專利名稱：一種獲得紅豆杉轉(zhuǎn)基因愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種獲得紅豆杉轉(zhuǎn)基因愈傷組織的方法。
背景技術(shù)：
紅豆杉(Tkro1SSp.)又稱紫杉，為紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬、Taxus)的裸子植物。紅豆杉屬植物全世界共有11種，主要分布于北半球溫帶至亞熱帶地區(qū)。我國有4種和I個(gè)變種，分別是東北紅豆杉(T. cuspidata)、云南紅豆杉(T. yuennanensis)、中國紅豆杉(T. chinensis)、南方紅豆杉(T. chinensis var. mairei)、西藏紅豆杉(T. walIichiana)(中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì)，1978)，主要分布于東北、西北、華北、西南、中南、華南的各個(gè)省區(qū)。后來還引種了曼地亞紅豆杉(T.x media)，為東北紅豆杉和歐洲紅豆杉(T. baccata)的雜交種，其母本是東北紅豆杉，父本是歐洲紅豆杉。紫杉醇(taxol)是從紅豆杉樹皮中提取出來的一種天然活性成分，具有獨(dú)特的抗癌效果，對(duì)人卵巢癌、乳腺癌、黑色素癌等多種癌癥有突出的療效，對(duì)白血病、肺癌、腦癌和其他的一些實(shí)體瘤等也有很好的療效，毒副作用很小，是最好的天然抗癌藥物之一。據(jù)估計(jì)，全世界紫杉醇的年需求量至少在I 000 kg以上。目前，紫杉醇只存在于裸子植物紅豆杉科的紅豆杉屬的11種(亞種)植物中，而且主要從紅豆杉樹的莖皮中獲得。但是紅豆杉的生長速度緩慢，再生能力差，成材需要50-250年時(shí)間。其資源量非常有限，特別是紫杉醇含量低，僅占樹皮干重的O. 01% O. 02%。紅豆杉資源與開發(fā)矛盾特別突出。近年來，受利益的驅(qū)使，紅豆杉的野生資源遭到了嚴(yán)重的破壞。如何擴(kuò)大紫杉醇的藥源已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。紅豆杉的人工栽培已取得一定進(jìn)展，但種植需占大量土地，周期較長。紫杉醇的化學(xué)全合成需近30步反應(yīng)，尚無商業(yè)開發(fā)價(jià)值。植物細(xì)胞培養(yǎng)由于不受氣候和土壤的限制，是作為生產(chǎn)植物有用次生代謝產(chǎn)物的有效方法。目前紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞中紫杉醇的產(chǎn)量一般都不高，即使偶爾獲得較高的產(chǎn)量也都存在著紫杉醇產(chǎn)量不穩(wěn)定的問題，所以要利用基因工程的方法對(duì)紫杉醇生物合成與分支途徑中有關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，以提高紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞中紫杉醇產(chǎn)量及其穩(wěn)定性成為了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。國內(nèi)外不少實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行這方面的研究，但還沒有成功的報(bào)道。誘導(dǎo)培養(yǎng)紅豆杉胚性愈傷，以根癌農(nóng)桿菌為介導(dǎo)，獲得紅豆杉轉(zhuǎn)基因愈傷組織的方法，將是開展紫杉醇代謝工程研究提高紫杉醇含量并最終 解決紫杉醇產(chǎn)品稀缺的有效方法。目前尚未發(fā)現(xiàn)獲得紅豆杉轉(zhuǎn)基因愈傷組織的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種簡單、快速、高效地獲得紅豆杉轉(zhuǎn)基因愈傷組織的方法。本發(fā)明提供的獲得紅豆杉轉(zhuǎn)基因愈傷組織的方法，包括紅豆杉外植體的培養(yǎng)、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)、以根癌農(nóng)桿菌為介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，具有抗性的愈傷組織的篩選和增殖培養(yǎng)及愈傷組織⑶S基因的檢測(cè)等，為紫杉醇愈傷組織大規(guī)模工廠化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
本發(fā)明利用紅豆杉下胚軸作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并經(jīng)過培養(yǎng)獲得胚性愈傷，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將帶有⑶S基因的pCAMBIA1304質(zhì)粒導(dǎo)入紅豆杉愈傷組織，PCR檢測(cè)外源潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Hygromycin B phosphotransferase gene, HPT)的整合情況，用組織化學(xué)方法檢測(cè)GUS基因在組織中的表達(dá)情況，獲得紅豆杉的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。具體步驟為
(I)紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)選擇下胚軸為愈傷組織誘導(dǎo)用外植體，在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)，在下胚軸兩端逐漸產(chǎn)生白色的愈傷組織，并且不斷膨大。上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，再添加激素NAA、TDZ和2，4-D而組成。(2)紅豆杉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)將下胚軸誘導(dǎo)出的白色愈傷轉(zhuǎn)接入胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，預(yù)防水樣化和褐化，并獲得致密的、硬度增加的胚性愈傷組織。該胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，再添加5種氨基酸和激素2，4-D、NAA和TDZ而組成。 (3)遺傳轉(zhuǎn)化利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將含GUS基因的植物表達(dá)載體PCAMBIA1304根癌農(nóng)桿菌，以紅豆杉胚性愈傷組織為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。(4)抗性胚性愈傷組織的脫菌、篩選和增殖培養(yǎng)經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化，然后，在恢復(fù)培養(yǎng)基上進(jìn)行脫菌培養(yǎng)，在篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，獲得具有潮霉素抗性的愈傷組織；將抗性愈傷組織接入胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增加抗性愈傷組織的數(shù)量。(5) PCR檢測(cè)和⑶S組織化學(xué)染色方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因愈傷PCR檢測(cè)pCAMBIA1304質(zhì)粒上帶有的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。GUS組織化學(xué)染色，將愈傷組織浸入配制好的GUS染色液中，37°C染色過夜，愈傷組織中的藍(lán)色為報(bào)告基因GUS組織化學(xué)染色，表明外源基因已經(jīng)整合到受體細(xì)胞的染色體中并表達(dá)。本發(fā)明所述的根癌農(nóng)桿菌，市場(chǎng)有公開出售的生物材料，可以從多家公司如澳大利亞 CAMBIA 公司(CAMBIA，GPO Box 3200,Canberra, ACT 2601，Australia。商品名稱根癌農(nóng)桿菌菌株如EHA105，商品編號(hào)Gambar I)購得。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的采用基因工程方法，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將PCAMBIA1304質(zhì)粒導(dǎo)入紅豆杉愈傷組織中，獲得了轉(zhuǎn)基因紅豆杉愈傷組織。這對(duì)后期開展紅豆杉紫杉醇合成途徑的代謝工程，最終解決紫杉醇藥源匱乏、滿足醫(yī)藥工業(yè)大規(guī)模工廠化生產(chǎn)需要具有重要意義。該方法在紅豆杉生物技術(shù)相關(guān)領(lǐng)域包括功能蛋白的定位、啟動(dòng)子活性的檢測(cè)、紅豆杉基因工程、細(xì)胞工程、代謝工程以及紅豆杉遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I紅豆杉胚性愈傷的誘導(dǎo)和增殖 I.紅豆杉無菌苗的繁殖
剝掉紅豆杉種子的外皮，消毒完整的胚乳，程序如下75%的乙醇消毒2 min，0. 1%的升萊消毒10 min,無菌水沖洗3遍,之后剝?nèi)》N胚接種于由B5培養(yǎng)基+6-BA1. O mg/1+2, 4-D0.1 mg/1+水解酪蛋白1.0 g/1+活性炭I g/1+鹿糖20 g/1+植物凝膠2. 6 g/Ι組成的培養(yǎng)基中(其中，組分后的數(shù)字表示該組分在B5培養(yǎng)基單位體積(I)中的加入量(g))，先在黑暗環(huán)境下使種子萌發(fā)，然后逐漸增強(qiáng)光照，應(yīng)用較弱的慢射光培養(yǎng)，即可獲得紅豆杉無菌小苗，待苗長至2-3 cm后，切取下胚軸用于愈傷組織的誘導(dǎo)。2.紅豆杉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)
將下胚軸接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為B5培養(yǎng)基+TDZ(O. 5-2. O mg/1)+2，4-D(I. 0-2. O mg/1)+NAA(I. 0-2. O mg/1) +蔗糖 25 g/1+植物 凝膠5 g/1，其中，組分后的數(shù)字為該組分在B5培養(yǎng)基單位體積(I)中的加入量(g)，下同，不再作一一說明；在下胚軸兩端逐漸產(chǎn)生白色的愈傷組織，并且不斷膨大。將愈傷組織繼代接種于胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為B5+TDZ(0. 5-2. O mg/I)+2, 4-D (I. 0-2. O mg/l)+NAA(1.0-2. O mg/1)+酪氨酸 O. 8 g/1+丙氨酸 0· 4 g/1+脯氨酸
0.4 g/1+賴氨酸O. 4 g/1+谷氨酸O. 4 g/1+蔗糖25 g/1+植物凝膠5 g/1，篩選到長勢(shì)好而快，沒有褐化呈現(xiàn)白色的胚性愈傷組織。實(shí)施例2
含GUS基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304根癌農(nóng)桿菌工程菌的獲得將植物表達(dá)載體PCAMBIA1304轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(如EHA105，為市場(chǎng)有公開出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號(hào)為Gambar I)，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。具體地，首先制備感受態(tài)根癌農(nóng)桿菌(如EHA105):培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌至菌液O. D6tltl=O. 5，將菌液冰浴30 min后，取菌于I. 5 ml Eppendorf管中，于4°C 5000 rpm離心5 min,去上清；用抽濾滅菌的O. IM CaCl2 (預(yù)冷)400 μ I懸浮菌體(用移液槍輕輕打勻)后于冰上放置30 min,5000 rpm離心5 min,去上清,用100 μ I預(yù)冷的O. IM CaCl2懸浮菌體后于4°C保存10 h備用。然后，采用以下方法獲得含植物表達(dá)載體PCAMBIA1304的根癌農(nóng)桿菌工程菌株取一管100 μ I的感受態(tài)，加2 μ I質(zhì)粒PCAMBIA1304，輕輕混勻后，于冰上放置5 min和液氮中放置8 min后，放入37°C水浴中熱激5 min ;加入800 μ I無抗生素的YEB液體培養(yǎng)基，輕輕混勻；振蕩培養(yǎng)活化(28°C,200 rpm)4 h后，于室溫離心(4000 rpm) 10 min,去上清,余下200 μ I菌液重懸菌體混勻；將混勻的200 μ I重懸活化菌液均勻涂布到加相應(yīng)抗生素[卡那霉素(Kan) 100 μ g/ml+ 鏈霉素(Str) 25 μ g/ml+ 利福平(Rif) 40 μ g/ml]的 YEB 固體培養(yǎng)基平板上，于28°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2天后，挑選抗性單菌落在含相應(yīng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。菌液達(dá)到一定濃度后做潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，植物表達(dá)載體PCAMBIA1304已成功構(gòu)建到根癌農(nóng)桿菌菌株中。實(shí)施例3
I.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化
I.I.根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
挑取含所述植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌單菌落于培養(yǎng)基(其組成為YEB液體培養(yǎng)基 + 鏈霉素(Str) 25 μ g/ml+ 卡那霉素(Kan) 100 μ g/ml+ 利福平(Rif) 40 μ g/ml)中，在28°C搖床上180 rpm振蕩過夜,第二天當(dāng)菌液濃度達(dá)到OD6qq=O. 5時(shí),5000 rpm離心10分鐘后倒掉上層培養(yǎng)液，重懸沉淀在底部的農(nóng)桿菌，加入100 111乙酰丁香酮，在281搖床(180 rpm)上活化2小時(shí)后用于轉(zhuǎn)化紅豆杉胚性愈傷。I. 2.根癌農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)
用根癌農(nóng)桿菌菌液侵染紅豆杉胚性愈傷團(tuán)塊，把帶有少量農(nóng)桿菌菌液的愈傷置于共培養(yǎng)基(其組分為B5+TDZ (O. 5-2. O mg/1)+2, 4-D (I. 0-2. O mg/1)+NAA (I. 0-2. 0 mg/1)+酪氨酸0.8 g/1+丙氨酸0.4 g/1+脯氨酸0.4 g/1+賴氨酸0.4 g/1+谷氨酸0. 4 g/1+蔗糖25 g/1+植物凝膠5 g/1)上于25°C暗培養(yǎng)2天，使農(nóng)桿菌充分侵染紅豆杉愈傷組織。I. 3.抗性愈傷組織的篩選和繼代培養(yǎng) 共培養(yǎng)后，把愈傷組織轉(zhuǎn)接到恢復(fù)培養(yǎng)基(其組分為B5+TDZ (O. 5-2. O mg/I)+2, 4-D (I. 0-2. O mg/l)+NAA(1.0-2. O mg/1) +酪氨酸 O. 8 g/1+丙氨酸 0· 4 g/1+脯氨酸
0.4 g/1+賴氨酸O. 4 g/1+谷氨酸O. 4 g/1+蔗糖25 g/1+植物凝膠5 g/1+羧芐霉素250 mg/I)上進(jìn)行脫菌培養(yǎng)，于25°C暗培養(yǎng)25天后轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基(其組分為B5+TDZ(0. 5-2. Omg/1)+2, 4-D (I. 0-2. O mg/1)+NAA (I. 0-2. 0 mg/1) +酪氨酸 0.8 g/1+丙氨酸 0.4 g/1+脯氨酸0.4 g/1+賴氨酸0.4 g/1+谷氨酸0.4 g/1+蔗糖25 g/1+植物凝膠5 g/1+羧芐霉素250mg/1 +潮霉素5 mg/1)上進(jìn)行抗性愈傷組織的篩選培養(yǎng)，將起源于不同細(xì)胞的每個(gè)愈傷組織作為一個(gè)無性系，接種于繼代培養(yǎng)基(其組分為B5+TDZ(0. 5-2. O mg/1)+2, 4-D (I. 0-2. Omg/1)+NAA(I. 0-2. 0 mg/1)+酪氨酸 0.8 g/1+丙氨酸 0. 4 g/1+脯氨酸 0. 4 g/1+賴氨酸
0.4 g/1+谷氨酸(λ 4 g/1+蔗糖25 g/1+植物凝膠5 g/1 + 5 mg/1潮霉素)上繼代篩選，每20-25天繼代培養(yǎng)一次。2.轉(zhuǎn)基因紅豆杉愈傷組織的PCR檢測(cè)
首先采用常規(guī)CTAB (Cetyltrimethyl Ammonium bromide,十六燒基三甲基溴化胺)方法提取轉(zhuǎn)基因紅豆杉潮霉素抗性愈傷組織的DNA，然后，用PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因紅豆杉抗性愈傷組織中的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件為94°C變性5 min — 30個(gè)循環(huán)(94°C 50 sec ^ 58°C 50 sec ^ 72°C I min) — 72°C 6 min。結(jié)果表明，利用所設(shè)計(jì)的PCR特異引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因紅豆杉愈傷組織DNA，能擴(kuò)增出與預(yù)期結(jié)果一致的特異目的片段(O. 8 kb)，而以非轉(zhuǎn)化紅豆杉基因組DNA為模板時(shí)，沒有擴(kuò)增出任何片段。說明潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因已經(jīng)整合到喜樹基因組中。3.轉(zhuǎn)基因紅豆杉愈傷組織的組織化學(xué)檢測(cè)
GUS報(bào)告基因的組織化學(xué)染色，將愈傷組織浸入配制好的染色液(100 mM磷酸緩沖液，5 mM高鐵氰化鉀，5 mM亞鐵氰化鉀，10 mM Na2EDTA, 50 mg/ml X-Gluc)中，37°C，染色時(shí)間為16小時(shí)，愈傷組織中的藍(lán)色為報(bào)告基因GUS組織化學(xué)染色，表明外源基因已經(jīng)整合到受體細(xì)胞的染色體中并表達(dá)。本實(shí)施例利用所構(gòu)建的含植物表達(dá)載體PCAMBIA1304的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化紅豆杉細(xì)胞，獲得經(jīng)PCR和組織化學(xué)檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。為后期開展紅豆杉代謝工程和規(guī)模化生產(chǎn)紫杉醇并最終解決生物堿匱乏提供了一種有效的解決方法。
權(quán)利要求
1.一種獲得紅豆杉轉(zhuǎn)基因愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于利用紅豆杉下胚軸作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并經(jīng)過培養(yǎng)獲得胚性愈傷，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將帶有GUS基因的PCAMBIA1304質(zhì)粒導(dǎo)入紅豆杉愈傷組織，PCR檢測(cè)外源潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的整合情況，用組織化學(xué)方法檢測(cè)GUS基因在組織中的表達(dá)情況，獲得紅豆杉的轉(zhuǎn)基因愈傷組織；具體步驟為 (1)紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)選擇下胚軸為愈傷組織誘導(dǎo)用外植體，在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)，在下胚軸兩端逐漸產(chǎn)生白色的愈傷組織，并且不斷膨大；上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，再添加激素NAA、TDZ和2，4-D而組成； (2)紅豆杉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)將下胚軸誘導(dǎo)出的白色愈傷轉(zhuǎn)接入胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，預(yù)防水樣化和褐化，并獲得致密的、硬度增加的胚性愈傷組織；該胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，再添加5種氨基酸和激素2，4-D、NAA和TDZ而組成； (3)遺傳轉(zhuǎn)化利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將含GUS基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304根癌農(nóng)桿菌，以紅豆杉胚性愈傷組織為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化； (4)抗性胚性愈傷組織的脫菌、篩選和增殖培養(yǎng)經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化，然后在恢復(fù)培養(yǎng)基上進(jìn)行脫菌培養(yǎng)，在篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，獲得具有潮霉素抗性的愈傷組織；將抗性愈傷組織接入胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增加抗性愈傷組織的數(shù)量； (5)PCR檢測(cè)和⑶S組織化學(xué)染色方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因愈傷PCR檢測(cè)pCAMBIA1304質(zhì)粒上帶有的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因;GUS組織化學(xué)染色，將愈傷組織浸入配制好的GUS染色液中，37°C染色過夜，愈傷組織中的藍(lán)色為報(bào)告基因⑶S組織化學(xué)染色，表明外源基因已經(jīng)整合到受體細(xì)胞的染色體中并表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述的紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為B5 培養(yǎng)基 +TDZ (O. 5-2. O mg/1) +2，4-D (I. 0-2. O mg/1) +NAA (I. 0-2. O mg/1) + 蔗糖25 g/1+植物凝膠5 g/1 ;其中，組分后的數(shù)字為該組分在B5培養(yǎng)基單位體積(I)中的加入量(g)，下同，不再作一一說明。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為B5 培養(yǎng)基+TDZ (O. 5-2. O mg/1)+2, 4-D (I. 0-2. O mg/1)+NAA (I. 0-2. O mg/1) +酪氨酸 O. 8 g/1+丙氨酸0.4 g/1+脯氨酸O. 4 g/1+賴氨酸O. 4 g/1+谷氨酸O. 4 g/1+蔗糖25 g/1+植物凝膠5 g/1。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，步驟(4)所述的恢復(fù)培養(yǎng)基的組分為B5+TDZ (O. 5-2. O mg/1)+2, 4-D (I. 0-2. O mg/1)+NAA (I. 0-2. O mg/1) +酪氨酸O. 8 g/1+丙氨酸0. 4 g/1+脯氨酸O. 4 g/1+賴氨酸O. 4 g/1+谷氨酸O. 4 g/1+蔗糖25 g/1+植物凝膠5g/1+羧節(jié)霉素250 mg/1。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，步驟(4)所述的愈傷組織篩選培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基+TDZ (O. 5-2. O mg/1)+2，4-D (I. 0-2. O mg/1) +NAA (I. 0-2. O mg/1) + 酪氨酸 O. 8g/1+丙氨酸O. 4 g/1+脯氨酸O. 4 g/1+賴氨酸O. 4 g/1+谷氨酸O. 4 g/1+蔗糖25 g/1+植物凝膠5 g/L+250 mg/L羧芐霉素+5 mg/L潮霉素。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，步驟(4)所述的繼代培養(yǎng)基的組分為B5培養(yǎng)基+TDZ (O. 5-2. O mg/1)+2, 4-D (I. 0-2. O mg/1)+NAA (I. 0-2. O mg/1)+酪氨酸 O. 8 g/1+丙氨酸0.4 g/1+脯氨酸0.4 g/1+賴氨酸0.4 g/1+谷氨酸0.4 g/1+蔗糖25 g/1+植物凝膠5 g/1 + 5 mg/1潮霉素。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，所述的共培養(yǎng)基組分為B5+TDZ(0.5-2. Omg/1)+2, 4-D (I. 0-2. O mg/1)+NAA (I. 0-2. 0 mg/1) +酪氨酸 0.8 g/1+丙氨酸 0.4 g/1+脯氨酸0· 4 g/1+賴氨酸O. 4 g/1+谷氨酸O. 4 g/1+蔗糖25 g/1+植物凝膠5 g/1。
8.由權(quán)利要求I所述方法獲得的紅豆杉轉(zhuǎn)基因愈傷組織在紅豆杉基因工程、細(xì)胞工程、代謝工程以及紅豆杉遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種獲得紅豆杉轉(zhuǎn)基因愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明包括紅豆杉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)，帶有GUS基因的植物高效表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化胚性愈傷，轉(zhuǎn)化受體材料的繼代增殖培養(yǎng)及抗性胚性愈傷組織的篩選，抗性胚性愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng)，PCR檢測(cè)和GUS基因的檢測(cè)等。本方法在紅豆杉胚性愈傷組織中表達(dá)GUS基因，成功地得到紅豆杉胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明方法獲得的紅豆杉轉(zhuǎn)基因愈傷組織可在紅豆杉基因工程、細(xì)胞工程、代謝工程以及紅豆杉遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立中具有廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102690841SQ201210201529
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月19日
發(fā)明者唐克軒, 孫小芬, 皮妍, 蔣科技, 趙東利 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)