專利名稱：一種菊花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)獲得再生植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一種菊花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)獲得再生植株的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，專用于組織培養(yǎng)獲得再生植株。
二、技術(shù)背景菊花(Dendranthema Xgrandiflora Ramat.)是我國(guó)十大名花和世界四大切花之一，是盆栽、切花和園林美化的重要花卉種類，在花卉生產(chǎn)中占有十分重要的地位。雜交和誘變是目前菊花育種的主要手段。但是，雜交和誘變育種帶有一定的盲目性，缺乏遇見(jiàn)性和可控性，而且工作量很大；誘變育種局限于個(gè)體或組織水平，其后代往往產(chǎn)生大量嵌合體，這對(duì)優(yōu)良性狀的純化鑒定和穩(wěn)定遺傳帶來(lái)很大的困難。
以單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)作為對(duì)象進(jìn)行菊花細(xì)胞、基因工程等研究具有很大的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)閱渭?xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)受周圍細(xì)胞和微環(huán)境的影響較小，且可以得到單細(xì)胞起源、遺傳上穩(wěn)定的同質(zhì)體再生植株。在細(xì)胞水平進(jìn)行誘變育種和遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，可從大群培養(yǎng)細(xì)胞中較快地篩選出所需的突變細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞，再生植株一般為純合突變體，通過(guò)生化或分子生物學(xué)手段對(duì)突變株或轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行選擇，能大大縮短育種年限。利用生物技術(shù)改良菊花的觀賞性狀、抗性已引起廣泛重視。能否成功地將這一方法應(yīng)用于菊花育種與生產(chǎn)，關(guān)鍵是要建立菊花組織、細(xì)胞培養(yǎng)的再生體系。菊花莖尖、莖段、葉片、花瓣、花托、花萼、雌雄蕊、花蕾再生植株都已有成功報(bào)道。但關(guān)于菊花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的研究，尚未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供一種菊花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)獲得再生植株的方法，建立小菊細(xì)胞懸浮培養(yǎng)再生體系，成功獲得植株并移栽成活，用于小菊組織培養(yǎng)獲得再生植株，同時(shí)為小菊的細(xì)胞、基因工程提供獲得再生植株的技術(shù)。
技術(shù)方案本發(fā)明是一種菊花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)獲得再生植株的方法，包括1)愈傷組織的誘導(dǎo)1.1基因型的選擇取不同品種的頂端幼嫩葉片，用75％酒精滅菌30s，再用0.1％升汞滅菌10min，無(wú)菌水沖洗5次，切成約0.5×0.5cm2小塊，接到MS+2.0mg·L-12，4-D+0.2mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂，pH6.2的培養(yǎng)基上；30天后，將誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂，pH6.2的分化培養(yǎng)基上，30d后選出平均每塊愈傷組織分化芽數(shù)大于5個(gè)的品種；1.2愈傷組織的獲得以選擇品種的無(wú)菌苗為試材，取植株中上部0.2-0.5cm長(zhǎng)嫩莖段作外植體，接種到以MS、B5作基本培養(yǎng)基，添加0.2mg·L-16-BA和濃度為1.0mg·L-12，4-D的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上，30d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率為100％，獲得誘導(dǎo)的愈傷組織為淺綠色、顆粒大小為0.05-0.15cm、外觀濕潤(rùn)、質(zhì)地松軟的愈傷組織；
2)懸浮系的建立和植株再生2.1懸浮培養(yǎng)取2～3g上述誘導(dǎo)出的淺綠色、顆粒大小為0.05-0.15cm、外觀濕潤(rùn)、質(zhì)地松軟的愈傷組織放入MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-1NAA+0.2mg·L-12，4-D液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)3天，將培養(yǎng)的懸浮液用高溫高壓滅菌過(guò)的300目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾，收集過(guò)濾液進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代時(shí)，把培養(yǎng)物搖勻，分裝到無(wú)菌三角瓶中，再加入同等體積的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘，25±1℃，1000lux弱光下培養(yǎng)，共培養(yǎng)30-50d；2.2植株再生將上述培養(yǎng)的懸浮液用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，收集過(guò)濾液轉(zhuǎn)移到MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-12，4-D+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂，pH6.2的固體培養(yǎng)基上，每瓶裝有25～30ml固體培養(yǎng)基的100ml三角瓶中加1ml過(guò)濾液，在25±1℃，1000lux弱光下培養(yǎng)，4周后獲得0.2-0.4cm大小的愈傷組織；把獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂上，在25±1℃，3000lux下培養(yǎng)，每天12小時(shí)黑暗，一個(gè)月后獲得0.8-1.5cm高度的再生植株。
上述方法中最好將將獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)到MS/B5+2mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+瓊脂0.7g·L-1，以MS為基本培養(yǎng)基的添加30g·L-1蔗糖，B5加20g·L-1蔗糖，pH值6.2，高溫高壓滅菌前的分化培養(yǎng)基；30d后統(tǒng)計(jì)分化情況，每塊愈傷組織分化芽數(shù)達(dá)0.5-1.0個(gè)，確定以上獲得的愈傷組織可以于下一步懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)初期，每隔3天繼代換液1次，繼代2次，以后可每隔7～10d繼代換液1次。
有益效果本發(fā)明提供的一種菊花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)獲得再生植株的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果①本研究以小菊為材料，建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)與植株再生體系，為小菊的細(xì)胞、基因工程等的深入研究奠定了基礎(chǔ)。比較不同基因型在分化培養(yǎng)基上的分化率，篩選出分化能力最強(qiáng)的基因型為‘七月紅’，每塊愈傷組織30d天可誘導(dǎo)出9個(gè)芽，，篩選出莖段最易誘導(dǎo)出愈傷組織，同時(shí)再生能力較理想，愈傷組織的誘導(dǎo)率為100％，平均每塊愈傷組織分化芽數(shù)0.7個(gè)；②本發(fā)明懸浮培養(yǎng)的單個(gè)細(xì)胞在3～5d內(nèi)即可見(jiàn)到細(xì)胞分裂，約6d即可形成小細(xì)胞團(tuán)，培養(yǎng)過(guò)程中，整個(gè)生長(zhǎng)曲線為上升的半拋物線型，可分為延遲期(2d)、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(6～9d)，減慢期(2d)等階段；試驗(yàn)表明，懸浮細(xì)胞在7種培養(yǎng)基上，植板率有明顯差異，本發(fā)明選擇培養(yǎng)基即MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-12，4-D培養(yǎng)基上懸浮細(xì)胞的植板率最大，為9.2×10-4；懸浮細(xì)胞再生愈傷組織時(shí)，都需要添加生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，本發(fā)明2，4-D效果較好，植板率也相應(yīng)提高到30×10-4；③本發(fā)明進(jìn)行短期的低溫預(yù)處理，可以提高懸浮細(xì)胞的植板率，4℃處理2h，植板率增加0.3×10-4，并采取懸浮培養(yǎng)初期，每隔3天繼代換液1次，繼代2次，以后可每隔7～10d繼代換液1次，共繼代4次，植板率為9.5×10-4。
④本發(fā)明成功獲得1cm左右高度的再生植株(圖5)。再生植株馴化至根長(zhǎng)度達(dá)0.5-1cm時(shí)移栽成活(圖6)。本發(fā)明建立了小菊細(xì)胞懸浮培養(yǎng)再生體系，成功獲得植株并移栽成活，可用于小菊組織培養(yǎng)獲得再生植株，同時(shí)為小菊的細(xì)胞、基因工程提供獲得再生植株的技術(shù)。
四

圖1‘七月紅’細(xì)胞懸浮培養(yǎng)(×100) 不規(guī)則細(xì)長(zhǎng)細(xì)胞； 橢圓形細(xì)胞； 細(xì)胞團(tuán)圖2‘七月紅’細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)(×200)圖3懸浮細(xì)胞培養(yǎng)所得的愈傷圖4懸浮細(xì)胞培養(yǎng)所得愈傷的變化圖5懸浮培養(yǎng)所得的愈傷分化出芽圖6懸浮培養(yǎng)再生植株生根五、具體實(shí)施方案本發(fā)明所提供的菊花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和植株再生的方法，其實(shí)施方案如下1愈傷組織的誘導(dǎo)1.1基因型的選擇取不同品種的頂端幼嫩葉片，用75％酒精滅菌30s，再用0.1％升汞滅菌10min，無(wú)菌水沖洗5次，切成約0.5×0.5cm2小塊，接到MS+2.0mg·L-12，4-D+0.2mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂，pH6.2的培養(yǎng)基上。30天后，將誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂，pH6.2的分化培養(yǎng)基上，30d后選出平均每塊愈傷組織分化芽數(shù)大于5個(gè)的品種。結(jié)果表明，‘七月紅’葉片在15d后就開(kāi)始形成愈傷組織(速度最快)，且愈傷組織在轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上分化率最高，每塊愈傷組織可誘導(dǎo)出9個(gè)芽。
1.2愈傷組織的獲得以‘七月紅’品種的無(wú)菌苗為試材，取植株中上部的葉片切成三部分葉片上部、葉片下部、葉柄及約0.3cm長(zhǎng)嫩莖段作外植體，分別接種到以MS、B5作基本培養(yǎng)基，添加0.2mg·L-16-BA和不同濃度2，4-D(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0mg·L-1)的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基，每瓶接種5個(gè)外植體，每個(gè)處理重復(fù)3次；30天后獲得誘導(dǎo)的愈傷組織；將愈傷組織轉(zhuǎn)到MS/B5+2mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+瓊脂0.7g·L-1，以MS為基本培養(yǎng)基的添加30g·L-1蔗糖，B5加20g·L-1蔗糖，pH值6.2(高溫高壓滅菌前)的分化培養(yǎng)基。30d后統(tǒng)計(jì)分化情況，篩選出適于誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)用愈傷組織[淺綠色、顆粒細(xì)小(愈傷組織表面形成0.1cm左右大小的細(xì)小顆粒)、外觀濕潤(rùn)、質(zhì)地松軟的愈傷組織]的外植體。
結(jié)果表明，最適合的外植體為幼嫩莖段，最適合的培養(yǎng)基為MS+0.2mg·L-16-BA+1.0mg·L-12，4-D+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂，pH6.2。其愈傷組織的誘導(dǎo)率為100％，平均每塊愈傷組織分化芽數(shù)0.7個(gè)。
2懸浮系的建立和植株再生2.1懸浮培養(yǎng)取2～3g上述誘導(dǎo)出的淺綠色、顆粒細(xì)小(愈傷組織表面形成0.1cm左右大小的細(xì)小顆粒)、外觀濕潤(rùn)、質(zhì)地松軟的愈傷組織放入MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-1NAA+0.2mg·L-12，4-D液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，3d后，培養(yǎng)的懸浮液用高溫高壓滅菌過(guò)的300目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾，收集過(guò)濾液進(jìn)行繼代培養(yǎng)。繼代時(shí)，把培養(yǎng)物搖勻，分裝到無(wú)菌三角瓶中，再加入同等體積的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘，25±1℃，1000lux弱光下培養(yǎng)。
懸浮培養(yǎng)初期，每隔3天繼代換液1次，繼代2次，以后可每隔7～10d繼代換液1次，共培養(yǎng)40d左右。
2.2植株再生將上述培養(yǎng)40d后的懸浮液用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，收集過(guò)濾液轉(zhuǎn)移到MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-12，4-D+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂，pH6.2的固體培養(yǎng)基上，每瓶裝有25～30ml固體培養(yǎng)基的100ml三角瓶中加1ml過(guò)濾液，在25±1℃，1000lux弱光下培養(yǎng)。四周后獲得0.3cm左右大小的愈傷組織。
把獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂上，在25±1℃，3000lux下培養(yǎng)(每天12小時(shí)黑暗)，一個(gè)月后獲得1cm左右高度的再生植株(圖5)。
再生植株在MS+0.5mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂培養(yǎng)基(pH6.2)上誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)條件為25±1℃，弱光(約1000lux)。20d后，當(dāng)根長(zhǎng)度達(dá)0.5-1cm時(shí)馴化移栽成活(圖6)。
上述懸浮培養(yǎng)的單個(gè)細(xì)胞在3～5d內(nèi)即可見(jiàn)到細(xì)胞分裂，約6d即可形成小細(xì)胞團(tuán)，培養(yǎng)過(guò)程中，整個(gè)生長(zhǎng)曲線為上升的半拋物線型，可分為延遲期(2d)、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(6～9d)，減慢期(2d)等階段；試驗(yàn)表明，懸浮細(xì)胞在7種培養(yǎng)基上，植板率有明顯差異，本發(fā)明選擇培養(yǎng)基即MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-12，4-D培養(yǎng)基上懸浮細(xì)胞的植板率最大，為9.2×10-4；懸浮細(xì)胞再生愈傷組織時(shí)，都需要添加生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，本發(fā)明2，4-D效果較好，植板率也相應(yīng)提高到30×10-4；高溫(38℃)條件下，無(wú)論來(lái)自何種愈傷組織所得的懸浮細(xì)胞，其植板率都會(huì)下降，38℃處理6h、48h，其植板率分別下降7.3×10-4、9.0×10-4；本發(fā)明進(jìn)行短期的低溫預(yù)處理，可以提高懸浮細(xì)胞的植板率，4℃處理2h，植板率增加0.3×10-4，但處理時(shí)間超過(guò)4h時(shí)植板率開(kāi)始降低，隨著繼代次數(shù)的增加，植板率下降，繼代6次后，植板率降低1.9×10-4，繼代9次時(shí)，植板率降為1.9×10-4，繼代次數(shù)達(dá)到12次時(shí)植板率降為0。采用懸浮培養(yǎng)初期，每隔3天繼代換液1次，繼代2次，以后可每隔7～10d繼代換液1次，共繼代4次，植板率為9.5×10-4。
權(quán)利要求
1.一種菊花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)獲得再生植株的方法，包括1)愈傷組織的誘導(dǎo)1.1基因型的選擇 取不同品種的頂端幼嫩葉片，用75％酒精滅菌30s，再用0.1％升汞滅菌10min，無(wú)菌水沖洗5次，切成約0.5×0.5cm2小塊，接到MS+2.0mg·L-12，4-D+0.2mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂，pH6.2的培養(yǎng)基上；30天后，將誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂，pH6.2的分化培養(yǎng)基上，30d后選出平均每塊愈傷組織分化芽數(shù)大于5個(gè)的品種；1.2愈傷組織的獲得 以選擇品種的無(wú)菌苗為試材，取植株中上部0.2-0.5cm長(zhǎng)嫩莖段作外植體，接種到以MS、B5作基本培養(yǎng)基，添加0.2mg·L-16-BA和濃度為1.0mg·L-12，4-D的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上，30d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率為100％，獲得誘導(dǎo)的愈傷組織為淺綠色、顆粒大小為0.05-0.15cm、外觀濕潤(rùn)、質(zhì)地松軟的愈傷組織；2)懸浮系的建立和植株再生2.1懸浮培養(yǎng)取2～3g上述誘導(dǎo)出的淺綠色、顆粒大小為0.05-0.15cm、外觀濕潤(rùn)、質(zhì)地松軟的愈傷組織放入MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-1NAA+0.2mg·L-12，4-D液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)3天，將培養(yǎng)的懸浮液用高溫高壓滅菌過(guò)的300目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾，收集過(guò)濾液進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代時(shí)，把培養(yǎng)物搖勻，分裝到無(wú)菌三角瓶中，再加入同等體積的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘，25±1℃，1000lux弱光下培養(yǎng)，共培養(yǎng)30-50d；2.2植株再生將上述培養(yǎng)的懸浮液用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，收集過(guò)濾液轉(zhuǎn)移到MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-12，4-D+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂，pH6.2的固體培養(yǎng)基上，每瓶裝有25～30ml固體培養(yǎng)基的100ml三角瓶中加1ml過(guò)濾液，在25±1℃，1000lux弱光下培養(yǎng)，4周后獲得0.2-0.4cm大小的愈傷組織；把獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1瓊脂上，在25±1℃，3000lux下培養(yǎng)，每天12小時(shí)黑暗，一個(gè)月后獲得0.8-1.5cm高度的再生植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種菊花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及植株再生的方法，其特征在于將獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)到MS/B5+2mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+瓊脂0.7g·L-1，以MS為基本培養(yǎng)基的添加30g·L-1蔗糖，B5加20g·L-1蔗糖，pH值6.2，高溫高壓滅菌前的分化培養(yǎng)基；30d后統(tǒng)計(jì)分化情況，每塊愈傷組織分化芽數(shù)達(dá)0.5-1.0個(gè)，確定以上獲得的愈傷組織可以于下一步懸浮培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種菊花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及植株再生的方法，其特征在于懸浮培養(yǎng)初期，每隔3天繼代換液1次，繼代2次，以后可每隔7～10d繼代換液1次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種菊花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)獲得再生植株的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，包括篩選出愈傷組織分化能力較強(qiáng)的基因型菊花品種‘七月紅’長(zhǎng)嫩莖段；在培養(yǎng)基MS+2.0mg·L－1 2，4－D+0.2mg·L
文檔編號(hào)A01H4/00GK1593110SQ200410041038
公開(kāi)日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2004年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月21日
發(fā)明者陳發(fā)棣, 蔣甲福, 房偉民, 趙宏波, 管志勇 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)