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      腫瘤靶向藥物有效性檢測(cè)、突變富集方法、引物對(duì)及試劑的制作方法

      文檔序號(hào):509455閱讀:367來源:國知局
      腫瘤靶向藥物有效性檢測(cè)、突變富集方法、引物對(duì)及試劑的制作方法
      【專利摘要】本申請(qǐng)涉及腫瘤基因領(lǐng)域,公開了腫瘤靶向藥物有效性檢測(cè)、富集突變方法、引物對(duì)及試劑。本申請(qǐng)的方法,包括檢測(cè)受體內(nèi)腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的基因突變情況,其關(guān)聯(lián)基因包括EGFR、KRAS和BRAF中的至少一個(gè),具體可采用包括COLD-PCR擴(kuò)增步驟及測(cè)序步驟的方法。本申請(qǐng)還公開了一組引物對(duì),一種包括該引物對(duì)的試劑和試劑盒。本申請(qǐng)通過對(duì)EGFR,KRAS和BRAF三個(gè)基因的突變情況進(jìn)行檢測(cè),可為腫瘤靶向藥物有效性提供指導(dǎo)。通過以本申請(qǐng)公開的引物對(duì)進(jìn)行COLD-PCR擴(kuò)增可富集突變,將擴(kuò)增結(jié)果測(cè)序可使常規(guī)PCR/sanger測(cè)序法檢測(cè)突變率的靈敏度從原來的20%提高到1%,大大的降低了檢測(cè)的假陰性率。
      【專利說明】腫瘤靶向藥物有效性檢測(cè)、突變富集方法、引物對(duì)及試劑
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本申請(qǐng)涉及腫瘤基因領(lǐng)域,尤其涉及一種腫瘤靶向藥物有效性的檢測(cè)方法,一種富集腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的突變的方法、一組引物對(duì)以及一種試劑及試劑盒。
      【背景技術(shù)】
      [0002]腫瘤是當(dāng)今威脅人類健康的最大疾病,人們一直在尋找針對(duì)腫瘤的治療藥物。隨著當(dāng)代分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展,靶向藥物作為一種新興的高科技藥物逐漸進(jìn)入腫瘤治療領(lǐng)域,且快速發(fā)展成為治療腫瘤的有效措施。靶向藥物治療就是使藥物瞄準(zhǔn)腫瘤部位,在局部保存相對(duì)高的濃度,延長藥物的時(shí)間,提高對(duì)腫瘤的殺傷力,而對(duì)正常組織細(xì)胞作用較小。
      [0003]靶向藥物與一般常規(guī)化療藥物不同,靶向藥物通過與腫瘤細(xì)胞的特征性位點(diǎn)結(jié)合,干預(yù)控制腫瘤細(xì)胞生長增殖的基因信號(hào)傳導(dǎo)通路。而腫瘤細(xì)胞具有有多樣性,腫瘤細(xì)胞的特征性位點(diǎn)也因人而異。因此在使用腫瘤靶向藥物之前,對(duì)患者體內(nèi)的基因進(jìn)行檢測(cè),以判斷其體內(nèi)是否有符合條件的基因,一定程度上預(yù)知藥物是否會(huì)奏效。因此有必要設(shè)計(jì)腫瘤靶向藥物有效性的檢測(cè)方法。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0004]針對(duì)上述現(xiàn)狀,本申請(qǐng)的目的在于提供一種腫瘤靶向藥物有效性的檢測(cè)方法、一種富集腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的突變的方法、一組引物對(duì)和一種試劑及試劑盒。
      [0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的,本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N腫瘤靶向藥物有效性的檢測(cè)方法,包括檢測(cè)受體內(nèi)腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的`基因突變情況,所述腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因包括EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一種。
      [0006]進(jìn)一步的,上述檢測(cè)受體內(nèi)腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的基因突變情況包括檢測(cè)受體內(nèi)以下a-h中至少一組突變位點(diǎn)的突變情況:
      [0007]a、EGFR基因第709和/或719號(hào)密碼子;
      [0008]b、EGFR基因第746-750號(hào)密碼子;
      [0009]c、EGFR基因第790號(hào)密碼子;
      [0010]d、EGFR基因第858號(hào)密碼子;
      [0011]e、KRAS基因第12和/或第13號(hào)密碼子;
      [0012]f、KRAS基因第61號(hào)密碼子;
      [0013]g、KRAS基因第146號(hào)密碼子;
      [0014]h、BRAF基因第600號(hào)密碼子。
      [0015]本申請(qǐng)中檢測(cè)受體內(nèi)腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的基因突變情況是采用包括COLD-PCR擴(kuò)增步驟及測(cè)序步驟的方法進(jìn)行。
      [0016]進(jìn)一步的,在所述測(cè)序步驟后,包括分析測(cè)序結(jié)果,即根據(jù)所述測(cè)序結(jié)果判斷腫瘤靶向藥物的有效性。[0017]具體的,上述COLD-PCR擴(kuò)增步驟包括利用引物對(duì)對(duì)核酸樣品進(jìn)行第一擴(kuò)增步驟和第二擴(kuò)增步驟,第一擴(kuò)增步驟結(jié)束后進(jìn)入第二擴(kuò)增步驟。
      [0018]進(jìn)一步的,所述突變位點(diǎn)a-h各自對(duì)應(yīng)的COLD-PCR的引物對(duì)依次為:
      [0019]a:引物對(duì)A:上游引物為Seq ID N0.1所示序列,下游引物為Seq ID N0.2所示序列;
      [0020]b:引物對(duì)B:上游引物為Seq ID N0.3所示序列,下游引物為Seq ID N0.4所示序列;
      [0021]c:引物對(duì)C:上游引物為Seq ID N0.5所示序列,下游引物為Seq ID N0.6所示序列;
      [0022]d:引物對(duì)D:上游引物為Seq ID N0.7所示序列,下游引物為Seq ID N0.8所示序列;
      [0023]e:引物對(duì)E:上游引物為Seq ID N0.9所示序列,下游引物為Seq ID N0.10所示序列;
      [0024]f:引物對(duì)F:上游引物為Seq ID N0.11所示序列,下游引物為Seq ID N0.12所示序列;
      [0025]g:引物對(duì)G:上游引物為Seq ID N0.13所示序列,下游引物為Seq ID N0.14所示序列;
      [0026]h:引物對(duì)H:上游引物為Seq ID N0.15所示序列,下游引物為Seq ID N0.16所示`序列。
      [0027]上述第一擴(kuò)增步驟可為常規(guī)PCR擴(kuò)增,依次包括預(yù)變性、第一循環(huán)和終延伸,該第一循環(huán)依次包括變性、退火和延伸。上述第二擴(kuò)增依次包括預(yù)變性、第二循環(huán)和終延伸,該第二循環(huán)依次包括變性、雜交溫度處理、臨界溫度(Tc溫度)處理、退火和延伸。
      [0028]優(yōu)選的,上述第一擴(kuò)增步驟中,常規(guī)PCR可采用熒光PCR。
      [0029]上述第一循環(huán)和第二循環(huán)的退火中,其引物退火溫度的確定可包括以下步驟:利用上述關(guān)聯(lián)基因的參考序列設(shè)計(jì)引物,獲得引物對(duì)及引物退火溫度預(yù)定值。利用該引物對(duì),以該引物退火溫度預(yù)定值_5°C所得溫度值的±4°C范圍內(nèi)的不同溫度作為實(shí)驗(yàn)引物退火溫度對(duì)核酸樣品進(jìn)行常規(guī)PCR,得到不同溫度下的常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。在上述擴(kuò)增產(chǎn)物中選擇出最優(yōu)擴(kuò)增產(chǎn)物,以該最優(yōu)擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)引物退火溫度作為引物退火溫度。
      [0030]優(yōu)選的,最優(yōu)擴(kuò)增產(chǎn)物通過擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果確定。
      [0031]優(yōu)選的,引物的退火溫度,對(duì)應(yīng)上述A-H引物對(duì),依次為:
      [0032]引物對(duì)A:56_64°C,優(yōu)選 62°C,
      [0033]引物對(duì)B:56_64°C,優(yōu)選 62°C,
      [0034]弓丨物對(duì)C:56-64 0C,優(yōu)選 59 O,
      [0035]引物對(duì)D:56_64°C,優(yōu)選 61°C,
      [0036]弓丨物對(duì)E: 54-60 V,優(yōu)選 58 V,
      [0037]引物對(duì)F:56_64°C,優(yōu)選 62°C,
      [0038]弓丨物對(duì)G: 54-60 V,優(yōu)選 57 O,
      [0039]弓丨物對(duì)H: 54-60 V,優(yōu)選 58 V。
      [0040]上述第二循環(huán)的Tc溫度處理中,其Tc溫度的確定包括以下步驟:以上述引物對(duì)和上述引物退火溫度,對(duì)核酸樣品進(jìn)行常規(guī)PCR,確定常規(guī)PCR擴(kuò)增得到的樣品片段的Tm值。以上述引物對(duì)、上述引物退火溫度以及上述Tm值±2°C范圍內(nèi)的不同溫度作為實(shí)驗(yàn)Tc溫度,對(duì)突變型樣品進(jìn)行COLD-PCR,根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)Tc溫度下的COLD-PCR擴(kuò)增結(jié)果確定Tc溫度。
      [0041]優(yōu)選的,上述常規(guī)PCR可采用熒光PCR,根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線確定Tm值。
      [0042]上述突變型樣品包括突變序列。
      [0043]上述突變型樣品可選自真實(shí)樣品和模擬樣品中的至少一種。
      [0044]上述突變型樣品所含突變大于或等于1%。
      [0045]優(yōu)選的,臨界溫度,對(duì)應(yīng)上述A-H引物對(duì),依次為:
      [0046]引物對(duì)A:83.5-85.5°C,優(yōu)選 85°C,
      [0047]引物對(duì)B:81.5-83.5°C,優(yōu)選 83.1°C,
      [0048]引物對(duì)C:91.5-93.5°C,優(yōu)選 92.5°C,
      [0049]引物對(duì)D:86.5-88.5°C,優(yōu)選 87.3°C, [0050]引物對(duì)E:81.5-84.5°C,優(yōu)選 83.2V,
      [0051]引物對(duì)F:81.5-82.8°C,優(yōu)選 81.9°C,
      [0052]引物對(duì)G:76.5-79.5°C,優(yōu)選 78.3°C,
      [0053]引物對(duì)H:79-81 °C,優(yōu)選 80.4°C。
      [0054]另一方面,本申請(qǐng)還公開了一種富集腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的突變的方法,該富集突變的方法包括COLD-PCR擴(kuò)增步驟。腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因包括EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一種。
      [0055]優(yōu)選的,富集腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的突變包括富集上述突變位點(diǎn)a-h中的至少
      一類突變。
      [0056]進(jìn)一步優(yōu)選的,COLD-PCR擴(kuò)增步驟中采用的引物對(duì)選自上述引物對(duì)A、B、C、D、E、F、G和H中的至少一對(duì),該引物對(duì)A-H與突變位點(diǎn)a-h依次對(duì)應(yīng)。具體的,該富集突變的方法中,COLD-PCR擴(kuò)增步驟包括利用引物對(duì)對(duì)核酸樣品進(jìn)行第一擴(kuò)增步驟和第二擴(kuò)增步驟,第一擴(kuò)增步驟結(jié)束后進(jìn)入第二擴(kuò)增步驟。
      [0057]上述第一擴(kuò)增步驟可為常規(guī)PCR擴(kuò)增,依次包括預(yù)變性、第一循環(huán)和終延伸,該第一循環(huán)依次包括變性、退火和延伸。上述第二擴(kuò)增依次包括預(yù)變性、第二循環(huán)和終延伸,該第二循環(huán)依次包括變性、雜交溫度處理、臨界溫度(Tc溫度)處理、退火和延伸。優(yōu)選的,上述第一擴(kuò)增步驟中,常規(guī)PCR可采用熒光PCR。
      [0058]上述第一循環(huán)和第二循環(huán)的退火中,其引物退火溫度的確定可包括以下步驟:利用上述關(guān)聯(lián)基因的參考序列設(shè)計(jì)引物,獲得引物對(duì)及引物退火溫度預(yù)定值。利用該引物對(duì),以該引物退火溫度預(yù)定值_5°C所得溫度值的±4°C范圍內(nèi)的不同溫度作為實(shí)驗(yàn)引物退火溫度對(duì)核酸樣品進(jìn)行常規(guī)PCR,得到不同溫度下的常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。在上述擴(kuò)增產(chǎn)物中選擇出最優(yōu)擴(kuò)增產(chǎn)物,以該最優(yōu)擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)引物退火溫度作為引物退火溫度。
      [0059]優(yōu)選的,最優(yōu)擴(kuò)增產(chǎn)物通過擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果確定。
      [0060]優(yōu)選的,引物的退火溫度,對(duì)應(yīng)上述A-H引物對(duì),依次為: [0061]引物對(duì)A:56_64°C,優(yōu)選 62°C,[0062]引物對(duì)B:56_64°C,優(yōu)選 62°C,
      [0063]引物對(duì)C:56_64°C,優(yōu)選 59°C,
      [0064]引物對(duì)D:56_64°C,優(yōu)選 61°C,
      [0065]弓丨物對(duì)E: 54-60 V,優(yōu)選 58 V,
      [0066]引物對(duì)F:56_64°C,優(yōu)選 62°C,
      [0067]引物對(duì)G:54-60°C,優(yōu)選 57°C,
      [0068]弓丨物對(duì)H: 54-60 V,優(yōu)選 58 V。
      [0069]上述第二循環(huán)的Tc溫度處理中,其Tc溫度的確定包括以下步驟:以上述引物對(duì)和上述引物退火溫度,對(duì)核酸樣品進(jìn)行常規(guī)PCR,確定常規(guī)PCR擴(kuò)增得到的樣品片段的Tm值。以上述引物對(duì)、上述引物退火溫度以及上述Tm值±2°C范圍內(nèi)的不同溫度作為實(shí)驗(yàn)Tc溫度,對(duì)突變型樣品進(jìn)行C0LD-PCR,根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)Tc溫度下的COLD-PCR擴(kuò)增結(jié)果確定Tc溫度。
      [0070]優(yōu)選的,上述常規(guī)PCR可采用熒光PCR,根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線確定Tm值。
      [0071]上述突變型樣品包括突變序列。
      [0072]上述突變型樣品可選自真實(shí)樣品和模擬樣品中的至少一種。
      [0073]上述突變型樣品所含突變大于或等于1%。
      [0074]優(yōu)選的,臨界溫度,對(duì)應(yīng)上述A-H引物對(duì),依次為:
      [0075]引物對(duì)A:83.5-85.5°C,優(yōu)選 85°C,
      [0076]引物對(duì)B:81.5-83.5°C,優(yōu)選 83.1°C,
      [0077]引物對(duì)C:91.5-93.5°C,優(yōu)選 92.5°C,
      [0078]引物對(duì)D:86.5-88.5°C,優(yōu)選 87.3°C,
      [0079]引物對(duì)E:81.5-84.5°C,優(yōu)選 83.2V,
      [0080]引物對(duì)F:81.5-82.8°C,優(yōu)選 81.9°C, [0081]引物對(duì)G:76.5-79.5°C,優(yōu)選 78.3°C,
      [0082]引物對(duì)H:79-81 °C,優(yōu)選 80.4°C。
      [0083]同時(shí),本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘唤M引物對(duì),該引物對(duì)選自以上引物對(duì)A、B、C、D、E、F、G和H
      中的至少一對(duì)。
      [0084]該引物對(duì)可用于腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因、富集腫瘤靶向藥物基因的突變或腫瘤靶向藥物有效性的檢測(cè),該腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因?yàn)镋GFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一種。
      [0085]具體的,該引物對(duì)可用于COLD-PCR擴(kuò)增,且進(jìn)行COLD-PCR擴(kuò)增時(shí)的引物退火溫度,對(duì)應(yīng)上述A-H引物對(duì),依次為:
      [0086]引物對(duì)A:56_64°C,優(yōu)選 62°C,
      [0087]引物對(duì)B:56_64°C,優(yōu)選 62°C,
      [0088]引物對(duì)C:56_64°C,優(yōu)選 59°C,
      [0089]引物對(duì)D:56_64°C,優(yōu)選 61°C,
      [0090]弓丨物對(duì)E: 54-60 V,優(yōu)選 58 V,
      [0091]引物對(duì)F:56_64°C,優(yōu)選 62°C,[0092]弓丨物對(duì)G: 54-60 V,優(yōu)選 57 °C,
      [0093]弓丨物對(duì)H: 54-60 V,優(yōu)選 58 V。
      [0094]該弓丨物對(duì)可用于COLD-PCR擴(kuò)增,且進(jìn)行COLD-PCR擴(kuò)增時(shí)的Tc溫度,對(duì)應(yīng)上述A-H引物對(duì),依次為:
      [0095]引物對(duì)A:83.5-85.5°C,優(yōu)選 85°C,
      [0096]引物對(duì)B:81.5-83.5°C,優(yōu)選 83.1°C,
      [0097]引物對(duì)C:91.5-93.5°C,優(yōu)選 92.5°C,
      [0098]引物對(duì)D:86.5-88.5°C,優(yōu)選 87.3°C,
      [0099]引物對(duì)E:81.5-84.5°C,優(yōu)選 83.2V,
      [0100]引物對(duì)F:81.5-82.8°C,優(yōu)選 81.9°C,
      [0101]引物對(duì)G:76.5-79.5°C,優(yōu)選 78.3°C,
      [0102]引物對(duì)H:79-81 °C,優(yōu)選 80.4°C。
      [0103]本申請(qǐng)還提供了一種試劑,該試劑包括上述引物對(duì)。
      [0104]本申請(qǐng)同時(shí)還提供了一種`包括上述引物對(duì)或試劑的試劑盒。
      [0105]本申請(qǐng)的有益效果是:通過對(duì)EGFR,KRAS和BRAF三個(gè)基因的突變情況進(jìn)行檢測(cè),可以為腫瘤靶向藥物有效性提供指導(dǎo)。
      [0106]進(jìn)一步的,本申請(qǐng)針對(duì)EGFR,KRAS和BRAF三個(gè)基因的8類突變位點(diǎn),通過采用以本申請(qǐng)公開的引物對(duì)進(jìn)行COLD-PCR擴(kuò)增后測(cè)序的方法,可使得常規(guī)的PCR/sanger測(cè)序法檢測(cè)突變率的靈敏度從原來的20%提高到1%,從而大大的降低了檢測(cè)的假陰性率。
      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0107]圖1為本申請(qǐng)的一種【具體實(shí)施方式】中,采用引物對(duì)A對(duì)樣品進(jìn)行COLD-PCR和常規(guī)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳圖以及對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序的測(cè)序結(jié)果圖;
      [0108]圖2為本申請(qǐng)的一種【具體實(shí)施方式】中,采用引物對(duì)B對(duì)樣品進(jìn)行COLD-PCR和常規(guī)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳圖以及對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序的測(cè)序結(jié)果圖;
      [0109]圖3為本申請(qǐng)的一種【具體實(shí)施方式】中,采用引物對(duì)C對(duì)樣品進(jìn)行COLD-PCR和常規(guī)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳圖以及對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序的測(cè)序結(jié)果圖;
      [0110]圖4為本申請(qǐng)的一種【具體實(shí)施方式】中,采用引物對(duì)D對(duì)樣品進(jìn)行COLD-PCR和常規(guī)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳圖以及對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序的測(cè)序結(jié)果圖;
      [0111]圖5為本申請(qǐng)的一種【具體實(shí)施方式】中,采用引物對(duì)E對(duì)樣品進(jìn)行COLD-PCR和常規(guī)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳圖以及對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序的測(cè)序結(jié)果圖;
      [0112]圖6為本申請(qǐng)的一種【具體實(shí)施方式】中,采用引物對(duì)F對(duì)樣品進(jìn)行COLD-PCR和常規(guī)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳圖以及對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序的測(cè)序結(jié)果圖;
      [0113]圖7為本申請(qǐng)的一種【具體實(shí)施方式】中,采用引物對(duì)G對(duì)樣品進(jìn)行COLD-PCR和常規(guī)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳圖以及對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序的測(cè)序結(jié)果圖;
      [0114]圖8為本申請(qǐng)的一種【具體實(shí)施方式】中,采用引物對(duì)H對(duì)樣品進(jìn)行COLD-PCR和常規(guī)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳圖以及對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序的測(cè)序結(jié)果圖。
      【具體實(shí)施方式】[0115]目前,市場上已有的一些腫瘤靶向藥物主要是單克隆抗體藥物、小分子藥物和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)藥物。例如,易瑞沙和特羅凱作為表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)是用于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)靶向治療的主要藥物。EGFR基因突變是癌癥患者是否對(duì)TKI敏感的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子。研究發(fā)現(xiàn)KRAS基因、BRAF基因處于EGFR信號(hào)通路的下游,KRAS.BRAF基因突變時(shí),可以導(dǎo)致EGRF信號(hào)通路持續(xù)激活。研究還表明,抗EGFR單克隆抗體類藥物療效與結(jié)直腸癌患者KRAS基因突變有明顯相關(guān),只有KRAS基因野生型患者才可能對(duì)藥物治療有效,而突變型患者對(duì)藥物治療無效。BRAF基因突變的腫瘤患者對(duì)EGFR-TKI及EGFR單抗藥物治療不敏感,更易發(fā)生腫瘤惡化,總生存率低。由于瘤細(xì)胞生長增殖的基因信號(hào)傳導(dǎo)通路十分復(fù)雜涉及上游、下游的多個(gè)基因,因此有必要設(shè)計(jì)更有針對(duì)性的腫瘤靶向藥物有效性檢測(cè)方法。因此,本申請(qǐng)中對(duì)受體內(nèi)腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的基因突變情況進(jìn)行檢測(cè),該關(guān)聯(lián)基因包括EGFR基因,KRAS基因和BRAF基因中的至少一種。本申請(qǐng)中受體是指靶向藥物的被施予者,該受體可以是人體或動(dòng)物體等,具體可根據(jù)基因檢測(cè)的常規(guī)技術(shù)手段采用受體的離體樣品例如血液或毛發(fā)等提取出核酸樣品作為具體的檢測(cè)對(duì)象。通過對(duì)上述基因的檢測(cè)可為腫瘤靶向藥物有效性提供指導(dǎo)。
      [0116]本申請(qǐng)主要是檢測(cè)EGFR,KRAS和BRAF三個(gè)基因中的8類突變位點(diǎn)的突變情況,涉及EGFR基因的第18、19、20、21外顯子,KRAS基因的第2、3外顯子,BRAF基因的第15號(hào)外顯子。本申請(qǐng)中檢測(cè)的突變位點(diǎn)具體為:
      [0117]a、EGFR基因第709和/或719號(hào)密碼子,均位于EGFR基因第18外顯子上;
      [0118]b、EGFR基因第746-750號(hào)密碼子,位于EGFR基因第19外顯子上,本申請(qǐng)中主要檢測(cè)該段基因是否缺失;
      [0119]c、EGFR基因第790號(hào)密碼子,位于EGFR基因第20外顯子上; [0120]d、EGFR基因第858號(hào)密碼子,位于EGFR基因第21外顯子上;
      [0121]e、KRAS基因第12和/或第13號(hào)密碼子,位于KRAS基因第2外顯子;
      [0122]f、KRAS基因第61號(hào)密碼子,位于KRAS基因第3外顯子;
      [0123]g、KRAS基因第146號(hào)密碼子,位于KRAS基因第3外顯子;
      [0124]h、BRAF基因第600號(hào)密碼子,位于EGFR基因第15外顯子上。
      [0125]檢測(cè)位點(diǎn)的詳細(xì)信息可參見下表1:
      [0126]表1、關(guān)聯(lián)基因突變位點(diǎn)的詳細(xì)信息表點(diǎn)
      [0127]
      【權(quán)利要求】
      1.一種腫瘤靶向藥物有效性的檢測(cè)方法,包括檢測(cè)受體內(nèi)腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的基因突變情況,其特征在于,所述腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因包括EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一種;優(yōu)選的,所述檢測(cè)受體內(nèi)腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的基因突變情況包括檢測(cè)受體內(nèi)以下a-h中至少一類突變位點(diǎn)中的突變情況: a、EGFR基因第709和/或719號(hào)密碼子; b、EGFR基因第746-750號(hào)密碼子; c、EGFR基因第790號(hào)密碼子; d、EGFR基因第858號(hào)密碼子; e、KRAS基因第12和/或第13號(hào)密碼子; f、KRAS基因第61號(hào)密碼子; g、KRAS基因第146號(hào)密碼子; h、BRAF基因第600號(hào)密碼子。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法,其特征在于,所述檢測(cè)受體內(nèi)腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的基因突變情況是采用包括COLD-PCR擴(kuò)增步驟及測(cè)序步驟的方法進(jìn)行; 其中,所述COLD-PCR擴(kuò)增步驟包括利用引物對(duì)進(jìn)行第一擴(kuò)增步驟和第二擴(kuò)增步驟:所述第一擴(kuò)增步驟為常規(guī)PCR擴(kuò)增,包括預(yù)變性、第一循環(huán)和終延伸,所述第一循環(huán)包括變性、退火和延伸; 所述第二擴(kuò)增包括預(yù)變性、第二循環(huán)`和終延伸,所述第二循環(huán)包括變性、雜交溫度處理、臨界溫度處理、退火和延伸; 優(yōu)選的,所述引物對(duì),對(duì)應(yīng)所述a-h突變位點(diǎn),依次為: a:引物對(duì)A:上游引物為Seq ID N0.1所示序列,下游引物為Seq ID N0.2所示序列, b:引物對(duì)B:上游引物為Seq ID N0.3所示序列,下游引物為Seq ID N0.4所示序列, c:引物對(duì)C:上游引物為Seq ID N0.5所示序列,下游引物為Seq ID N0.6所示序列, d:引物對(duì)D:上游引物為Seq ID N0.7所示序列,下游引物為Seq ID N0.8所示序列, e:引物對(duì)E:上游引物為Seq ID N0.9所示序列,下游引物為Seq ID N0.10所示序列, f:引物對(duì)F:上游引物為Seq ID N0.11所示序列,下游引物為Seq ID N0.12所示序列, g:引物對(duì)G:上游引物為Seq ID N0.13所示序列,下游引物為Seq ID N0.14所示序列, h:引物對(duì)H:上游引物為Seq ID N0.15所示序列,下游引物為Seq ID N0.16所示序列; 優(yōu)選的,所述常規(guī)PCR為熒光PC R; 優(yōu)選的,所述退火中,其引物退火溫度的確定包括: 利用所述關(guān)聯(lián)基因的參考序列設(shè)計(jì)引物,獲得引物對(duì)及引物退火溫度預(yù)定值; 利用所述引物對(duì),以所述引物退火溫度預(yù)定值-5度所得溫度值的±4度范圍內(nèi)的溫度作為實(shí)驗(yàn)引物退火溫度對(duì)核酸樣品進(jìn)行常規(guī)PCR,得到擴(kuò)增產(chǎn)物; 選擇擴(kuò)增產(chǎn)物中的最優(yōu)擴(kuò)增產(chǎn)物,以所述最優(yōu)擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)引物退火溫度作為所述引物退火溫度; 優(yōu)選的,所述引物的退火溫度,對(duì)應(yīng)所述A-H引物對(duì),依次為: 引物對(duì)A:56-64°C,優(yōu)選62 °C, 引物對(duì)B:56-64°C,優(yōu)選62 °C,引物對(duì)C: 56-64 °C,優(yōu)選59 °C, 引物對(duì)D:56-64°C,優(yōu)選61°C, 引物對(duì)E: 54-60 V,優(yōu)選58 V, 引物對(duì)F:56-64°C,優(yōu)選62 °C, 引物對(duì)G: 54-60 V,優(yōu)選57 °C, 引物對(duì)H: 54-60 V,優(yōu)選58 V ; 優(yōu)選的,所述最優(yōu)擴(kuò)增產(chǎn)物通過擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果確定; 優(yōu)選的,所述第二循環(huán)中,其臨界溫度的確定包括: 以引物對(duì)和引物退火溫度,對(duì)核酸樣品進(jìn)行常規(guī)PCR,確定常規(guī)PCR擴(kuò)增得到的樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值; 以所述引物對(duì)、所述引物退火溫度以及所述Tm值±2度范圍內(nèi)的溫度作為實(shí)驗(yàn)臨界溫度,對(duì)突變型樣品進(jìn)行COLD-PCR,根據(jù)COLD-PCR擴(kuò)增結(jié)果確定臨界溫度; 優(yōu)選的,所述臨界溫度,對(duì)應(yīng)所述A-H引物對(duì),依次為:
      引物對(duì) A:83.5-85.5°C,優(yōu)選 85°C,
      引物對(duì) B:81.5-83.5°`C,優(yōu)選 83.1°C,
      引物對(duì) C:91.5-93.5°C,優(yōu)選 92.5°C,
      引物對(duì) D:86.5-88.5°C,優(yōu)選 87.3 °C,
      引物對(duì) E:81.5-84.5°C,優(yōu)選 83.2V,
      引物對(duì) F:81.5-82.8°C,優(yōu)選 81.9°C,
      引物對(duì) G: 76.5-79.5°C,優(yōu)選 78.3 °C, 引物對(duì) H:79-81°C,優(yōu)選 80.40C ; 優(yōu)選的,所述常規(guī)PCR采用熒光PCR,根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線確定Tm值; 優(yōu)選的,所述突變型樣品包括突變序列; 優(yōu)選的,所述突變型樣品選自真實(shí)樣品和模擬樣品中的至少一種; 優(yōu)選的,所述突變型樣品所含突變大于或等于1%。
      3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法,其特征在于,在所述測(cè)序步驟后,進(jìn)一步包括分析測(cè)序結(jié)果,根據(jù)所述測(cè)序結(jié)果判斷腫瘤靶向藥物有效性。
      4.一種富集腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的突變的方法,其特征在于,所述富集突變的方法包括COLD-PCR擴(kuò)增步驟; 所述腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因包括EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一種; 優(yōu)選的,所述富集腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的突變包括富集以下a-h中的至少一類突變: a、EGFR基因第709和/或719號(hào)密碼子, b、EGFR基因第746-750號(hào)密碼子, c、EGFR基因第790號(hào)密碼子, d、EGFR基因第858號(hào)密碼子, e、KRAS基因第12和/或第13號(hào)密碼子, f> KRAS基因第61號(hào)密碼子, g、KRAS基因第146號(hào)密碼子,h、BRAF基因第600號(hào)密碼子; 優(yōu)選的,所述COLD-PCR擴(kuò)增步驟包括利用引物對(duì)進(jìn)行第一擴(kuò)增步驟和第二擴(kuò)增步驟:所述第一擴(kuò)增步驟為常規(guī)PCR擴(kuò)增,包括預(yù)變性、第一循環(huán)和終延伸,所述第一循環(huán)包括變性、退火和延伸; 所述第二擴(kuò)增包括預(yù)變性、第二循環(huán)和終延伸,所述第二循環(huán)包括變性、雜交溫度處理、臨界溫度處理、退火和延伸; 優(yōu)選的,所述引物對(duì),對(duì)應(yīng)所述a-h突變位點(diǎn),依次為; a:引物對(duì)A:上游引物為Seq ID N0.1所示序列,下游引物為Seq ID N0.2所示序列, b:引物對(duì)B:上游引物為Seq ID N0.3所示序列,下游引物為Seq ID N0.4所示序列, c:引物對(duì)C:上游引物為Seq ID N0.5所示序列,下游引物為Seq ID N0.6所示序列, d:引物對(duì)D:上游引物為Seq ID N0.7所示序列,下游引物為Seq ID N0.8所示序列, e:引物對(duì)E:上游引物為Seq ID N0.9所示序列,下游引物為Seq ID N0.10所示序列, f:引物對(duì)F:上游引物為Seq ID N0.11所示序列,下游引物為Seq ID N0.12所示序列, g:引物對(duì)G:上游引物為Seq ID N0.13所示序列,下游引物為Seq ID N0.14所示序列, h:引物對(duì)H:上游引物為Seq ID N0.15所示序列,下游引物為Seq ID N0.16所示序列; 優(yōu)選的,所述常規(guī)PCR為熒光PCR; 優(yōu)選的,所述退火中,其引物退火溫度的確定包括: 利用所述關(guān)聯(lián)基因的參考序列設(shè)計(jì)引物,獲得引物對(duì)及引物退火溫度預(yù)定值; 利用所述引物對(duì),以所述引物退火溫度預(yù)定值-5度所得溫度值的±4度范圍內(nèi)的溫度作為實(shí)驗(yàn)引物退火溫度對(duì)核酸樣品進(jìn)行常規(guī)PCR,得到擴(kuò)增產(chǎn)物; 選擇擴(kuò)增產(chǎn)物中的最優(yōu)擴(kuò)增產(chǎn)物,以所述最優(yōu)擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)引物退火溫度作為所述引物退火溫度; 優(yōu)選的,所述引物的退火溫度,對(duì)應(yīng)所述A-H引物對(duì),依次為: 引物對(duì)A:56-64°C,優(yōu)選62 °C, 引物對(duì)B:56-64°C,優(yōu)選62 °C, 引物對(duì)C: 56-64 °C,優(yōu)選59 °C, 引物對(duì)D:56-64°C,優(yōu)選61°C, 引物對(duì)E: 54-60 V,優(yōu)選58 V, 引物對(duì)F:56-64°C,優(yōu)選62 °C, 引物對(duì)G: 54-60 V,優(yōu)選57 °C, 引物對(duì)H: 54-60 V,優(yōu)選58 V ; 優(yōu)選的,所述最優(yōu)擴(kuò)增產(chǎn)物通過擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果確定; 優(yōu)選的,所述第二循環(huán)中,其臨界溫度的確定包括: 以引物對(duì)和引物退火溫度,對(duì)核酸樣品進(jìn)行常規(guī)PCR,確定常規(guī)PCR擴(kuò)增得到的樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值; 以所述引物對(duì)、所述引物退火溫度以及所述Tm值±2度范圍內(nèi)的溫度作為實(shí)驗(yàn)臨界溫度,對(duì)突變型樣品進(jìn)行C0LD-PCR,根據(jù)COLD-PCR擴(kuò)增結(jié)果確定臨界溫度; 優(yōu)選的,所述臨界溫度,對(duì)應(yīng)所述A-H引物對(duì),依次為:引物對(duì) A:83.5-85.5°C,優(yōu)選 85°C,
      引物對(duì) B:81.5-83.5°C,優(yōu)選 83.1°C,
      引物對(duì) C:91.5-93.5°C,優(yōu)選 92.5°C,
      引物對(duì) D:86.5-88.5°C,優(yōu)選 87.3°C,
      引物對(duì) E:81.5-84.5°C,優(yōu)選 83.2V,
      引物對(duì) F:81.5-82.8°C,優(yōu)選 81.9°C,
      引物對(duì) G:76.5-79.5°C,優(yōu)選 78.3°C, 引物對(duì) H:79-81°C,優(yōu)選 80.4°C ; 優(yōu)選的,所述常規(guī)PCR采用熒光PCR,根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線確定Tm值; 優(yōu)選的,所述突變型樣品包括突變序列; 優(yōu)選的,所述突變型樣品選自真實(shí)樣品和模擬樣品中的至少一種; 優(yōu)選的,所述突變型樣品所含突變大于或等于1%。
      5.一組引物對(duì),其特征在于,所述引物對(duì)選自以下引物對(duì)A、B、C、D、E、F、G和H中的至少一對(duì): 引物對(duì)A:上游引物為Seq ID N0.1所示序列,下游引物為Seq ID N0.2所示序列; 引物對(duì)B:上游引物為Seq ID N0.3所`示序列,下游引物為Seq ID N0.4所示序列; 引物對(duì)C:上游引物為Seq ID N0.5所示序列,下游引物為Seq ID N0.6所示序列; 引物對(duì)D:上游引物為Seq ID N0.7所示序列,下游引物為Seq ID N0.8所示序列; 引物對(duì)E:上游引物為Seq ID N0.9所示序列,下游引物為Seq ID N0.10所示序列; 引物對(duì)F:上游引物為Seq ID N0.11所示序列,下游引物為Seq ID N0.12所示序列; 引物對(duì)G:上游引物為Seq ID N0.13所示序列,下游引物為Seq ID N0.14所示序列; 引物對(duì)H:上游引物為Seq ID N0.15所示序列,下游引物為Seq ID N0.16所示序列。
      6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的引物對(duì),其特征在于,所述引物對(duì)用于腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的檢測(cè)、富集腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的突變或腫瘤靶向藥物有效性的檢測(cè),所述腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因?yàn)镋GFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一種。
      7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的引物對(duì),其特征在于:所述引物對(duì)用于COLD-PCR擴(kuò)增,且進(jìn)行COLD-PCR擴(kuò)增時(shí)的臨界溫度分別為:
      引物對(duì) A:83.5-85.5 °C,優(yōu)選 85 °C ;
      引物對(duì) B:8L 5-83.5°C,優(yōu)選 83.1°C ;
      引物對(duì) C:9L 5-93.5°C,優(yōu)選 92.5°C ;
      引物對(duì) D:86.5-88.5 °C,優(yōu)選 87.3 °C ;
      引物對(duì) E:8L 5-84.5°C,優(yōu)選 83.2°C ; 引物對(duì)?:81.5-82.81:,優(yōu)選81.91:;
      引物對(duì) G:76.5-79.5°C,優(yōu)選 78.3°C ;
      弓 I 物對(duì) H: 79-81V,優(yōu)選 80.40C ο
      8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的引物對(duì),其特征在于:所述引物對(duì)用于COLD-PCR擴(kuò)增,且進(jìn)行COLD-PCR擴(kuò)增時(shí)的退火溫度分別為: 引物對(duì)A:56-64°C,優(yōu)選62 °C, 引物對(duì)B:56-64°C,優(yōu)選62 °C,引物對(duì)C: 56-64 °C,優(yōu)選59 °C, 引物對(duì)D:56-64°C,優(yōu)選61°C, 引物對(duì)E: 54-60 V,優(yōu)選58 V, 引物對(duì)F:56-64°C,優(yōu)選62 °C, 引物對(duì)G: 54-60 V,優(yōu)選57 °C, 引物對(duì)H: 54-60 V,優(yōu)選58 V。
      9.一種試劑或試劑盒,其特征在于,所述試劑包括如權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述的引物對(duì),所述試劑盒包括所述`試劑或權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述的引物對(duì)。
      【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103865993SQ201210551712
      【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月18日
      【發(fā)明者】林楚瑜, 王靜靜, 席鳳, 管彥芳 申請(qǐng)人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司
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