專利名稱：全合成蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程的熒光假單胞工程菌(pseudomonas fluorescens)，更具體地說全合成蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因。
蘇云金桿菌(Bacitlus thuringiensis簡(jiǎn)稱Bt)是國(guó)內(nèi)外最重要的生物殺蟲劑，它產(chǎn)生的晶體蛋白對(duì)鱗翅目、雙翅目和鞘翅目昆蟲具殺傷活性，而對(duì)人畜無(wú)害。Bt蛋白在田間易分解，對(duì)環(huán)境的污染小，另外，害蟲對(duì)Bt產(chǎn)生抗性的過程明顯長(zhǎng)于化學(xué)農(nóng)藥。從人類可持續(xù)發(fā)展的角度考慮，Bt殺蟲劑將把化學(xué)殺蟲劑慢慢排擠出去。迄今全世界已有100多種Bt產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)，年銷售額超過1億美元。這些產(chǎn)品被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)及林業(yè)害蟲的防治。
國(guó)內(nèi)外大多數(shù)Bt產(chǎn)品來(lái)自于天然的蘇云金桿菌，不同的菌株殺蟲譜存在較大差異，殺蟲毒力相差很大。分離菌株對(duì)害蟲的殺蟲譜含擴(kuò)了鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、食毛目和蜱螨目等，它們分別代表45種不同的血清型。到目前為止，從這些Bt中發(fā)現(xiàn)100多個(gè)cry基因，根據(jù)cry蛋白的氨基酸順序關(guān)聯(lián)性，這些基因分成了17個(gè)大組。蘇云金桿菌可以從土壤、植物表面以及昆蟲體內(nèi)分離得到，但是篩選高毒力、殺蟲譜廣的蘇云金桿菌需要投入大量的人力和物力；此外由于蘇云金桿菌發(fā)酵條件要求嚴(yán)格，發(fā)酵密度很難提高；再加上細(xì)菌發(fā)酵形成芽孢過程中，容易導(dǎo)致菌體自溶，產(chǎn)品不穩(wěn)定。隨著Bt產(chǎn)品市場(chǎng)需求越來(lái)越大，傳統(tǒng)Bt產(chǎn)品已不能適應(yīng)生產(chǎn)需要。
重組DNA技術(shù)為構(gòu)建新的cry基因提供了更大的靈活性，利用基因工程技術(shù)能夠克隆單獨(dú)的cry基因，還可以通過改變cry基因的調(diào)控序列來(lái)提高殺蟲蛋白的表達(dá)量。
許多實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的載體質(zhì)粒已廣泛應(yīng)用到cry基因的克隆與表達(dá)中。這些種類和數(shù)目繁多的各類cry基因表達(dá)載體已經(jīng)轉(zhuǎn)化到Bt(Takashi，1993；Bruce，1993殺蟲工程進(jìn)展)、大腸桿菌(范云六，1991，科學(xué)通報(bào))、農(nóng)桿菌(郭三堆，1991，生物工程學(xué)報(bào))、枯草芽孢桿菌(余學(xué)政，1990，生物工程學(xué)報(bào))，巨大芽孢桿菌(Bora，1994，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué))、蠟仗芽孢桿菌(Moar，1994，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué))以及各種植物組織中(謝道晰，1991，中國(guó)科學(xué))，美國(guó)的作物遺傳研究所甚至把克隆的Bt毒蛋白基因?qū)胱魑飪?nèi)生菌中，但是這些工程菌還很難推向市場(chǎng)，其中有以下原因(1)來(lái)自蘇云金桿菌的Bt毒蛋白基因在不同的宿主菌中表達(dá)量很低，需要大劑量的細(xì)菌才能起到防蟲殺蟲效果；(2)包括大腸桿菌在內(nèi)的很多細(xì)菌含有內(nèi)毒素，對(duì)人體有害，如果Bt毒蛋白作為粗制產(chǎn)品使用，具有極大的危害，如果作為純化產(chǎn)品使用，將大大提高成本；(3)Bt毒蛋白基因如果在細(xì)菌或植物細(xì)胞中組成型表達(dá)，田間釋放后對(duì)環(huán)境將構(gòu)成很大的壓力，抗蟲蛋白功能極容易丟失。
在國(guó)內(nèi)，有多家研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行了Bt基因的克隆和原核表達(dá)載體的構(gòu)建工作。劉子鐸等利用廣宿主質(zhì)粒pSUP106將Bt基因轉(zhuǎn)化到熒火假單胞菌中，通過SDS-PAGE分析，可以檢測(cè)Bt基因的表達(dá)，中國(guó)農(nóng)科院張光炳等利用Tn5轉(zhuǎn)座子將Bt基因轉(zhuǎn)化到熒光假單胞菌染色體上，Westernblotting檢測(cè)出Bt基因表達(dá)。但這些研究思路都不成熟，(1)直接利用蘇云金桿菌的野生型基因，影響了基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯；(2)都采用組成型表達(dá)，發(fā)酵密度不高；(3)拷貝數(shù)低，難以實(shí)現(xiàn)高表達(dá)；(4)只能用死菌防止害蟲。研究不夠深入從而影響其應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明目的全合成適合熒光假單胞工程菌高表達(dá)殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因。
本發(fā)明另一目的利用全合成高表達(dá)殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因用于生物防治。
本發(fā)明采用熒光假單胞菌作為Bt基因表達(dá)的宿主菌，根據(jù)熒光假單胞菌的偏愛密碼全合成1.8kb CryIA(c)Bt基因。
CryIA(c)Bt基因合成采用重疊延伸PCR方法，結(jié)合高保真的PWO耐高溫DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分兩段進(jìn)行合成，第一段從ATG起始密碼到1424PstI位點(diǎn)(Bio/technology，1990，8939-943)，共有1429bp核苷酸；第二段從1424PstI位點(diǎn)到終止密碼TGA，共有424bp核苷酸。利用T4連接酶將合成片段在PstI位點(diǎn)連接成完整的基因。合成基因與野生型基因相比，核苷酸的同源性僅為66.8％；616個(gè)密碼子中有496個(gè)密碼子核苷酸改變；整個(gè)基因的核苷酸組成發(fā)生了變化，增加了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的堿基含量，其中G+C的含量由37.2％提高到64％；mRNA不穩(wěn)定的AT核苷酸積聚區(qū)域序列全部替換；并改動(dòng)了4個(gè)易形成二級(jí)發(fā)卡結(jié)構(gòu)區(qū)域核苷酸序列，291-304 TTCTAGATTAGAA；441-465TTTGCAGTTCAAAATTATCAATTT；622-633 GTACGCTGGT AC；1039-1054CAACAACGTATTGTTG。
全合成CryIA(c)Bt(BT1)基因核苷酸序列如下BTI - ATGGACAACAACCCGAACATCAACGAATGGATTCCGTACAACTGCCTGAGCAACC -55BTI - CGGAAGTGGAAGTGCTGGGCGGCGAACGCATCGAAACCGGCTACACCCCGATTGA -110BTI - CATCAGCCTGAGCCTGACCCAGTTCCTGCTGAGCGAGTTCGTGCCGGGCGCCGGC -165BTI - TTCGTGCTGGGCCTGGTGGACATCATCTGGGGCATCTTCGGCCCGAGCCAGTGGG -220BTI - ACGCCTTCCTGGTGCAGATCGAACAGCTGATCAACCAGCGCATCGAAGAGTTCGC -275BTI - CCGCAACCAGGCCATCAGCCGCCTGGAAGGCCTGAGCAACCTGTACCAGATTTAC -330BTI - GCCGAATCCTTCCGCGAATGGGAAGCCGACCCGACCAACCCGGCCCTGCGCGAAG -385BTI - AAATGCGCATCCAGTTCAACGACATGAACAGCGCCCTGACCACCGCCATCCCGCT -440BTI - GTTCGCCGTGCAGAACTACCAGTTCCCGCTGCTGAGCGTGTACGTGCAGGCCGCC -495BTI - AACCTGCACCTGAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTTCGGCCAGCGCTGGGGCT -550BTI - TCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAA -605BTI - CTACACCGACCACGCCGTGCGCTGGTACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGGT -660BTI - CCGGACAGCCGCGACTGGATTCGCTACAACCAGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGA -715BTI - CCGTGCTGGACATCGTGAGCCTGTTCCCGAACTACGACAGCCGCACCTACCCGAT -770BTI - CCGCACCGTGAGCCAGCTGACCCGCGAAATCTACACCAACCCGGTGCTGGAAAAC -825BTI- TTCGACGGCAGCTTCCGCGGCAGCGCCCAGGGCATCGAAGGCAGCATCCGCAGCC -880BTI- CGCACCTGATGGACATCGTGAACAGCATCACCATCTACACCGACGCCCACCGCGG -935BTI- CGAATACTACTGGAGCGGCCACCAGATCATGGCCAGCCCGGTGGGCTTCAGCGGC -990BTI- CCGGAGTTCACCTTCCCGCTGTACGGCACGATGGGCAACGCCGCCCCGCAGCAGC -1045BTI- GCATCGTGGCCCAGCTGGGCCAGGGCGTGTACCGCACCCTGAGCAGCACCCTGTA -1100BTI- CCGCCGCCCGTTCAACATCGGCATCAACAACCAGCAGCTGAGCGTGCTGGACGGC -1155BTI- ACCGAGTTCGCCTACGGCACCAGCAGCAACCTGCCGAGCGCCGTGTACCGCAAGA -1210BTI- GCGGCACCCTGGACAGCCTGGACGAAATCCCGCCGCAGAACAACAACGTGCCGCC -1265BTI- GCGCCAGGGCTTCAGCCACCGCCTGAGCCACGTGAGCATGTTCCGCAGCGGCTTC -1320BTI- AGCAACACCAGCGTGAGCATCATCCGCGCCCCGATGTTCAGCTGGATTCACCGCA -1375BTI- GCGCCGAGTTCAACAACATCATCGCCAGCGACAGCATCACCCAGATCCCTGCAGT -1430BTI- GAAAGGCAACTTCCTGTTCAACGGCAGCGTGATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGC -1485BTI- GGCGACCTGGTGCGCCTGAACAGCAGCGGCAACAACATCCAGAACCGCGGCTACA -1540BTI- TCGAAGTGCCGATCCACTTCCCGAGCACCAGCACCCGCTACCGCCTGCGCGTGCG -1595BTI- CTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACTGGGGCAACAGCAGCATC -1650BTI- TTCAGCAACACCGTGCCGGCCACCGCCACCAGCCTGGACAACCTCCAGAGCAGCG -1705BTI- ACTTCGGCTACTTCGAAAGCGCCAACGCCTTCACCAGCAGCCTGGGCAACATCGT -1760BTI- GGGCGTGCGCAACTTCAGCGGCACCGCCGGCGTGATCATCGACCGCTTCGAGTTC -1815BTI- ATCCCGGTGACGGCCACCCTGGAAGCCGAATGA -1848全合成CryIA(c)Bt(BT1)基因和野生型基因(BT)核苷酸序列比較。兩基因的同源性為66.8％，616個(gè)密碼子中有496個(gè)密碼子核苷酸改變，以適應(yīng)熒光假單胞菌中翻譯表達(dá)。改動(dòng)了4個(gè)易形成二級(jí)發(fā)卡結(jié)構(gòu)區(qū)域核苷酸序列，291-304 TTCTAGATTAGAA；441-465TTTGCAGTTCAAAATTATCAATTT；622-633 GTACGCTGGT AC；1039-1054 CAACAACGTATTGTTG。改動(dòng)了23個(gè)富含AT的區(qū)域。36-43TTATAATT；110-115 ATATTT；185-193 ATATAATAT；198-204 AATTTTT；247-254 TTAATTAA；323-329 AAATTTA；470-475 TTTTAT；495-508AAATTTACATTTAT；566-579 TTATAATGATTTAA；683-696ATATAATCAATTTA；703-708 AATTAA；785-793 AATTAACA 798-809AAATTTATACAAA；815-825 TATTATGAAAT；938-946 AATATTATT；960-966 AAATAAT；1110-1132 TTTTAATATAGGGATAAATAAT；1382-1398 AATTTAATAATATAATT；1441-1452 TTTCTTTTTAATT；1496-1507 TTAGATTAAATA；1515-1524 AAATAACATT；1706-1719ATTTTGGTTATTTT；1752-1758 TAATATA；1770-1777 AAATTTTA；1811-1816 AATTTATT人工全合成CryIA(c)Bt(BT1)基因和野生型基因(BT)核苷酸序列比較如下BT- ATGGATAACAATCCGAACATCAATGAATGGATTCCTTATAATTGTTTAAGTAACC -55BTI - ATGGACAACAACCCGAACATCAACGAATGGATTCCGTACAACTGCCTGAGCAACC -55BT- CTGAAGTAGAAGTATTAGGTGGAGAAAGAATAGAAACTGGTTACACCCCAATCGA -110BTI - CGGAAGTGGAAGTGCTGGGCGGCGAACGCATCGAAACCGGCTACACCCCGATTGA -110BT- TATTTCCTTGTCGCTAACGCAATTTCTTTTGAGTGAATTTGTTCCCGGTGCTGGA -165BTI - CATCAGCCTGAGCCTGACCCAGTTCCTGCTGAGCGAGTTCGTGCCGGGCGCCGGC -165BT- TTTGTGTTAGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATTTTTGGTCCCTCTCAATGGG -220BTI - TTCGTGCTGGGCCTGGTGGACATCATCTGGGGCATCTTCGGCCCGAGCCAGTGGG -220BT- ACGCATTTCTTGTACAAATTGAACAGTTAATTAACCAAAGAATAGAAGAATTCGC -275BTI - ACGCCTTCCTGGTGCAGATCGAACAGCTGATCAACCAGCGCATCGAAGAGTTCGC -275BT- TAGGAACCAAGCCATTTCTAGATTAGAAGGACTAAGCAATCTTTATCAAATTTAC -330BTI - CCGCAACCAGGCCATCAGCCGCCTGGAAGGCCTGAGCAACCTGTACCAGATTTAC -330BT- GCAGAATCTTTTAGAGAGTGGGAAGCAGATCCTACTAATCCAGCATTAAGAGAAG -385BTI - GCCGAATCCTTCCGCGAATGGGAAGCCGACCCGACCAACCCGGCCCTGCGCGAAG -385BT- AGATGCGTATTCAATTCAATGACATGAACAGTGCCCTTACAACCGCTATTCCTCT -440BTI - AAATGCGCATCCAGTTCAACGACATGAACAGCGCCCTGACCACCGCCATCCCGCT -440BT- TTTTGCAGTTCAAAATTATCAATTTCCTCTTTTATCAGTATATGTTCAAGCTGCA -495BTI - GTTCGCCGTGCAGAACTACCAGTTCCCGCTGCTGAGCGTGTACGTGCAGGCCGCC -495BT- AATTTACATTTATCAGTTTTGAGAGATGTTTCAGTGTTTGGACAAAGGTGGGGAT -550BTI - AACCTGCACCTGAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTTCGGCCAGCGCTGGGGCT -550BT- TTGATGCCGCGACTATCAATAGTCGTTATAATGATTTAACTAGGCTTATTGGCAA -605BTI - TCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAA -605BT- CTATACAGATCATGCTGTACGCTGGTACAATACGGGATTAGAGCGTGTATGGGGA -560BTI - CTACACCGACCACGCCGTGCGCTGGTACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGGT -660BT- CCGGATTCTAGAGATTGGATAAGATATAATCAATTTAGAAGAGAATTAACACTAA -715BTI - CCGGACAGCCGCGACTGGATTCGCTACAACCAGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGA -715BT- CTGTATTAGATATCGTTTCTCTATTTCCGAACTATGATAGTAGAACGTATCCAAT -770BTI - CCGTGCTGGACATCGTGAGCCTGTTCCCGAACTACGACAGCCGCACCTACCCGAT -770BT- TCGAACAGTTTCCCAATTAACAAGAGAAATTTATACAAACCCAGTATTAGAAAAT -825BTI - CCGCACCGTGAGCCAGCTGACCCGCGAAATCTACACCAACCCGGTGCTGGAAAAC -825BT- TTTGATGGTAGTTTTCGAGGCTCGGCTCAGGGCATAGAAGGAAGTATTAGGAGTC -880BTI - TTCGACGGCAGCTTCCGCGGCAGCGCCCAGGGCATCGAAGGCAGCATCCGCAGCC -880BT- CACATTTGATGGATATAGTGAATAGTATAACCATCTATACGGATGCTCATAGAGG -935BTI - CGCACCTGATGGACATCGTGAACAGCATCACCATCTACACCGACGCCCACCGCGG -935BT - AGAATATTATTGGTCAGGGCATCAAATAATGGCTTCTCCTGTAGGGTTTTCGGGG -990BTI - CGAATACTACTGGAGCGGCCACCAGATCATGGCCAGCCCGGTGGGCTTCAGCGGC -990BT - CCAGAATTCACTTTTCCGCTATATGGAACTATGGGAAATGCAGCTCCACAACAAC -1045BTI - CCGGAGTTCACCTTCCCGCTGTACGGCACGATGGGCAACGCCGCCCCGCAGCAGC -1045BT - GTATTGTTGCTCAACTAGGTCAGGGCGTGTATAGAACATTATCGTCCACCTTATA -1100BTI - GCATCGTGGCCCAGCTGGGCCAGGGCGTGTACCGCACCCTGAGCAGCACCCTGTA -1100BT - TAGAAGACCTTTTAATATAGGGATAAATAATCAACAACTATCTGTTCTTGACGGG -1155BTI - CCGCCGCCCGTTCAACATCGGCATCAACAACCAGCAGCTGAGCGTGCTGGACGGC -1155BT - ACAGAATTTGCTTATGGAACCTCCTCAAATTTGCCATCCGCTGTATACAGAAAAA -1210BTI - ACCGAGTTCGCCTACGGCACCAGCAGCAACCTGCCGAGCGCCGTGTACCGCAAGA -1210BT - GCGGAACGCTAGATTCGCTGGATGAAATACCGCCACAGAATAACAATGTGCCACC -1265BTI - GCGGCACCCTGGACAGCCTGGACGAAATCCCGCCGCAGAACAACAACGTGCCGCC -1265BT - TAGGCAAGGATTTAGTCATCGATTAAGCCATGTTTCAATGTTTCGTTCAGGCTTT -1320BTI - GCGCCAGGGCTTCAGCCACCGCCTGAGCCACGTGAGCATGTTCCGCAGCGGCTTC -1320BT - AGTAATACTAGTGTAAGTATAATAAGAGCTCCTATGTTCTCTTGGATACATCGTA -1375BTI - AGCAACACCAGCGTGAGCATCATCCGCGCCCCGATGTTCAGCTGGATTCACCGCA -1375BT - GTGCTGAATTTAATAATATAATTGCATCGGATAGTATTACTCAAATCCCTGCAGT -1430BTI - GCGCCGAGTTCAACAACATCATCGCCAGCGACAGCATCACCCAGATCCCTGCAGT -1430BT - GAAGGGAAACTTTCTTTTTAATGGTTCTGTAATTTCAGGACCAGGATTTACTGGT -1485BTI - GAAAGGCAACTTCCTGTTCAACGGCAGCGTGATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGC -1485BT - GGGGACTTAGTTAGATTAAATAGTAGTGGAAATAACATTCAGAATAGAGGGTATA -1540BTI - GGCGACCTGGTGCGCCTGAACAGCAGCGGCAACAACATCCAGAACCGCGGCTACA -1540BT - TTGAAGTTCCAATTCACTTCCCATCCACATCTACCAGATATCGACTTCGTGTACG -1595BTI - TCGAAGTGCCGATCCACTTCCCGAGCACCAGCACCCGCTACCGCCTGCGCGTGCG -1595BT - GTATGCTTCTGTAACCCCGATTCACCTCAACGTTAATTGGGGTAATTCATCCATT -1650BTI - CTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACTGGGGCAACAGCAGCATC -1650BT - TTTTCCAATACAGTACCAGCTACAGCTACGTCATTAGATAATCTACAATCAAGTG -1705BTI - TTCAGCAACACCGTGCCGGCCACCGCCACCAGCCTGGACAACCTCCAGAGCAGCG -1705BT - ATTTTGGTTATTTTGAAAGTGCCAATGCTTTTACATCTTCATTAGGTAATATAGT -1760BTI - ACTTCGGCTACTTCGAAAGCGCCAACGCCTTCACCAGCAGCCTGGGCAACATCGT -1760BT - AGGTGTTAGAAATTTTAGTGGGACTGCAGGAGTGATAATAGACAGATTTGAATTT -1815BTI - GGGCGTGCGCAACTTCAGCGGCACCGCCGGCGTGATCATCGACCGCTTCGAGTTC -1815BT - ATTCCAGTTACTGCAACACTCGAGGCTGAATGA -1848BTI - ATCCCGGTGACGGCCACCCTGGAAGCCGAATGA -1848利用熒光假單胞菌作為Bt基因表達(dá)的宿主菌有很多優(yōu)點(diǎn)(1)發(fā)酵時(shí)間僅為蘇云金桿菌的1/3，培養(yǎng)基成份簡(jiǎn)單，因此發(fā)酵成本降低且可明顯減少雜菌及噬菌體污染。(2)發(fā)酵菌體密度可望提高，而菌體的毒力單位相近。(3)由于蘇云金桿菌在產(chǎn)生晶體蛋白的同時(shí)產(chǎn)生菌體的自溶，故傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品穩(wěn)定性差，不易儲(chǔ)存，且殺蟲有效期僅持續(xù)2-3天。而熒光假單胞菌發(fā)酵后不溶菌，菌體的胞壁成為毒蛋白的保護(hù)層，便于儲(chǔ)存，且殺蟲有效期可延長(zhǎng)至12天。(4)熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)是植物根際和葉圍微生物的主要類群，一方面能夠在植物表面定植，另一方面能夠?qū)ζ渌泻Σ≡a(chǎn)生拮抗作用，起到防病抗蟲的雙重效果。
實(shí)施例1CryIA(c)Bt基因的全合成1、全合成60-90 bq長(zhǎng)的寡核苷酸2、利用PWO taq DNA聚合酶將寡核苷酸片段連接


圖1連續(xù)延伸PCR合成CryIA(c)Bt基因。引物長(zhǎng)度為60-90bp.每個(gè)引物間有20-30 bp左右重疊。將所有引物加入后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，中間引物用量為10-20ng，兩邊引物用量為100-200ng。PCR擴(kuò)增條件為94℃，30 s；65℃，30 s；72℃，2min。共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。分兩段進(jìn)行PCR擴(kuò)增第一段從ATG起始密碼到1424 PstI位點(diǎn)，共有1429 bp核苷酸第一段的引物為BT1AGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGACCGTGCTGGACATCGTGAGCCTGTTCCCGAACTACGACAGCCGCACCTACCCGATCCGCACCGTGBT2ACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGGTCCGGACAGCCGCGACTGGATTCGCTACAACCAGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGABT3GCCGTCGAAGTTTTCCAGCACCGGGTTGGTGTAGATTTCGCGGGTCAGCTGGCTCACGGTGCGGATCGGGTAGGTGCGGCTGTBT4TCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAACTACACCGACCACGCCGTGCGCTGGTACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGBT5TGGTGATGCTGTTCACGATGTCCATCAGGTGCGGGCTGCGGATGCTGCCTTCGATGCCCTGGGCGCTGCCGCGGAAGCTGCCGTCGAAGTTTTCCBT6CGGCCAGCGCTGGGGCTTCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAA CTACACCGACCACGCCGTBT7GCCGCTGAACCCACCGGGCTGGCCATGATCTGGTGGCCGCTCCAGTAGTATTCGCCGCGGTGGGCGTCGGTGTAGATGGTGATGCTGTTCACGATGTCCATCBT8GAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTTCGGCCAGCGCTGGGGCTTCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAACTACACCGACCBT9CGCCCTGGCCCAGCTGGGCCACGATGCGCTGCTGCGGGGCGGCGTTGCCCATCGTGCCGTACTGCGGGAAGGGAACTCCGGGCCGCTGAACCCACCGGGCTGGCCATGATBT10CTGACCACCGCCATCCCGCTGTTCGCCGTGCAGAACTACCAGTTCCCGCTGCTGAGGTGTACGTGCAGGCCGCCAACCTGCACCTGAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTBT11TCGGTGCCGTCCAGCACGCTCAGCTGCTGGTTGTTGATGCCGATGTTGAACGGGCGGCGGTACAGGGTGCGGTSCACGCCCTGGCCCAGCTGGGCCACGABT12GAATCCTTCCGCGAATGGGAAGCCGACCCGACCAACCCGGCCCTGCGCGAAGAAATGCGCATCCAGTTCAACGACATGAACAGCGCCCTGACCACCGCCATCCCGCTBT13TGCGGCGGGATTTCGTCCAGGCTGTCCAGGGTGCCGCTCTTGCGGTACTCGGCGCTCGGCAGGTTGCTGCTGGTGCCGTAGGCGAACTCGGTGCCGTCCAGCACGCTCAGCBT14AGCTGATCAACCAGCGCATCGAAGAGTTCGCCCGCAACCAGGCCATCAGCCGCCTGGAAGGCCTGAGCAACCTGTACCAGATTTACGCCGAATCCTTCCGCGAATGGGAAGBT15CGCTGGTGTTGCTGAAGCCGCTGCGGAACATGCTCACGTGGCTCAGGCGGTGGCAGCCTGGCTGAAGCCCTGGCGCGGCGGCACGTTGTTGTTCTGCGGCGGGATTTCGTBT16CGCCGGCTTCGTGCTGGGCCTGGTGGACATCATCTGGGGCATCTTCGGCCCGAGCCAGTGGGACGCCTTCCTGGTGCAGATCGAACAGCTGATCAACCAGCGCATCGBT17GATGATGTTTTGAACTCGGCGCTGAGGTGAATCCAGCTGAACATCGGGGCGCCGGAYGATGCTCACGCTGGTGTTGCTGAAGCCGCTGCBT18GCGAACGCATCGAAACCGGCTACACCCCGATTGACATCAGCCTGAGCCTGACCCAGTTCCTGCTGAGCGAGTTCGTGCCGGGCGCCGGCTTCGTGCTGGGCCBT19ACTGCAGGGATCTGGGTGATGCTGTCGCTGGCGATGATGTTTTGAACTCGGCGCTGAGGTGAATCCBT20ACGGATCCATGGACAACAACCCGAACATCAACGAATGGATTCCGTACAACTGCCTGAGCAACCCGGAAGTGGAAGTGCTGGGCGGCGAACGCATCGAAACCGGCTA第二段從1424 PstI位點(diǎn)到終止密碼TGA，共有424 bp核苷酸BT21CTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACTGGGGCAACAGCAGCATCTTCAGCAACACCGTGCCGGCCACCGCCACCAGCCTGGACAACCTCCAGAGCAGCGBT22CCGCGGCTACATCGAAGTGCCGATCCACTTCCCGAGCACCAGCACCCGCTACCGCCTGCGCGTGCGCTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACBT23TGCCGCTGAAGTTGCGCACGCCCCACGATGTTGCCCAGGCTGCTGGTGAAGGCGTTGGCGCTTTCGAAGTAGCCGAAGTCGCTGTGTGGAGGTTGTCCAGGCTGGTGBT24GATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGCGGCGACCTGGTGCGCCTGAACAGCAGCGGCAACAACATCCAGAACCGCGGCTACATCGAAGTGCCGATBT25AAGAGCTCTCATTCGGCTTCCAGGGTGGCCGTCACCGGGATGAACTCGAAGCGGTCGATGATCACGCCGGCGGTGCCGCTGAAGTTGCGCACGCCCBT26GATCCCTGCAGTGAAAGGCAACTTCCTGTTCAACGGCAGCGTGATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGC將兩個(gè)片段用T4DNA連接酶相連實(shí)施例2CryIA(c)Bt在大腸桿菌中表達(dá)圖2大腸桿菌產(chǎn)生蘇云金桿菌δ-內(nèi)毒素的SDS-PAGE圖譜實(shí)施例3大腸桿菌表達(dá)CryIA(c)蛋白的生物活性測(cè)定收集帶CryIA(c)表達(dá)載體的大腸桿菌菌體和空載菌各50ml，用20ml的重蒸水懸浮，超聲波處理后，按10倍梯度稀釋，分別涂抹于16cm2的甘藍(lán)葉片上，烘干后飼喂三齡菜青蟲，對(duì)照組以空載菌蛋白粗提液替代。喂食4天后觀察，100倍稀釋液對(duì)菜青蟲的致死率為93.3％(表1)。
表1大腸桿菌表達(dá)的CryIA(c)對(duì)菜青蟲的毒殺效果處理 活蟲數(shù) 死蟲數(shù)(％)1 2 3對(duì)照(PUT56)20 20 20 0大腸肝菌稀釋液1∶1 0 0 0 1001∶10 0 1 0 98.31∶100 2 1 1 93.3實(shí)施例4全合成CryIA(c)基因熒光假單胞菌中表達(dá)圖3熒光假單胞菌中CryIA(c)基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析實(shí)施例5熒光假單胞工程菌殺蟲活性測(cè)定二齡菜青蟲的毒殺實(shí)驗(yàn)表明，工程菌蛋白抽提液800倍稀釋后對(duì)幼蟲的致死率為40％，測(cè)定LD50為0.028μg/cm2(表2)。
表2.熒光假單胞菌表達(dá)產(chǎn)物的生物測(cè)定
權(quán)利要求
1.一種蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因，它的核苷酸序列如下BTI -ATGGACAACAACCCGAACATCAACGAATGGATTCCGTACAACTGCCTGAGCAACC -55BTI -CGGAAGTGGAAGTGCTGGGCGGCGAACGCATCGAAACCGGCTACACCCCGATTGA -110BTI -CATCAGCCTGAGCCTGACCCAGTTCCTGCTGAGCGAGTTCGTGCCGGGCGCCGGC -165BTI -TTCGTGCTGGGCCTGGTGGACATCATCTGGGGCATCTTCGGCCCGAGCCAGTGGG -220BTI -ACGCCTTCCTGGTGCAGATCGAACAGCTGATCAACCAGCGCATCGAAGAGTTCGC -275BTI -CCGCAACCAGGCCATCAGCCGCCTGGAAGGCCTGAGCAACCTGTACCAGATTTAC -330BTI -GCCGAATCCTTCCGCGAATGGGAAGCCGACCCGACCAACCCGGCCCTGCGCGAAG -385BTI -AAATGCGCATCCAGTTCAACGACATGAACAGCGCCCTGACCACCGCCATCCCGCT -440BTI -GTTCGCCGTGCAGAACTACCAGTTCCCGCTGCTGAGCGTGTACGTGCAGGCCGCC -495BTI -AACCTGCACCTGAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTTCGGCCAGCGCTGGGGCT -550BTI -TCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAA -605BTI -CTACACCGACCACGCCGTGCGCTGGTACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGGT -660BTI -CCGGACAGCCGCGACTGGATTCGCTACAACCAGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGA -715BTI -CCGTGCTGGACATCGTGAGCCTGTTCCCGAACTACGACAGCCGCACCTACCCGAT -770BTI -CCGCACCGTGAGCCAGCTGACCCGCGAAATCTACACCAACCCGGTGCTGGAAAAC -825BTI -TTCGACGGCAGCTTCCGCGGCAGCGCCCAGGGCATCGAAGGCAGCATCCGCAGCC -880BTI -CGCACCTGATGGACATCGTGAACAGCATCACCATCTACACCGACGCCCACCGCGG -935BTI -CGAATACTACTGGAGCGGCCACCAGATCATGGCCAGCCCGGTGGGCTTCAGCGGC -990BTI -CCGGAGTTCACCTTCCCGCTGTACGGCACGATGGGCAACGCCGCCCCGCAGCAGC -1045BTI -GCATCGTGGCCCAGCTGGGCCAGGGCGTGTACCGCACCCTGAGCAGCACCCTGTA -1100BTI -CCGCCGCCCGTTCAACATCGGCATCAACAACCAGCAGCTGAGCGTGCTGGACGGC -1155BTI -ACCGAGTTCGCCTACGGCACCAGCAGCAACCTGCCGAGCGCCGTGTACCGCAAGA -1210BTI -GCGGCACCCTGGACAGCCTGGACGAAATCCCGCCGCAGAACAACAACGTGCCGCC -1265BTI -GCGCCAGGGCTTCAGCCACCGCCTGAGCCACGTGAGCATGTTCCGCAGCGGCTTC -1320BTI -AGCAACACCAGCGTGAGCATCATCCGCGCCCCGATGTTCAGCTGGATTCACCGCA -1375BTI -GCGCCGAGTTCAACAACATCATCGCCAGCGACAGCATCACCCAGATCCCTGCAGT -1430BTI -GAAAGGCAACTTCCTGTTCAACGGCAGCGTGATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGC -1485BTI -GGCGACCTGGTGCGCCTGAACAGCAGCGGCAACAACATCCAGAACCGCGGCTACA -1540BTI -TCGAAGTGCCGATCCACTTCCCGAGCACCAGCACCCGCTACCGCCTGCGCGTGCG -1595BTI -CTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACTGGGGCAACAGCAGCATC -1650BTI -TTCAGCAACACCGTGCCGGCCACCGCCACCAGCCTGGACAACCTCCAGAGCAGCG -1705BTI -ACTTCGGCTACTTCGAAAGCGCCAACGCCTTCACCAGCAGCCTGGGCAACATCGT -1760BTI -GGGCGTGCGCAACTTCAGCGGCACCGCCGGCGTGATCATCGACCGCTTCGAGTTC -1815BTI -ATCCCGGTGACGGCCACCCTGGAAGCCGAATGA -1848
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因，其特征在于Bt基因表達(dá)的宿主菌是熒光假單胞菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因，其特征在于四個(gè)易形成二級(jí)發(fā)卡結(jié)構(gòu)區(qū)域被消除，這四個(gè)區(qū)域的核苷酸序列如下291-304 TTCTAGATTAGAA；441-465 TTTGCAGTTCAAAATTATCAATTT；622-633GTACGCTGGT AC；1039-1054 CAACAACGTATTGTTG。
4.一種蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因的制備方法，其特征在于分兩段進(jìn)行合成，第一段從ATG起始密碼到1424 PstI位點(diǎn)，共有1429bp核苷酸，第二段從1424 PstI位點(diǎn)到終止密碼TGA，共有424 bp核苷酸，再用T4連接酶將第一段和第二段在PstI位點(diǎn)連接而得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因的制備方法，其特征在于引物長(zhǎng)度為60-90 bp左右每個(gè)引物間有20-30bp左右重疊，將所有引物加入后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，中間引物用量為10-20ng，兩邊引物用量為100-200ng。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因的制備方法，其特征在于第一段合成引物為BT1AGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGACCGTGCTGGACATCGTGAGCCTGTTCCCGAACTACGACAGCCGCACCTACCCGATCCGCACCGTGBT2ACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGGTCCGGACAGCCGCGACTGGATTCGCTACAACCAGTTCCGCCGCGAACTGACCCTGABT3GCCGTCGAAGTTTTCCAGCACCGGGTTGGTGTAGATTTCGCGGGTCAGCTGGCTCACGGTGCGGATCGGGTAGGTGCGGCTGTBT4TCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAACTACACCGACCACGCCGTGCGCTGGTACAACACCGGCCTGGAGCGCGTGTGGGBT5TGGTGATGCTGTTCACGATGTCCATCAGGTGCGGGCTGCGGATGCTGCCTTCGATGCCCTGGGCGCTGCCGCGGAAGCTGCCGTCGAAGTTTTCCBT6CGGCCAGCGCTGGGGCTTCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAACTACACCGACCACGCCGTBT7GCCGCTGAACCCACCGGGCTGGCCATGATCTGGTGGCCGCTCCAGTAGTATTCGCCGCGGTGGGCGTCGGTGTAGATGGTGATGCTGTTCACGATGTCCATCBT8GAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTTCGGCCAGCGCTGGGGCTTCGACGCCGCCACCATCAACAGCCGCTACAACGACCTGACCCGCCTGATCGGCAACTACACCGACCBT9CGCCCTGGCCCAGCTGGGCCACGATGCGCTGCTGCGGGGCGGCGTTGCCCATCGTGCCGTACTGCGGGAAGGGAACTCCGGGCCGCTGAACCCACCGGGCTGGCCATGATBT10CTGACCACCGCCATCCCGCTGTTCGCCGTGCAGAACTACCAGTTCCCGCTGCTGAGGTGTACGTGCAGGCCGCCAACCTGCACCTGAGCGTGCTGCGCGACGTGAGCGTGTBT11TCGGTGCCGTCCAGCACGCTCAGCTGCTGGTTGTTGATGCCGATGTTGAACGGGCGGCGGTACAGGGTGCGGTSCACGCCCTGGCCCAGCTGGGCCACGABT12GAATCCTTCCGCGAATGGGAAGCCGACCCGACCAACCCGGCCCTGCGCGAAGAAATGCGCATCCAGTTCAACGACATGAACAGCGCCCTGACCACCGCCATCCCGCTBT13TGCGGCGGGATTTCGTCCAGGCTGTCCAGGGTGCCGCTCTTGCGGTACTCGGCGCTCGGCAGGTTGCTGCTGGTGCCGTAGGCGAACTCGGTGCCGTCCAGCACGCTCAGCBT14AGCTGATCAACCAGCGCATCGAAGAGTTCGCCCGCAACCAGGCCATCAGCCGCCTGGAAGGCCTGAGCAACCTGTACCAGATTTACGCCGAATCCTTCCGCGAATGGGAAGBT15CGCTGGTGTTGCTGAAGCCGCTGCGGAACATGCTCACGTGGCTCAGGCGGTGGCAGCCTGGCTGAAGCCCTGGCGCGGCGGCACGTTGTTGTTCTGCGGCGGGATTTCGTBT16CGCCGGCTTCGTGCTGGGCCTGGTGGACATCATCTGGGGCATCTTCGGCCCGAGCCAGTGGGACGCCTTCCTGGTGCAGATCGAACAGCTGATCAACCAGCGCATCGBT17GATGATGTTTTGAACTCGGCGCTGAGGTGAATCCAGCTGAACATCGGGGCGCCGGAYGATGCTCACGCTGGTGTTGCTGAAGCCGCTGCBT18GCGAACGCATCGAAACCGGCTACACCCCGATTGACATCAGCCTGAGCCTGACCCAGTTCCTGCTGAGCGAGTTCGTGCCGGGCGCCGGCTTCGTGCTGGGCCBT19ACTGCAGGGATCTGGGTGATGCTGTCGCTGGCGATGATGTTTTGAACTCGGCGCTGAGGTGAATCCBT20ACGGATCCATGGACAACAACCCGAACATCAACGAATGGATTCCGTACAACTGCCTGAGCAACCCGGAAGTGGAAGTGCTGGGCGGCGAACGCATCGAAACCGGCTA第二段合成引物為BT21CTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACTGGGGCAACAGCAGCATCTTCAGCAACACCGTGCCGGCCACCGCCACCAGCCTGGACAACCTCCAGAGCAGCGBT22CCGCGGCTACATCGAAGTGCCGATCCACTTCCCGAGCACCAGCACCCGCTACCGCCTGCGCGTGCGCTACGCCAGCGTGACCCCGATCCACCTGAACGTGAACBT23TGCCGCTGAAGTTGCGCACGCCCCACGATGTTGCCCAGGCTGCTGGTGAAGGCGTTGGCGCTTTCGAAGTAGCCGAAGTCGCTGTGTGGAGGTTGTCCAGGCTGGTGBT24GATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGCGGCGACCTGGTGCGCCTGAACAGCAGCGGCAACAACATCCAGAACCGCGGCTACATCGAAGTGCCGATBT25AAGAGCTCTCATTCGGCTTCCAGGGTGGCCGTCACCGGGATGAACTCGAAGCGGTCGATGATCACGCCGGCGGTGCCGCTGAAGTTGCGCACGCCCBT26GATCCCTGCAGTGAAAGGCAACTTCCTGTTCAACGGCAGCGTGATCAGCGGTCCGGGCTTCACCGGC
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因的制備方法，其特征在于PCR擴(kuò)增條件為94℃，30秒；65℃，30秒；72℃，2分鐘共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。
8.一種蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因，具有生物活性可用作殺蟲劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因，其特征在于對(duì)鱗翅目昆蟲有效。
全文摘要
本發(fā)明提供全合成適合熒光假單胞工程菌高表達(dá)殺蟲晶體蛋白CryIA(c)Bt基因,采用重疊延伸PCR方法,結(jié)合高保真的PWO耐高溫DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分兩段進(jìn)行全合成及其在生物防治中作為殺蟲劑特別對(duì)鱗翅目昆蟲有效。
文檔編號(hào)A01N63/00GK1340614SQ0011975
公開日2002年3月20日 申請(qǐng)日期2000年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月25日
發(fā)明者姚泉洪, 彭日荷, 熊愛生 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心