專利名稱：草魚出血病免疫用增強劑、特異性餌料、注射劑及免疫新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提高草魚出血病的免疫效果，具體地說是在草魚出血病免疫過程中，應(yīng) 用免疫增強劑、特異性餌料、以及草魚親魚體內(nèi)注射出血病疫苗的方法。
技術(shù)背景草魚養(yǎng)殖業(yè)隨著集約化養(yǎng)殖模式的推廣得到了迅猛發(fā)展。然而，由于高密度養(yǎng)殖、 投飼頻率增加，以及水體污染等問題出現(xiàn)，感染各種疫病幾率大大升高，已給養(yǎng)殖業(yè)造 成了巨大損失。尤其是流行性出血病爆發(fā)經(jīng)常會給一些地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)帶來毀滅性的打擊。 因此，加強對出血病預防技術(shù)的研究，己成為我國當前草魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù) 之一。傳統(tǒng)的用于水生動物疾病防治方法主要有兩種， 一是化學藥物治療， 一是疫苗預防。 使用抗生素雖可部分地解決一時的問題，但抗生素大量使用，會破壞養(yǎng)殖水環(huán)境和水生 動物體內(nèi)的微生態(tài)平衡，導致某些病原體產(chǎn)生耐藥性，進而又會對人類的健康造成潛在 威脅，不符合科學發(fā)展觀的要求。目前國內(nèi)對草魚苗種的免疫方式主要有3種注射、 浸浴和口服。(1)注射因易引起魚體受傷，費時費力和不易操作，且在魚苗階段更難 操作，受到較大的限制；(2)浸浴也是目前常使用的一種給予途徑，但存在技術(shù)上仍 需前處理和免疫效果差等難題，在經(jīng)濟上也受到因成本高而制約著廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)；(3) 口服雖然是一種方便的途徑，它不會受到時間、地點和水產(chǎn)動物的大小制約，也可減少 勞動強度，但通常疫苗混合在一般餌料易損失，進入魚體后疫苗的抗原性易受消化液破 壞，疫苗用量大和免疫效果差，在應(yīng)用上受到了限制。傳統(tǒng)的疫苗預防法對于生長在水 體中的水生生物來說，疫苗預防接種操作上不方便，并且效果也不理想。綜合上述，這 三種方式都存在著不同的局限性，因此尋求草魚免疫更簡便和有效的新方法，成為亟待 解決的研究課題。發(fā)明內(nèi)容為了克服目前草魚在苗種階段的免疫接種存在的缺陷和免疫效果不理想，滿足實際 生產(chǎn)需要，本發(fā)明提供草魚出血病免疫中使用的免疫增強劑增強免疫效果；通過雌性親魚腹腔注射，依靠親魚體內(nèi)產(chǎn)生抗體傳遞給仔魚，使其產(chǎn)生初級抗體；草魚苗口服免 疫的特異性餌料加強免疫；通過這些措施綜合使用提高草魚出血病免疫效果。 實現(xiàn)上述的目的的技術(shù)方案如下草魚出血病免疫用增強劑包括下列重量配比的原料殼聚糖(脫乙?；a(chǎn)物)90-ioo份、e-葡聚糖8-10份、維生素C 1-3份、維 生素E 1-3份。用于草魚出血病免疫的特異性餌料包括下列重量配比的原料上述草魚出血病免疫用增強劑 2-2.5份輪蟲 55-65份蛋黃 28-35份淀粉 8-10份水 適量；草魚出血病疫苗的用量遵照疫苗生產(chǎn)廠家的要求，用適量水將上述預備餌料與草魚 出血病疫苗充分混合成流體得特異性餌料，即作為草魚苗的開口餌料。將草魚出血病免疫用增強劑與草魚出血病疫苗配合使用，草魚出血病疫苗的用量 遵照疫苗生產(chǎn)廠家的要求，草魚出血病免疫用增強劑的用量占草魚出血病疫苗注射液體 總量1%，充分混合30分鐘以上得注射劑，在草魚親繁殖前30 45天期間，用于雌性親 魚腹腔注射。本發(fā)明免疫增強劑中各成份作用如下殼聚糖(脫乙?；a(chǎn)物)、e-葡聚糖能刺激草魚的免疫系統(tǒng)，并增強其免疫活性，是由于動物機體內(nèi)的部分免疫活性細胞表面存在免疫刺激劑(如殼聚糖、葡聚糖)的受 體，當免疫刺激劑與巨噬細胞結(jié)合后，激活免疫細胞的活性，從而導致諸如促進巨噬細 胞吞噬與殺菌活性、通過補體途徑刺激體液免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)對抗原性物質(zhì) 的免疫應(yīng)答水平等非特異性和特異性免疫過程發(fā)生，能引起特異、非特異性免疫反應(yīng)的 活動增強。維生素C、維生素E可增強魚體免疫效果。輪蟲、蛋黃和淀粉混合后對疫苗具有高吸附能力，使用這種方法投喂，疫苗在水體 中溶解損失較少和更適口，從而減少疫苗用量。同時，它們又是草魚苗的適口餌料。本發(fā)明草魚出血病免疫用增強劑配方是通過多次實驗優(yōu)化得出的結(jié)果。 本發(fā)明的有益技術(shù)效果體現(xiàn)在下述幾個方面(1) 在草魚流行性重大疾病的免疫防治中，使用本發(fā)明免疫增強劑通過親魚注射和 魚苗口服，對草魚免疫有顯著增強效果，免疫保護力比現(xiàn)有免疫水平可提高15%以上。(2) 選擇草魚親魚在人工繁殖前30 45天，雌性親魚腹腔注入草魚出血病疫苗，使親魚在體內(nèi)產(chǎn)生相關(guān)抗體，抗體通過母體垂直遺傳給仔魚，使仔魚產(chǎn)生初步的免疫記 憶。(3) 利用輪蟲、蛋黃等高吸附能力以及對魚苗的適口性，制成特異性餌料吸附疫苗 加強免疫效果。使用這種方法投喂，疫苗在水體中溶解損失較少和更適口，從而減少疫 苗用量。選擇魚苗開口時期進行免疫，是因為魚苗消化系統(tǒng)尚未健全，各種酶對疫苗的 結(jié)構(gòu)破壞程度大大減弱，所以早期投喂效果更佳。(4) 本發(fā)明免疫增強劑及餌料使用簡便、經(jīng)濟和有效?？蓽p少免疫接種的勞動強度， 無任何不良的反應(yīng)。使用本發(fā)明免疫增強劑及餌料對草魚苗進行免疫，免疫后的草魚苗 對出血病疾病的保護率達85%以上，有效保護時間5個月，完全滿足草魚苗種生產(chǎn)要求。實驗一、魚苗不同時期投喂吸附疫苗的特異性餌料相關(guān)實驗情況如下1 材料與方法1. 1疫苗與免疫途徑草魚出血病疫苗為珠江水產(chǎn)研究所生產(chǎn)草魚凍干細胞弱毒疫苗，分6個魚苗不同時 期，從出苗的第1 6星期，每個星期作為一個試驗組，投喂特異性餌料試驗組和l對照 空白組，在100cmX60cmX80cm的水族箱中進行，每箱放魚苗30尾，試驗前停食ld ， 每組試驗魚在試驗中連續(xù)投喂特異性館料早晚各l次，第7組為對照組，不投喂特異性餌 料，試驗完畢后，分別放入不同網(wǎng)箱進行正常飼養(yǎng)。1. 2血清制備從每組試驗魚中各隨機取4尾，用切開圍心腔采血片，直接用卡介苗注射器采血， 采血后置4 。C冰箱內(nèi)，放20min后取出離心，3000 r/ min， 15 min吸取上層血清。 1. 3凝集反應(yīng)用草魚出血病的組織制成懸液作抗原,實驗魚的血清作抗體。將血清稀釋不同倍數(shù)， 分別加入等體積病毒液充分混勻后56'C水浴2 4h ，再放置室內(nèi)過夜。1.4保護力測定分別隨機取網(wǎng)箱飼養(yǎng)的實驗魚，每組10尾，并設(shè)對照組在水族箱內(nèi)進行攻毒試驗， 注射劑量l : 10病毒組織漿0.3mL ，連續(xù)觀察15d統(tǒng)計其死亡率，按下列公式求保護力。 保護力=(對照組死亡數(shù)-口服疫苗組死亡數(shù))+對照組死亡數(shù)乂100% 2 結(jié)果與分析2.1試驗組與對照組的草魚苗飼養(yǎng)結(jié)果比較經(jīng)過近4個月飼養(yǎng)，試驗組草魚苗比對照組生長良好，未發(fā)現(xiàn)異常。2.2試驗組與對照組抗體凝集價比較口服本發(fā)明餌料的草魚苗在網(wǎng)箱中經(jīng)過一段時間飼養(yǎng)后，對其進行血清抗體效價測定，測得在不同時期投喂本發(fā)明餌料的草魚苗抗體凝集價第l組為16;第2 6組均 為8;對照組為O。試驗組抗體凝集價明顯高于對照組。2.3試驗組與對照組死亡率比較室內(nèi)測定保護力結(jié)果顯示,不同時朔口服本發(fā)明餌料試驗魚死亡率各組分別為0%、 0%、 10%、 0%、 10%、 10%，對照組的死亡率為100%，獲平均保護力為85%以上，證明口服 本發(fā)明餌料對于預防草魚主要疾病很有效果，且在魚苗早期投喂效果更佳。2.4試驗組與對照組生長速度比較試驗期間對照和各試驗組增重量測定結(jié)果所示。試驗組魚體的增重量與對照組的增 重量并沒有出現(xiàn)顯著的差異(t測驗，尸>0.05)。由此說明，免疫增強劑對草魚苗種的生 長無顯著影響。3小結(jié)與討論魚類的消化過程雖然與高等脊椎動物相似，但兩者消化系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能有很大的 差異。鯉科魚類無胃，不存在胃腺，缺乏胃蛋白酶。腸的消化代替胃的消化，草魚以草 食性為主，腸短而粗；草魚消化道的組織學研究認為，草魚腸管各段的粘膜層中最主要 的兩種細胞是單層柱狀上皮細胞和杯狀細胞，消化系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的特異性是本發(fā)明草 魚苗種階段使用的免疫增強劑及餌料獲得顯著療效的原因。本發(fā)明草魚苗種階段使用的 免疫增強劑及餌料經(jīng)過腸壁進入魚體內(nèi)，在體內(nèi)刺激魚體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，這些抗體的一 部分通過粘液分布到體表。當魚體再次接觸到這類病原時，同粘液中的抗體結(jié)合而失去 感染力，從而在消化管和體表獲得局部免疫。小魚苗消化系統(tǒng)尚未健全，各種酶對疫苗的結(jié)構(gòu)破壞程度大大減弱，所以早期投喂效果更佳。本發(fā)明中草魚苗種使用上述免疫增強劑及其特異餌料的大面積應(yīng)用情況如下應(yīng)用在出血病疫苗中加入本發(fā)明免疫增強劑增強效果、在草魚親魚繁殖前30 45 天雌親魚腹腔注射疫苗進行預免疫、本發(fā)明魚苗開口餌料采用輪蟲等吸附疫苗制成特異 館料投喂，加強其免疫預防效果和減少疫苗用量。從2003年至今在安徽省合肥、巢湖、 蕪湖、滁州等地大面積推廣，共生產(chǎn)免疫草魚苗8千萬尾以上，草魚苗種養(yǎng)殖階段對出 血病的保護力在85%以上，有效保護時間5個月，完全滿足草魚苗種生產(chǎn)要求，獲得了 較好的預防效果。實驗二、本發(fā)明與傳統(tǒng)的口服疫苗方法免疫草魚出血病效果的比較如下 采用本發(fā)明中的方法，即草魚出血病免疫中使用的免疫增強劑、草魚苗口服免疫的 特異性館料、以及通過草魚雌性親魚腹腔注射出血病疫苗的免疫方法，與傳統(tǒng)單純的口 服免疫效果相比較。血清制備、凝集反應(yīng)、保護力測定的方法同實驗一所述的方法。結(jié)果顯示在抗體凝集價差異不顯著，實驗室攻毒實驗和大面積推廣試驗，草魚出血病保護力提高存在著顯著差異，平均保護力提高15%以上。 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步地說明。實施例1:取下列重量份的原料殼聚糖(脫乙酰基產(chǎn)物)90克、,-葡聚糖8克、維生素C 1克和維生素E l克， 充分混合均勻，即得草魚出血病免疫用增強劑。 取下列重量份的原料上述草魚出血病免疫用增強劑2份、輪蟲60份、蛋黃30份和淀粉8份，將上述原 料充分混合得預備餌料；將預備餌料與草魚出血病疫苗充分混合吸附15分鐘后以上得 特異性餌料，作為草魚苗的開口餌料；草魚出血病疫苗為珠江水產(chǎn)研究所生產(chǎn)草魚凍干細胞弱毒疫苗，用量按生產(chǎn)廠家要 求。草魚出血病免疫用增強劑用量為疫苗注射總量的1%，充分混合30分鐘后，在草魚 親魚繁殖前30 45天，雌性親魚腹腔注射，進行預免疫。實施例2:取下列重量份的原料殼聚糖(脫乙?；a(chǎn)物)95克、e-葡聚糖9克、維生素C2克和維生素E2克，充 分混合均勻即得草魚出血病免疫用增強劑。 取下列重量份的原料上述草魚出血病免疫用增強劑2.2份、輪蟲55份、蛋黃28份和淀粉9份，將上述 原料充分混合得預備餌料；將預備餌料與草魚出血病疫苗充分混合吸附15分鐘后以上 得特異性餌料，作為草魚苗的開口餌料；其它同實施例l。實施例3:取下列重量份的原料殼聚糖(脫乙?；a(chǎn)物)100克、e-葡聚糖10克、維生素C3克和維生素E3克， 充分混合均勻即得草魚出血病免疫用增強劑。取下列重量份的原料上述草魚出血病免疫用增強劑2.5份、輪蟲65份、蛋黃35份和淀粉10份，將上 述原料充分混合得預備餌料；將預備餌料與草魚出血病疫苗充分混合吸附15分鐘后以 上得特異性餌料，作為草魚苗免疫的開口餌料；其它同實施例l。
權(quán)利要求
1. 草魚出血病免疫用增強劑，其特征在于包括下列重量份的原料殼聚糖90-100份β-葡聚糖 8-10份維生素C 1-3份維生素E 1-3份。
2、 用于草魚出血病免疫的特異性餌料 草魚出血病免疫用增強劑 輪蟲淀粉 水8-10份 1-3份1- 3份。其特征在于包括下列重量份的原料:2- 2.5份 55-65份 28-35份 8-10份 適量；將上述原料充分混合得預備餌料，將預備餌料再與草魚出血病疫苗充分混合15分 鐘以上得特異性餌料，草魚出血病疫苗的用量遵照生產(chǎn)廠家的要求。
3、用于草魚親魚對出血病進行預免疫的注射劑及免疫新方法，其特征在于包括下 列重量份的原料草魚出血病免疫用增強劑 1份草魚出血病疫苗 100份；將上述原料充分混合30分鐘以上得注射劑，在草魚親魚繁殖前30 45天期間，用 于雌性親魚腹腔注射。
全文摘要
本發(fā)明涉及草魚出血病免疫用增強劑、特異性餌料、注射劑及免疫新方法?？朔四壳安蒴~在苗種階段的主要疾病免疫接種存在的缺陷。免疫增強劑配方殼聚糖、β-葡聚糖、維生素C和維生素E；草魚苗的開口特異餌料配方取上述免疫增強劑、輪蟲、蛋黃和淀粉制得預備餌料，將預備餌料與相關(guān)多聯(lián)疫苗充分混合得草魚苗的開口餌料。在草魚出血病疫苗中加入本發(fā)明免疫增強劑可增強其免疫效果、在草魚親繁殖前30～45天雌親魚腹腔注射上述草魚出血病疫苗和免疫增強劑進行初級預免疫、魚苗開口餌料采用輪蟲等吸附疫苗制成本發(fā)明特異餌料投喂，加強其免疫預防效果和減少疫苗用量。本發(fā)明解決了草魚在苗種階段的免疫接種操作困難和效果差等難題。
文檔編號A23K1/18GK101269218SQ200810025020
公開日2008年9月24日 申請日期2008年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月23日
發(fā)明者磊 佘, 盧文軒, 李艷和, 潘庭雙, 王永杰, 宇 陳 申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所