專利名稱：：亞麻游離花粉培養(yǎng)基及亞麻游離花粉培養(yǎng)方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及亞麻生物
技術領域：
，主要涉及亞麻游離花粉培養(yǎng)技術。
背景技術：
：我國亞麻花藥培養(yǎng)研究始于二十世紀70年代，并由我國首次從亞麻花藥培養(yǎng)中獲得花粉植林，但亞麻花藥愈傷組織的誘導率和綠苗分化率很低，且存在大量的從體細胞發(fā)育而來的二倍體植林，給單倍體鑒定帶來很大困難，嚴重制約了亞麻單倍體育種進程。游離花粉的培養(yǎng)具有其獨特的優(yōu)越性，首先，游離花粉是單倍的性細胞，游離花粉的培養(yǎng)不僅可減少倍性鑒定的工作量，而且它還可作為高效的細胞篩選系統(tǒng)，使農(nóng)藝性狀迅速穩(wěn)定，避免后代的分離。其次，它可作為轉基因的受體，通過染色體加倍，使外源基因快速純和。在亞麻游離花粉培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基是影響花粉產(chǎn)生愈傷組織誘導率和花粉綠苗的分化率主要外因條件。因此，本領域迫切需要建立亞麻游離花粉培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種新型的亞麻游離花粉培養(yǎng)基及亞麻游離花粉培養(yǎng)方法，以達到建立亞麻游離花粉培養(yǎng)系統(tǒng)、進一步提高亞麻花粉愈傷組織的誘導率和花粉綠苗分化率、加快亞麻花培育種進程的目的。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種亞麻游離花粉培養(yǎng)基，包括亞麻游離花粉愈傷組織誘導培養(yǎng)基HF,、亞麻游離花粉愈傷組織分化培養(yǎng)基HF2和亞麻花粉綠苗生根培養(yǎng)基HF"其特征在于①、亞麻游離花粉愈傷組織誘導培養(yǎng)基HFi含有1/2N6,1.5mg/12.4—D,0.5mg/L6—BA;1/2^的成分為:硝酸鉀1415mg/L,石克酸4妄231mg/L,辟^酸4美92mg/L,氯化《丐83mg/L，磷酸二氫鉀200mg/L,硼酸0.8mg/L,石克酸錳2.2mg/L,石典化鉀0.4mg/L,石克酸鋅0.75mg/L，甘氨酸1.Omg/L，鹽酸石克胺素1.Omg/L,鹽酸吡。多素0.5mg/L,煙酸0.5mg/L,石克酸亞鐵27.8mg/L，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,蔗糖30g/L,瓊脂8g/L;PH值為5.5;②、亞麻游離花粉愈傷組織分化培養(yǎng)基肝2含有1/2N6，2.0mg/L6一BA,0.5mg/LIAA;1/2仏的成分為硝酸鉀1415mg/L,;琉酸銨231mg/L，硫酸鎂92mg/L，氯化鈣83mg/L,磷酸二氫鉀200mg/L,硼酸0.8mg/L,石克S臾4孟2.2mg/L,不典化鐘0.4mg/L,碌^酸辭0.75mg/L,甘氨酸1.0mg/L,鹽酸辟u胺素1.0mg/L,鹽酸吡口多素0.5mg/L,煙酸0.5rag/L,石克酸亞寺失27.8mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,蔗糖30g/L,瓊脂8g/L;PH值為5.5;③、亞麻花粉綠苗生根培養(yǎng)基HF3含有1/2N6,0.2mg/LNAA，0.2mg/LIAA;1/2&的成分為:硝酸鉀1415mg/L,硫酸銨231mg/L,;琉酸4美92mg/L,氯化鈣83mg/L,磷酸二氪鉀200mg/L,硼酸0.8mg/L,石克酸錳2.2mg/L,石典化鉀0.4mg/L,碌u酸鋅0.75mg/L,甘氨酸1.0mg/L,鹽g吏碌u胺素1.0mg/L,鹽酸吡噴素0.5mg/L,煙酸0.5mg/L,碌u酸亞4失27.8mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L,蔗糖30g/L,瓊脂8g/L;PH值為5.5;一種使用上述亞麻游離花粉培養(yǎng)基的亞麻游離花粉培養(yǎng)方法，其特征在于該方法包括步驟是①、取花粉小孢子處于單核中后期的亞麻花蕾，放入2°/。的次氯酸鈉溶液中消毒15分鐘，再用無菌水沖洗3次，取出花藥放入盛有無菌水的培養(yǎng)皿中，用針刺釋放法將花粉粒釋放到無菌水中，再通過過濾離心收集花粉；②、調整花粉密度5.0x1()2個/ml，制備成花粉懸浮液，接種到亞麻花粉愈傷組織誘導培養(yǎng)基HF,中，誘導花粉愈傷組織，在18—25°C、光照強度為2000LX、光照時間8小時/天的條件下培養(yǎng)；③、當亞麻花粉愈傷組織長到3—5mm左右，轉入亞麻花粉愈傷組織分化培養(yǎng)基HF2中，誘導花粉綠苗的分化，在18—25°C、光照強度為2000LX、光照時間12小時/天的條件下培養(yǎng)；④、將步驟③得到的植抹轉入亞麻花粉綠苗生根培養(yǎng)基HF3中，在18—25。C、光照強度為2000LX、光照時間為15小時/天的條件下培養(yǎng)，一般7—15天可陸續(xù)生根。本發(fā)明的關鍵是找到了適宜的培養(yǎng)方法，篩選出高效培養(yǎng)基，該發(fā)明是在多年的亞麻花粉培養(yǎng)及對多種培養(yǎng)基應用研究的基礎上，從調整大量元素、微量元素、植物激素入手，篩選出亞麻游離花粉培養(yǎng)基HFhHFs和HF3，并首次建立了亞麻游離花粉培養(yǎng)方法，簡化了亞麻倍性鑒定的復雜過程，且以HFi培養(yǎng)基的花粉愈傷組織誘導率、HF2培養(yǎng)基的花粉綠苗分化率和HF3培養(yǎng)基的花粉綠苗生根率均明顯高于已有技術。具體實施例方式下面舉實例對本發(fā)明及實施效果進行詳細描迷。(1)以1/2Ns培養(yǎng)基成分為基礎，通過調整植物激素2.4—D(0.1一3.Omg/L)、6—BA(0.1—3.Omg/L)的濃度并進行配比實驗，篩選出亞麻游離花粉最佳誘導培養(yǎng)基HF!，其激素配比濃度為1.5mg/L2.4一D,0.5mg/L6—BA;通過調整才直物激素6—BA(0.1一3.Omg/L)、(0.1一2.Omg/L)IAA的濃度并進行配比實驗，篩選出亞麻游離花粉愈傷組織分化培養(yǎng)基HF2,其激素配比濃度為1.5mg/L6—BA,0.5mg/LIAA;通過調整才直物激素NAA(O—O.5mg/L)、(O—O.5mg/L)IAA的濃度進行配比實驗，篩選出亞麻花粉植林生根培養(yǎng)基HF3，其激素配比濃度為0.2mg/LNAA，0.2mg/LIAA;(2)誘導培養(yǎng)基肌中亞麻游離花粉愈傷組織誘導率。我們接種5個雜交組合的亞麻花粉。5個雜交組合各2ml花粉懸浮液(花粉密度為5.Gx1(^個/ml)分別接種在HFj咅養(yǎng)基上，進行花粉愈傷組織的誘導，在18—25。C，光照強度為2000LX,光照時間8小時，培養(yǎng)15—30天，實驗結果表明培養(yǎng)基HFi花粉愈傷組織的i秀導率為20.6—30.8%。表2培養(yǎng)基肌中不同雜交組合對花粉愈傷組織誘導率的影響雜交組合代號接種花粉數(shù)(個)愈傷組織(塊)愈傷組織誘導率(%)9601100030830.89605100028628.69712100025125.19715100020620.69718100021921.9(3)HFi與MS、B5、Ns培養(yǎng)基對比實驗。取同一雜交組合的花粉接種在MS、B5、IHFi培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基均接種4ml花粉懸浮花粉懸浮液(花粉密度為5.0x1()2個/ml),四種培養(yǎng)基中激素配比均為1.5mg/L2.4—D,0.5mg/L6—BA。在18一25。C,光照強度為2000LX,光照時間8小時，培養(yǎng)15—30天，實驗結果表明HFi、MS、B5、N6四種培養(yǎng)基花粉愈傷組織的誘導率分別為29.7%、6.2°/。、8.6%、18.5%。以HF^咅養(yǎng)基花粉愈傷組織誘導率最高。表3不同培養(yǎng)基對花粉愈傷組織誘導率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(4)亞麻花粉綠苗分化。當花粉愈傷組織長到3—5mm左右，轉入亞麻花粉愈傷組織分化培養(yǎng)基HF2中，誘導花粉綠苗的分化。實驗了5個雜交組合的亞麻花粉愈傷組織在培養(yǎng)基HF2中花粉綠苗的分化情況。培養(yǎng)條件為溫度18—25。C,光照強度為2000LX,光照時間12小時，培養(yǎng)20—30天，并統(tǒng)計花粉綠苗的分化率。表4實驗結果表明，2培養(yǎng)基的花粉綠苗分化率為4.5—11.5%。表4不同雜交組合的愈傷組織在HF2培養(yǎng)基中花粉綠苗分化率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(5)亞麻花粉植林生根培養(yǎng)基HF3,當花粉綠苗長到5cm左右時，將其轉到HF3培養(yǎng)基中，在18—25°C，光照強度為2000LX,光照時間15小時條件下培養(yǎng)。共轉移568棵花粉綠苗進行生根實驗，有541棵苗生根，生根率達95.2%。權利要求1、一種亞麻游離花粉培養(yǎng)基，包括亞麻游離花粉愈傷組織誘導培養(yǎng)基HF1、亞麻游離花粉愈傷組織分化培養(yǎng)基HF2和亞麻花粉綠苗生根培養(yǎng)基HF3，其特征在于①、亞麻游離花粉愈傷組織誘導培養(yǎng)基HF1含有1/2N6，1.5mg/L2.4-D，0.5mg/L6-BA；1/2N6的成分為硝酸鉀1415mg/L，硫酸銨231mg/L，硫酸鎂92mg/L，氯化鈣83mg/L，磷酸二氫鉀200mg/L，硼酸0.8mg/L，硫酸錳2.2mg/L，碘化鉀0.4mg/L，硫酸鋅0.75mg/L，甘氨酸1.0mg/L，鹽酸硫胺素1.0mg/L，鹽酸吡哆素0.5mg/L，煙酸0.5mg/L，硫酸亞鐵27.8mg/L，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂8g/L；②、亞麻游離花粉愈傷組織分化培養(yǎng)基HF2含有1/2N6，2.0mg/L6-BA，0.5mg/LIAA；1/2N6的成分為硝酸鉀1415mg/L，硫酸銨231mg/L，硫酸鎂92mg/L，氯化鈣83mg/L，磷酸二氫鉀200mg/L，硼酸0.8mg/L，硫酸錳2.2mg/L，碘化鉀0.4mg/L，硫酸鋅0.75mg/L，甘氨酸1.0mg/L，鹽酸硫胺素1.0mg/L，鹽酸吡哆素0.5mg/L，煙酸0.5mg/L，硫酸亞鐵27.8mg/L，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂8g/L；③、亞麻花粉綠苗生根培養(yǎng)基HF3含有1/2N6，0.2mg/LNAA，0.2mg/LIAA；1/2N6的成分為硝酸鉀1415mg/L，硫酸銨231mg/L，硫酸鎂92mg/L，氯化鈣83mg/L，磷酸二氫鉀200mg/L，硼酸0.8mg/L，硫酸錳2.2mg/L，碘化鉀0.4mg/L，硫酸鋅0.75mg/L，甘氨酸1.0mg/L，鹽酸硫胺素1.0mg/L，鹽酸吡哆素0.5mg/L，煙酸0.5mg/L，硫酸亞鐵27.8mg/L，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂8g/L。2、一種使用如權利要求1所述亞麻游離花粉培養(yǎng)基的亞麻游離花粉培養(yǎng)方法，其特征在于該方法包括步驟是①、取花粉小孢子處于單核中后期的亞麻花蕾，放入2°/。的次氯酸鈉溶液中消毒15分鐘，再用無菌水沖洗3次，取出花藥放入盛有無菌水的培養(yǎng)亞中，用針刺釋放法將花粉粒釋放到無菌水中，再通過過濾離心收集花粉；②、調整花粉密度5.0x1()2個/ml,制備成花粉懸浮液，接種到亞麻花粉愈傷組織誘導培養(yǎng)基HF,中，誘導花粉愈傷組織，在18_25°C、光照強度為2000LX、光照時間8小時/天的條件下培養(yǎng)；③、當亞麻花粉愈傷組織長到3—5mm左右，轉入亞麻花粉愈傷組織分化培養(yǎng)基HF2中，誘導花粉綠苗的分化，在18—25°C、光照強度為2000LX、光照時間12小時/天的條件下培養(yǎng)；④、將步驟③得到的植抹轉入亞麻花粉綠苗生根培養(yǎng)基HF3中，在18—25°C、光照強度為2000LX、光照時間為15小時/天的條件下培養(yǎng)。全文摘要亞麻游離花粉培養(yǎng)基及亞麻游離花粉培養(yǎng)方法屬于生物
技術領域：
；其亞麻游離花粉愈傷組織誘導培養(yǎng)基HF₁含有1/2N₆，1.5mg/L2.4D，0.5mg/L6-BA；亞麻游離花粉愈傷組織分化培養(yǎng)基HF₂含有1/2N₆，2.0mg/L6-BA，0.5mg/LIAA；亞麻花粉綠苗生根培養(yǎng)基HF₃含有1/2N₆，0.2mg/LNAA，0.2mg/LIAA；采用過濾離心收集花粉制備成花粉懸浮液、誘導花粉愈傷組織、誘導花粉綠苗分化和花粉綠苗生根培養(yǎng)四個步驟完成亞麻游離花粉培養(yǎng)；本發(fā)明篩選出亞麻游離花粉培養(yǎng)基HF₁、HF₂和HF₃，并首次建立了亞麻游離花粉培養(yǎng)方法，簡化了亞麻倍性鑒定的復雜過程，花粉愈傷組織誘導率、花粉綠苗分化率和花粉綠苗生根率均明顯高于已有技術。文檔編號A01H4/00GK101292629SQ20081006475公開日2008年10月29日申請日期2008年6月18日優(yōu)先權日2008年6月18日發(fā)明者宋淑敏申請人:黑龍江省科學院亞麻綜合利用研究所