的嵌入巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜中。證明了本發(fā)明腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體可以同時(shí)對腫瘤進(jìn)行成像和治療。

【實(shí)施例6】嵌細(xì)胞膜喜樹堿鍵合物和嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物對巨噬細(xì)胞的嵌膜及其對時(shí)間的穩(wěn)定性

將巨噬細(xì)胞以1×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種，37℃條件下在1mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24小時(shí)后，將嵌細(xì)胞膜喜樹堿鍵合物和嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物溶解在培養(yǎng)基中，向巨噬細(xì)胞中加入1mL含有嵌細(xì)胞膜喜樹堿鍵合物和嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物(分別為30微摩爾/升)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)2小時(shí)后，將含有嵌細(xì)胞膜喜樹堿鍵合物和嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物的培養(yǎng)基吸出，有PBS緩沖溶液將細(xì)胞洗滌三次后加入新的培養(yǎng)基，用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的喜樹堿和原卟啉的熒光強(qiáng)度。

結(jié)果如圖5所示，嵌細(xì)胞膜熒光素鍵合物和嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物能夠同時(shí)有效的嵌入巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜中。證明了本發(fā)明腫瘤靶向細(xì)胞藥物載體可以完成對腫瘤進(jìn)行化療和光動力學(xué)治療的協(xié)同治療。

【實(shí)施例7】嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物和原卟啉對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性

巨噬細(xì)胞以6000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中，用100μL培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)。然后，將用培養(yǎng)基配制的嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物溶液和原卟啉溶液100μL分別加入到各孔中。所有細(xì)胞在避光條件下37攝氏度培養(yǎng)48小時(shí)。隨后在每個(gè)孔中加入20μL 5mg/mL的MTT(MTT溶解在PBS緩沖液中)。共培養(yǎng)4h后，吸出培養(yǎng)基，加入150μL二甲亞砜(DMSO)。酶標(biāo)儀測量每個(gè)孔中570納米處的吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率，進(jìn)而得到嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物溶液和原卟啉對巨噬細(xì)胞的毒性。

結(jié)果如圖6所示，嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物溶液具有較小的毒性，較原卟啉有更好的生物相容性。

【實(shí)施例8】嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物對巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜嵌膜能力與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系

將巨噬細(xì)胞以1×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種，37℃條件下在1mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24小時(shí)后，將嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物溶解在培養(yǎng)基中，向巨噬細(xì)胞中加入1mL含有嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物(30微摩爾/升)的培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)0小時(shí)，0.5小時(shí)，1小時(shí)，2小時(shí)和6小時(shí)后，將含有嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物的培養(yǎng)基吸出，有PBS緩沖溶液將細(xì)胞洗滌三次后加入新的培養(yǎng)基，用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的原卟啉的熒光強(qiáng)度。

結(jié)果如圖7所示，嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物在巨噬細(xì)胞膜上的原卟啉的熒光強(qiáng)度隨培養(yǎng)時(shí)間增長而增加。證明了嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物在巨噬細(xì)胞中的載藥率可以通過嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物與巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)時(shí)間來調(diào)控。

【實(shí)施例9】嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物對巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜嵌膜能力與嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物濃度梯度的關(guān)系

將巨噬細(xì)胞以1×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種，37℃條件下在1mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24小時(shí)后，將嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物溶解在培養(yǎng)基中，向巨噬細(xì)胞中加入1mL分別含有嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物濃度為0微摩爾/升，5微摩爾/升，10微摩爾/升，15微摩爾/升和30微摩爾/升的培養(yǎng)基。培養(yǎng)2小時(shí)后，將含有嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物的培養(yǎng)基吸出，有PBS緩沖溶液將細(xì)胞洗滌三次后加入新的培養(yǎng)基，用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的原卟啉的熒光強(qiáng)度。

結(jié)果如圖8所示，嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物在巨噬細(xì)胞膜上的原卟啉的熒光強(qiáng)度隨嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物濃度增大而增大。證明了嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物在巨噬細(xì)胞中的載藥率可以通過巨噬細(xì)胞與嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物的濃度來調(diào)控。

【實(shí)施例10】嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物巨噬細(xì)胞載體趨向性能力測試

將巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，嵌細(xì)胞膜原卟啉嵌合的巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，嵌細(xì)胞膜原卟啉嵌合的巨噬細(xì)胞分別以3000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在穿透膜上層。在各接種細(xì)胞下層分別加入1mL新的MEM培養(yǎng)基，4T1細(xì)胞培養(yǎng)過的MEM培養(yǎng)基，新的DMEM培養(yǎng)基和COS7培養(yǎng)過的DMEM培養(yǎng)基，37℃條件下培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)12小時(shí)，24小時(shí)，36小時(shí)和48小時(shí)后，用倒置顯微鏡觀測穿透細(xì)胞的個(gè)數(shù)。

結(jié)果如圖9所示，嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物嵌膜巨噬細(xì)胞在4T1細(xì)胞培養(yǎng)過的MEM培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)穿過穿透膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)與巨噬細(xì)胞在4T1細(xì)胞培養(yǎng)過的MEM培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)穿過穿透膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)相當(dāng)。證明了嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物對巨噬細(xì)胞的趨向性影響較小。

【實(shí)施例11】小白鼠體內(nèi)嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物巨噬細(xì)胞載體對腫瘤的靶向能力檢測

4～5周小白鼠(BALB/c)在小腿內(nèi)側(cè)皮下注射100μL(PBS)含細(xì)胞個(gè)數(shù)為1×10⁶的4T1細(xì)胞懸液造瘤，當(dāng)腫瘤體積長到約200mm²時(shí)。將嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物嵌合巨噬細(xì)胞尾靜脈注射到小白鼠體內(nèi)。用小動物活體成像觀測小鼠體內(nèi)熒光分布和變化。

結(jié)果如圖10所示，小鼠腫瘤區(qū)域材料熒光隨時(shí)間增加而增長，從而證明嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物嵌合巨噬細(xì)胞具有腫瘤靶向運(yùn)輸?shù)哪芰Α?/p>

【實(shí)施例12】嵌細(xì)胞膜原卟啉嵌合巨噬細(xì)胞載體對腫瘤的治療效果

4～5周小白鼠(BALB/c)在小腿內(nèi)側(cè)皮下注射100μL(PBS)含細(xì)胞個(gè)數(shù)為1×10⁶的4T1細(xì)胞懸液造瘤，當(dāng)腫瘤體積長到約200mm²時(shí)。將小鼠隨機(jī)分為6組。PBS和巨噬細(xì)胞、嵌細(xì)胞膜原卟啉嵌合巨噬細(xì)胞、嵌細(xì)胞膜原卟啉鍵合物、嵌細(xì)胞膜原卟啉嵌合巨噬細(xì)胞和原卟啉尾靜脈注射。注射24小時(shí)和48小時(shí)后，用660nm He-Ne激光照射腫瘤，每只每次5min。每天測量腫瘤體積，腫瘤體積按照V＝W²×L/2公式計(jì)算，其中W為較短的腫瘤寬度，L為較長的腫瘤寬度，通過相對腫瘤體積(V/V₀，V為實(shí)時(shí)腫瘤體積，V₀為治療前腫瘤體積)來反映腫瘤體積的變化情況。

結(jié)果見圖11，經(jīng)嵌細(xì)胞膜原卟啉嵌合巨噬細(xì)胞治療后的小鼠腫瘤生長受到抑制，并且相對于經(jīng)嵌細(xì)胞膜原卟啉和原卟啉有更優(yōu)越的腫瘤抑制作用，從而證明嵌細(xì)胞膜原卟啉嵌合巨噬細(xì)胞載體對腫瘤的治療效果。與此同時(shí)，小鼠重量隨治療效果沒有大幅變化，說明經(jīng)嵌細(xì)胞膜原卟啉嵌合巨噬細(xì)胞治療對小鼠沒有強(qiáng)毒副作用(圖12)。而腫瘤圖片中腫瘤體積(圖13)和重量(圖14)變化進(jìn)一步說明了嵌細(xì)胞膜原卟啉嵌合巨噬細(xì)胞優(yōu)越的腫瘤抑制作用。