本發(fā)明涉及一種共表達熱激蛋白提高外源蛋白表達量的方法，屬于酶工程技術領域。

背景技術：

畢赤酵母(komagataellaphaffii，k.phaffii，原命名為pichiapastoris)是重要的蛋白表達平臺微生物，能以甲醇或者甘油作為單一的碳源和能源，其中甲醇可作為誘導劑，誘導醇氧化酶(aox1)啟動子。畢赤酵母表達系統(tǒng)和其它蛋白表達系統(tǒng)相比較，具備如下優(yōu)勢：具有強誘導性和強啟動性啟動子，利于外源基因高效表達；蛋白質(zhì)加工折疊和翻譯后修飾的作用，使外源蛋白的結構與天然蛋白相似，從而表現(xiàn)出一定的生物活性；上清液中內(nèi)源蛋白分泌量非常少，有利于表達產(chǎn)物的分離純化；外源基因與畢赤酵母染色體通過基因重組的方式整合，避免了外源基因的丟失，為外源蛋白插入酵母并穩(wěn)定傳代提供了可能。

提高畢赤酵母外源蛋白的表達量是當前微生物研究的重要課題之一，在工業(yè)中畢赤酵母中高效表達外源蛋白具有相當高的應用價值。畢赤酵母基因組序列的解讀，有利于根據(jù)高產(chǎn)蛋白的特定屬性來改良菌株品系。目前已有多種外源蛋白在畢赤酵母中取得較好的表達效果。

迄今大多數(shù)研究都集中在優(yōu)化發(fā)酵條件，建立發(fā)酵條件與外源蛋白產(chǎn)量之間關系。但是這種簡單的對應關系，未能明確發(fā)酵菌株與蛋白產(chǎn)量之間聯(lián)系的依據(jù)。

此外，利用畢赤酵母生產(chǎn)具有較高酶活性的蛋白還面臨一些難題，比如，雖高蛋白表達量，酶活性較低。有研究報道利用伴侶蛋白來促進外源蛋白的折疊，從而提高蛋白的表達水平，以及比活力。如smit等通過共表達kar2的方式提高了釀酒酵母中葡萄糖苷酶的表達量；盧鑫等在畢赤酵母中共表達伴侶蛋白(pdi和ero1)提高了米根霉脂肪酶的產(chǎn)量；沙沖等進一步研究發(fā)現(xiàn)同時共表達伴侶蛋白pdi和ero1，多種伴侶蛋白通過協(xié)同作用，可較大程度提高外源蛋白的活力。另有研究報道，共表達伴侶蛋白并不能提高外源蛋白的表達水平，在有些情況下反而使得外源蛋白的表達水平降低，如當在釀酒酵母中共表達scj1時，外源蛋白人白蛋白的表達水平降低了60％(antioxidants&redoxsignaling,2014,21:414-437)。

目前僅僅局限在利用少數(shù)幾種伴侶蛋白進行共表達來提高外源蛋白的表達量，急需在研究畢赤酵母高效表達機制的基礎上開發(fā)其他新型的能夠促進外源蛋白表達的因子。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種提高畢赤酵母中外源蛋白表達量的方法，所述方法是在表達外源目的蛋白的同時過表達熱激蛋白sti1、fes1、cpr6中的任意一種或者多種。

在一種實施方式中，所述熱激蛋白sti1、fes1、cpr6是來源于畢赤酵母的熱激蛋白。

在一種實施方式中，所述熱激蛋白sti1、fes1、cpr6的氨基酸序列分別如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3所示。

在一種實施方式中，所述外源目的蛋白可以是磷脂酶、脯氨酰內(nèi)肽酶、脂肪酶、蛋白酶、糖化酶等。

在一種實施方式中，所述方法是在同一宿主中表達外源蛋白和所述熱激蛋白。

在一種實施方式中，所述宿主為畢赤酵母。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種外源蛋白表達量提高的畢赤酵母重組菌，所述畢赤酵母重組菌在表達外源目的蛋白的基礎上，還同時過表達了熱激蛋白sti1、fes1、cpr6中的任意一種或者多種。

在一種實施方式中，所述表達熱激蛋白sti1、fes1、cpr6的氨基酸序列分別如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3所示。

在一種實施方式中，所述外源目的蛋白可以是磷脂酶、脯氨酰內(nèi)肽酶、脂肪酶、蛋白酶、糖化酶等。

在一種實施方式中，所述外源目的蛋白為紫紅鏈霉菌磷脂酶a2。

在一種實施方式中，所述畢赤酵母重組菌是以畢赤酵母gs115、x33、km71、km71h、smd1168、smd1163等中的任意一種為宿主菌構建得到的。

在一種實施方式中，所述畢赤酵母重組菌是以ppic9k、ppicza/b/c、ppic9k-his、ppic3.5k、ppiczalphaa/b/c、pgapzalpha、pao815、phil-s1、ppinkhc等中的任意一種為質(zhì)粒載體構建得到的。

本發(fā)明的第三個目的是提供所述畢赤酵母重組菌的應用。

在一種實施方式中，所述應用是應用于食品、釀造、造紙、制革、制糖、化工等領域，更具體地，是應用于食品與釀造領域。

本發(fā)明的優(yōu)點和效果：

本發(fā)明通過在表達外源目的蛋白的同時過表達熱激蛋白sti1、fes1、cpr6，顯著提高了外源目的蛋白的表達量。

附圖說明

圖1為共表達熱激蛋白和磷脂酶的重組菌株的搖瓶發(fā)酵菌體濃度生長曲線；

圖2為共表達熱激蛋白和磷脂酶的重組菌株的搖瓶發(fā)酵菌體濃度生長曲線；

圖3為共表達熱激蛋白相關基因菌株的搖瓶發(fā)酵蛋白濃度曲線；

圖4為共表達熱激蛋白相關基因菌株的搖瓶發(fā)酵蛋白濃度曲線；

圖5為共表達熱激蛋白相關基因菌株的搖瓶發(fā)酵上清液酶活曲線；

圖6為共表達熱激蛋白相關基因菌株的搖瓶發(fā)酵上清液酶活曲線；

圖7為共表達熱激蛋白產(chǎn)脯氨酰內(nèi)肽酶的重組菌菌體生長曲線；

圖8為共表達熱激蛋白產(chǎn)脯氨酰內(nèi)肽酶的重組菌產(chǎn)蛋白濃度曲線；

圖9為共表達熱激蛋白產(chǎn)脯氨酰內(nèi)肽酶的重組菌的脯氨酰內(nèi)肽酶酶活曲線。

具體實施方案

(1)生物量測定

采用細胞干重(dcw)表示。取樣后置于離心機中離心(12000r·min^-1，6min)，將菌體保留，加生理鹽水懸浮菌體，重復離心去上清，然后放置在90℃烘箱中烘干得細胞干重。

(2)蛋白含量測定

利用考馬斯亮藍法測定發(fā)酵液上清中總蛋白濃度。取上述發(fā)酵上清液，測定595nm波長下測吸光度，每組設置三個平行，計算上清液中總蛋白濃度。

(3)磷脂酶活力測定

使用spla2assaykit測定磷脂酶a2酶活力，方法步驟見說明書。

(4)脯氨酰內(nèi)肽酶酶活力測定方法

具體操作步驟見文獻(journalofmolecularcatalysisb:enzymatic,2016,125:81-87)。酶活計算公式為：

其中，u·ml^-1：酶活力單位；δa：反應體系吸光度變化；v：總反應體系(ml)；v：發(fā)酵液體積(ml)；γ：摩爾消光系數(shù)(cm²·mol^-1)；β：比色杯光程(cm)。

下面是對本發(fā)明進行具體描述。

實施例1：共表達熱激蛋白相關基因菌株的構建

以小分子量蛋白磷脂酶(21kd)以及大分子量蛋白脯氨酰內(nèi)肽酶(66kd)兩種蛋白作為外源目的蛋白表達對象，構建共表達熱激蛋白相關基因的重組菌株。

具體是：

(1)利用pcr方法獲取畢赤酵母中熱激蛋白(sti1，fes1，cpr6和ssa1)的基因序列(核苷酸序列分別如seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7所示)，并在序列兩端添加酶切位點。以ppicza為載體，使用限制性內(nèi)切酶酶asuii和noti，酶切上述基因和載體。利用t4dna連接酶鏈接目的基因和載體，轉(zhuǎn)化至dh5α感受態(tài)細胞，篩選驗證獲得重組質(zhì)粒。

(2)將上述構建的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶saci或pmei酶切線性化，膠回收目的片段，分別電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞(畢赤酵母k.phaffiigs115/ppic9k-mlmh、gs115/ppic9k-pla2-1和gs115/ppic9k-pla2-12感受態(tài)細胞)，培養(yǎng)并驗證陽性菌株，得到了如表1所示的畢赤酵母重組菌。

其中，表達紫紅鏈霉菌磷脂酶a2的畢赤酵母菌株k.phaffiigs115/ppic9k-pla2-1(含1拷貝磷脂酶基因)、k.phaffiigs115/ppic9k-pla2-12(含12拷貝磷脂酶基因)為本實驗室之前構建的菌株(參見：劉愛霞，碩士畢業(yè)論文，江南大學，2015年)。gs115/ppic9k-mlmh代表以k.phaffiigs115為宿主、ppic9k為載體，重組表達了脯氨酰內(nèi)肽酶融合蛋白mlmh的重組菌，具體是從質(zhì)粒ppicza-mlmh(journalofmolecularcatalysisb:enzymatic,2016,125:81-87)中pcr克隆得到mlmh基因，通過酶切連接構建質(zhì)粒ppic9k-mlmh，然后轉(zhuǎn)化到k.phaffiigs115宿主中得到gs115/ppic9k-mlmh。

表1共表達熱激蛋白和外源目的蛋白的畢赤酵母重組菌列表

實施例2：

以小分子量蛋白磷脂酶(21kd)以及大分子量蛋白脯氨酰內(nèi)肽酶(66kd)兩種蛋白作為外源目的蛋白表達對象，分析含有熱激蛋白相關基因的重組菌株對外源目的蛋白表達的影響。

其中畢赤酵母搖瓶發(fā)酵方法如下：

將甘油管保藏菌株用平板劃線法培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)3–5d。挑取單克隆至bmgy培養(yǎng)基中，在30℃200r·min^-1條件下培養(yǎng)16h–18h至od600達到2–6。將菌液在無菌條件下轉(zhuǎn)移至無菌的離心管中，在6000r·min^-1條件下離心10min，棄掉上清收集菌體，用bmmy培養(yǎng)基重懸菌體，28℃250r·min^-1條件下培養(yǎng)，每24h添加1％的甲醇誘導表達，定時取樣測定發(fā)酵液的菌體濃度和發(fā)酵上清液的蛋白濃度。

(1)產(chǎn)磷脂酶重組菌株共表達熱激蛋白相關基因的搖瓶發(fā)酵結果

將構建的共表達熱激蛋白菌株(表1)與出發(fā)菌株(gs115/ppic9k-pla-1和gs115/ppic9k-pla-12)進行搖瓶發(fā)酵。結果顯示，在96h發(fā)酵周期內(nèi)，菌株的菌體濃度(od600)幾乎完全一致，各菌株的生長趨勢基本一致，不同共表達菌株間沒有明顯差異，od600都在72h達到最大值，然后開始下降。由此可見，共表達蛋白對菌株生長沒有明顯影響(圖1～圖2)。

搖瓶發(fā)酵結果表明，在84h時共表達熱激蛋白菌株的胞外總蛋白濃度都達到最大值。共表達同一熱激蛋白相關基因，含有高拷貝磷脂酶基因的菌株發(fā)酵胞外總蛋白濃度及胞外磷脂酶活力高于低拷貝菌株(圖3～圖6)。共表達熱激蛋白對含有不同拷貝數(shù)磷脂酶基因菌株的影響趨勢一致，其中提高胞外磷脂酶活力倍數(shù)最大的是sti1，達到1.51倍，然后依次是fes1，ssa1和cpr6。

從圖5中可以看出，共表達sti1、fes1、ssa1、cpr6和1拷貝磷脂酶基因的重組菌在發(fā)酵84h下達到的酶活分別為0.63u·l^-1、0.58u·l^-1、0.52u·l^-1、0.45u·l^-1，相比對照菌株gs115/ppic9k-pla-1，分別提高了1.51倍、1.39倍、1.24倍、1.08倍。

從圖6中可以看出，共表達sti1、fes1、ssa1、cpr6和12拷貝磷脂酶基因的重組菌在發(fā)酵84h下達到的酶活分別為0.67u·l^-1、0.64u·l^-1、0.57u·l^-1、0.56u·l^-1，相比對照菌株gs115/ppic9k-pla-12，分別提高了1.24倍、1.19倍、1.05倍、1.04倍。

(2)產(chǎn)脯氨酰內(nèi)肽酶重組菌株共表達熱激蛋白相關基因搖瓶發(fā)酵

以表達脯氨酰內(nèi)肽酶基因的畢赤酵母作為對照菌株，分析共表達熱激蛋白對其的影響，結果如圖7、圖8、圖9所示。

如圖7、圖8所示，共表達菌株與對照菌株(k.phaffiigs115/ppic9k-mlmh)菌體濃度(od600)生長趨勢相似。當發(fā)酵96h時，共表達fes1使得胞外總蛋白濃度由0.20g·l^-1提升至0.26g·l^-1，而ssa1、cpr6、sti1菌株，胞外總蛋白濃度依次是0.25g·l^-1、0.24g·l^-1、0.23g·l^-1。上述共表達基因fes1、ssa1、cpr6、ti1的重組菌，與對照相比，胞外總蛋白濃度分別提高了1.30倍、1.25倍、1.20倍、1.15倍。

如圖9所示，共表達熱激蛋白也同樣能夠提高脯氨酰內(nèi)肽酶的表達水平，提高程度依次是fes1，ssa1，cpr6和sti1。當發(fā)酵96h時，共表達菌株的酶活達到了最高。共表達菌株fes1、cpr6、ssa1、sti1的酶活分別為210u·l^-1、195u·l^-1、190u·l^-1、185u·l^-1，與對照菌gs115/ppic9k-mlmh的酶175u·l^-1相比，分別提高了1.20倍、1.11倍、1.09倍、1.06倍。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。

序列表

<110>江南大學

<120>一種共表達熱激蛋白提高外源蛋白表達量的方法

<160>7

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>572

<212>prt

<213>人工序列

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<213>人工序列

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