專利名稱：涉及植物半矮化的sd1基因和其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分離和鑒定植物半矮化的基因和利用該基因的植物半矮化。
背景技術：
1956年在Taiwan,新的稻品種臺中本地l號(Taichung Native l)獲得了在 常規(guī)的釉稻品種中觀察不到的高產(chǎn)量，臺中本地l號由當?shù)匕氚贩N低腳 鳥尖(Dee-geo-woo畫gen)禾口抗病菜園品種(Tsai-yuang-chung)雜交育成。在1960 年后期，相同的半矮化品種低腳烏尖和印度尼西亞優(yōu)質(zhì)長稈(long-culm)稻品 種(Peta)于菲律賓國際水稻研究所(IRRI)雜交育成。由于其顯著改進了單位 面積的產(chǎn)量，所以將該半矮化品種[IR8]稱作"奇跡梧(miraclerice)"。"奇跡稻 "播種的日益擴大拯救了亞洲的食物危機并且也引起了 "綠色革命"。臺中 本地1號和IR8對高產(chǎn)貢獻的基因是源于低腳鳥尖的半矮化基因。然而， 時至今日，僅僅確定了W/基因的大致染色體基因座(Maeda等，Breeding Science 47: 317-320， 1997)。
一般而言，植物，尤其是有用的農(nóng)業(yè)作物例如水稻，如果想增加它們 的產(chǎn)量則必須在非常肥沃的條件(即富集氮的條件)下種植。然而，在這種條 件下植抹會變得非常高使得其受臺風等影響易于倒伏，結(jié)果是降低產(chǎn)量。 解決該問題的一種方法是矮化植抹并將它們在豐富的肥料條件下培養(yǎng)。 基因僅稍稍矮化植林，并沒有因此而降低分蘗數(shù)和谷粒大小，或降低種子 數(shù)。其還可以在豐富的肥料條件下抑制植物倒伏并改進抹型。在這種情形 下，W/基因使表型不同于那些已知的矮化基因W和d6/所誘導的表型 (Ashikari M.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96: 10284-10289, 1999; Yamamuro C.等，Plant Cell, 12: 1591-1605,2000)。這種抗倒伏的改善4吏得植物能在肥沃
4的條件下種植；同樣地，植抹型的改善增強物質(zhì)的生產(chǎn)能力和同化產(chǎn)物向 谷粒和種子的分配率。時至今日，利用這些特性，許多水稻品種，包括在 世界范圍內(nèi)有最大種植面積的IR64,已經(jīng)通過回交被賦予了由W7基因誘導 的表型以育出新的水稻品種。
另 一方面，隨著最近人口爆炸式的劇增，谷物產(chǎn)量需要進一步增加50%, 因而迫切地需要培育出多種高產(chǎn)有用的作物品種。所以為了提高各種植物， 特別是包括水稻(rice)的有用的農(nóng)作物的產(chǎn)量，利用W7基因誘導在肥沃條件 下穩(wěn)定地提高產(chǎn)量是有利的。然而，分離和鑒定包括水稻在內(nèi)的植物的W7 基因尚未報道過。
發(fā)明公開
本發(fā)明是在這些情況下進行的。本發(fā)明的目的是提供一種涉及植物半 矮化的W7基因。此外，本發(fā)明另一目的是提供一種使用W7基因使植物半矮 化的方法。
植物激素赤霉素(GA)涉及在許多生長進程，例如萌發(fā)，莖/葉的延伸， 以及花芽的形成。GA合成途徑已經(jīng)被詳細研究，并且編碼催化GA合成的酶 的基因已經(jīng)從擬南芥，水稻，玉米，南瓜等中分離出(Hedden和Kamiya, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 431-460， 1997)。在涉及GA合成或遺傳 信息傳遞的基因變得異常時，植物不能將GA用于其生長，因而變得矮化。 事實上，許多報道已經(jīng)顯示缺乏涉及GA合成或遺傳信息傳遞的基因會產(chǎn)生 矮化突變體(Hedden和Kamiya, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 431-460,1997)。因此，本發(fā)明人推測GA涉及水稻的半矮化，并將GA應用 于W7突變的低腳鳥尖(Dee-geo-woo-gen)以檢測GA反應性。結(jié)果，使用GA 導致低腳鳥尖(Dee-geo-woo-gen)莖/葉的延伸。此外， 一種GA生物合成的酶， C20氧化酶，在GA生物合成途徑中催化下面的步驟GA53-GAAA-GAW-GAaO—GAU-GAlS-GAZA-GA^ 現(xiàn)在C20氧化酶已經(jīng)/人南瓜，擬南芥和 水稻中分離出來(Lange等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.， 91: 8552-8556, 1994; Phillips等，Plant physiol. 108: 1049-1057， 1995; Xu等，Proc. Natl. Acad, Sci. USA.， 92: 6640-6644, 1995; Toyomasu等，Physiol. Plant. 99: 111-118, 1997), 并且據(jù)報道在擬南芥基因組中至少存在三種C20氧化酶基因(Phillips等, Plant Physiol. 108: 1049-1057, 1995)。由此可見，本發(fā)明人推測W7基因是涉及GA生物合成的基因，尤其是植 物基因組中重復出現(xiàn)的C20氧化酶基因。如果如此，這就解釋了為什么水稻 ^^基因不誘導植抹型的顯著矮化。因此，本發(fā)明人意欲首先分離和鑒定了 擬南芥C20氧化酶的水稻對應物(couterpart)。
結(jié)果，本發(fā)明人成功地分離和鑒定了 一種新的水稻GA C20氧化酶基因。 此外，本發(fā)明人又研究該基因的染色體座位是否接近水稻W(wǎng)7座位，以及在 水稻半矮化品種中是否該新的水稻GA C20氧化酶基因突變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基 因的染色體基因座非常接近于水稻^1 的基因座。此外在確定和比較一些包 含低腳鳥尖(Dee-geo-woo-gen)和相應野生型的W/突變體中GA C20氧化酶 基因的核苷酸序列時，該GA C20氧化酶基因在所有的突變體中W/發(fā)生突 變。因此，第一次表明水稻W(wǎng)7基因等同于編碼新的C20氧化酶的基因，暗 示植物W7基因(C20氧化酶基因)的突變會誘導植物的半矮化。
植物W/基因可通過標記選擇而用于高效育種。在利用常規(guī)雜交育種來 制備導入了 W/基因的品種時，例如在將W/基因?qū)肴毡咀顝V泛種植的品種 Koshihikari時，有必要通過將Koshihikari與IR64或具有W/基因的品種雜交來 制備F 1,接著將F 1與Koshihikari重復回交直至除了W7基因座的所有染色體 被Koshihikari的那些所取代。由于利用W7基因作為分子標記允許人們有效 地選擇具有僅被W7基因取代的Koshihikari染色體的個體，因而分離W7基因 節(jié)省了育種所需的大量時間和勞動，而且，植物W/基因可以允許使用分子
生物學技術諸如反義和RNAi方法制備植物轉(zhuǎn)化體。還可預計提高有用農(nóng)作 物，包括谷物，諸如小麥，大麥，玉米，蔬菜和果樹的產(chǎn)量，而且通過矮 化賦予觀賞植物，諸如觀葉植物(foliageplants)以美學價值，培育出新品種。
具體地，本發(fā)明涉及分離和鑒定植物半矮化的基因，和利用該W/基因 使植物半矮化，更具體的是提供下述的用于半矮化植物的根據(jù)(a)到(c)中任一所述的DNA:
(a) 編碼與植物基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的反義RNA的DNA;
(b) 編碼具有特異切割植物基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酶活性的RNA的DNA;
和
(c) 編碼通過共抑制效果抑制植物基因表達的RNA的DNA; [2][1]的DNA，其中所述植物W/基因是水稻W(wǎng)7基因；或[2]的DNA的載體；[4]保持[1]或[2]的DNA處于可表達狀態(tài)的轉(zhuǎn)化植物細胞； [4]的轉(zhuǎn)化植物細胞，其中所述植物是水稻；包含[4]或[5]轉(zhuǎn)化植物細胞的植物轉(zhuǎn)化體； —種植物轉(zhuǎn)化體，其是[6]的植物轉(zhuǎn)化體的后代或克??；[6]或[7]植物轉(zhuǎn)化體，其中所述植物是水稻； [6]到[8]中任一植物轉(zhuǎn)化體的繁殖材料；制備[6]到[8]中任一植物轉(zhuǎn)化體的方法，其中所述方法包括下述步 驟將[1]或[2]的DNA導入植物細胞，以及從所述植物細胞再生植物體； 一種半矮化植物的方法，其中所述方法包括抑制植物細胞中內(nèi)源 W/基因表達的步驟； [ll]的方法，其中表達的抑制通過將[1]或[2]的DNA導入植物實現(xiàn)； [10]到[12]中任一項的方法，其中所述植物是水稻;和編碼水稻sdl蛋白的DNA。
本發(fā)明揭示植物W/基因的突變誘導植物半矮化。因此，在肥沃的條件 下通過抑制植物^^基因的表達有可能制備出能獲得穩(wěn)定高產(chǎn)量的半矮化品 種。
本發(fā)明所述的"植物半矮化"是指僅使植抹的高度稍微矮化而沒有降 低分蘗數(shù)，谷粒大小及種子數(shù)。通過這種半矮化，植林被賦予了在肥沃的 條件下的抗倒伏性并且其植抹型得以改善。結(jié)果，可以獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)量。
在本發(fā)明中所述"植物W7基因"指的是編碼植物C20氧化酶的基因， 并且包括水稻W(wǎng)/基因(編碼SEQ ID NOs: 3和4的DNA)，擬南芥W/基因 (Phillips等，Plant physiol. 108: 1049-1057， 1995)，和源于其它植物的W/基因。
可以利用雜交(Southern等，Journal of Molecular Biology 98: 503， 1975) 和聚合酶鏈式反應(PCR) (Saiki等,Science 230: 1350-1354, 1985; Saiki等, Science 239: 487-491, 1988)技術實施鑒定未知"植物W/基因"。也就是，本 領域的技術人員可以分離與來自其它目的植物的W7基因高度同源的DNAs, 并測定它們的序列，例如通過用水稻W(wǎng)/基因的核普酸序歹ij(編碼SEQ ID NOs: 3和4的DNA)或其部分作為探針，或通過用與W/基因的核芬酸序列特 異雜交的寡核苷酸作為引物。雜交反應通常在嚴謹條件下進行以分離所述DNA，嚴謹?shù)碾s交條件包 括諸如下面的條件6 M尿素，0.4% SDS, 0.5x SSC;和那些有類似嚴謹度 的條件。分離具有更高同源性的DNAs可以通過更高嚴謹度條件下實施雜交 而達到，例如，6M尿素，0.4%SDS,和0.1xSSC?？梢詫⒎蛛x的DNAs通 過已知的方法測序。
是否所分離的DNA是編碼sdl蛋白的DNA通?？梢酝ㄟ^序列間的同源 性程度而判斷。使用諸如BLASTN (核酸序列水平)或BLASTX (氨基酸序列 水平)的程序測定(Altschul等，J.Mol.Biol. 215:403-410， 1990)。該程序基于 Karlin和Altschul所述的算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268， 1990; Proc. Natl, Acad. Sci. USA 90: 5873-5877， 1993)。在根據(jù)BLASTN分析核苦酸 序列時，參數(shù)設置為例如得分(score) = 100和字段長(word length )= 12。另一 方面，為了通過BLASTX分析氨基酸序列，參數(shù)設置為例如得分=50和字段 長=3。此外，在氨基酸序列使用Gapped BLAST程序分析時，分析可以按照 Altschul等所述進行(Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997)。利用BLAST和 Gapped BLAST程序時使用各程序的默認參數(shù)。這些分析方法的具體技術在 本4貞i或是已^口的(見http:〃www.ncbi.nlm.nih,gov.)。
本發(fā)明中，并不對通過抑制W/基因的表達而賦予半矮化性狀的植物進 行具體限定。因此，任何植物可以被半矮化，盡管優(yōu)選的是使用有用的農(nóng) 作物或觀賞植物。有用的農(nóng)作物包括，例如，單子葉植物，諸如水稻，玉 米，小麥和大麥，以及雙子葉植物諸如油菜，大豆，棉花，蕃茄，馬鈴薯。 觀賞植物(ornamental plant)包括花卉植物，諸如菊花，玫瑰，康乃馨 (carnation), 和仙客來(cyclamen)。
根據(jù)本發(fā)明的方法制備半矮化的植物是通過下述方法得到的將抑制
基因表達的DNA插入合適的載體，將該載體導入植物細胞，然后再生 所得的轉(zhuǎn)化的植物細胞。術語"抑制^//基因的表達"指的是抑制《//基因 轉(zhuǎn)錄和抑制翻譯成蛋白質(zhì)。它還包括DNA表達的停止和這種表達的降低。
技術的方法而得以抑制。Ecker等首先證實使用瞬時基因表達的方法通過電 穿孔將反義RNA導入植物細胞的反義效果(Ecker和Davis (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5372)。其后，據(jù)報道耙基因的表達通過表達反義 RNAs而在煙草和矮牽?；ㄖ薪档?Krol等(1988) Nature 333: 866)。反義技術現(xiàn)在已經(jīng)被確立為抑制植物中基因表達的 一種方法。通過反義核酸多重
因素導致靶基因表達受到抑制。這些包括由三鏈形成抑制轉(zhuǎn)錄的起始； 在RNA聚合酶已經(jīng)形成局部開放環(huán)結(jié)構(gòu)的位點處形成雜交而抑制轉(zhuǎn)錄；與 不斷繼續(xù)合成的RNA形成雜交而抑制轉(zhuǎn)錄；由在內(nèi)含子和外顯子交接處形 成雜交抑制拼接；由在剪接體形成的位點形成雜交抑制剪接；與mRNA形 成雜交而抑制mRNA由核向細胞質(zhì)的移動；在加帽位點或添加poly A的位 點形成雜交而抑制拼接；對于翻譯起始因子在結(jié)合位點形成雜交而抑制翻 譯的起始；在起始密碼子附近的核糖體結(jié)合位點形成雜交而抑制翻譯；在 mRNA的翻譯區(qū)中或在多核糖體結(jié)合的位點形成雜交而抑制肽鏈的延長； 和在核酸和蛋白質(zhì)相互作用的位點形成雜交而抑制基因表達。這些因素通 過抑制轉(zhuǎn)錄，剪接，和/或翻譯過程而抑制靶基因的表達(Hirashima和Inoue, "Shin Seikagaku Jikken Koza (New Biochemistry Experimentation Lectures) 2, Kakusan (Nucleic Acids) IV, Idenshi No Fukusei To Hatsugen (Replication and Expression of genes)", Nihon Seikagakukai (The Japanese Biochemical Society) (ed.), Tokyo Kagaku Dozin, pp. 319-347， (1993》。
一實施方案中，如果將反義序列設計成與接近該基因mRNA的5'末端的非 翻譯區(qū)互補，將會有效地抑制基因的翻譯。還可能使用與編碼區(qū)或3'側(cè)非 翻譯區(qū)互補的序列。因此，本發(fā)明所用反義DNA包括具有基因非翻譯區(qū)和 翻i奪區(qū)反義序列的DNA。將所要使用的反義DNA連接到合適啟動子的下 游，并且，優(yōu)選的是，將包含轉(zhuǎn)錄終止信號的序列連接到3，側(cè)。
基于SEQ ID NO: 3的DNA的序列信息，例如通過^5克代磷酸法，制備 反義DNA(Stein, Nucleic. Acid. Res. 16: 3209-3221， 1988)。將所制得的DNA 通過已知的方法轉(zhuǎn)染至目的植物。反義DNA的序列優(yōu)選的是與要轉(zhuǎn)化的植 物的內(nèi)源基因或其部分互補的序列，然而并不需要100%的互補，只要其可 以有效地抑制基因表達。轉(zhuǎn)錄RNA優(yōu)選的是90。/。或更高，甚至是更優(yōu)選的 是95%或更高地與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補。為了有效地通過反義序列抑制 靶基因的表達，反義DNA應至少長為15個核苷酸甚至更長，優(yōu)選的是100 個核苷酸或更多，更優(yōu)選的是500個核苷酸或更長。通常所用的反義DNA 一般是短于5 kb,更優(yōu)選的是短于2.5 kb。
編碼核酶的DNA可用于抑制內(nèi)源基因的表達。核酶是指具有催化活性的RNA分子。RNA雖然具有各種核酶活性，^旦是對核酶作為切割RNA的 酶的研究使得能夠設計特異切割RNA位點的目的核酶。而諸如I組內(nèi)含子 類型和包含于RnaseP中的MIRNA核酶可以是大的，具有400個核香酸或 更多，也有更小的，包括具有約40個核苷酸活性結(jié)構(gòu)域的錘頭型和發(fā)夾型 (Koizumi和Ohtsuka (1990) Tanpakushitsu Kakusan Kohso (Protein, Nucleic acid, and Enzyme) 35:2191》
錘頭型核酶的自我切割結(jié)構(gòu)域在序列G13U14C15的3，側(cè)C15處切割。 在U14和在第九位的A之間形成的核苷酸對被認為對于核酶的活性是重 要的。而且，顯示當在第15位的核芬酸是A或U而不是C時，切割也可 以發(fā)生(Koizumi等(1988) FEBS Lett. 228: 225)。如果核酶的底物結(jié)合位點 ^^沒計為與靶位點臨近的RNA序列互補，可以生成能識別耙RNA內(nèi)序列 UC， UU或UA限制酶樣RNA切割核酶(Koizumi等(1988) FEBS Lett. 239: 285; Koizumi禾口 Ohtsuka (1990) Tanpakushitsu Kakusan Kohso (Protein, Nucleic acid, and Enzyme), 35: 2191; Koizumi等(1989) Nucleic Acids Res. 17: 7059)。
發(fā)夾型核酶也可以用于本發(fā)明中。例如煙草環(huán)斑病毒衛(wèi)星RNA負鏈中 可以發(fā)現(xiàn)發(fā)夾型核酶(Buzayan (1986) Nature 323: 349)。該酶也顯示耙特異性 地切割RNA (Kikuchi和Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19: 6751; Kikuchi (1992) Kagaku To Seibutsu (Chemistry and Biology) 30: 112)。
被設計用于切割靶的核酶與啟動子諸如花椰菜花葉病毒35S啟動子以 及轉(zhuǎn)錄終止序列融合，以使得其在植物細胞中轉(zhuǎn)錄。然而，如杲將額外序 列添加到轉(zhuǎn)錄RNA的5，末端或3，末端，就會失去核酶活性。在這種情況 下，可以將附加的修飾(trimming)的核酶，其是順式作用以進行在核酶部分 5，側(cè)或3，側(cè)的修飾，從而自包含核酶的轉(zhuǎn)錄RNA精確地切割核酶部分 (Taira等(1990) Protein Eng. 3: 733; Dzaianott和Bujarski (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4823; Grosshands和Cech (1991) Nucleic. Acids. Res. 19: 3875; Taira等(1991) Nucleic. Acid. Res. 19: 5125)。靶基因內(nèi)的多位點可以 通過將這些結(jié)構(gòu)單元串聯(lián)而被切割以獲得更大的效果(Yuyama等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1271 (1992))。使用這種核酶，就有可能特異地 切割本發(fā)明靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而抑制該基因的表達。
內(nèi)源基因的表達也可通過共抑制，用與靶基因序列具有相同或相似序列的DNA進行轉(zhuǎn)化而得以抑制。"共抑制，，指的是這種現(xiàn)象，其中將具有與
源基因和耙內(nèi)源基因的表達被抑制。盡管詳細的共抑制的機制還未被完全 理解，然而其在植物中被經(jīng)常觀察到(Curr. Biol. 7: R793， 1997; Curr. Biol. 6: 810, 1996)。例如，如果希望獲得其中基因被共抑制的植物體，所研究 的植物體可用載體DNA進行轉(zhuǎn)化，所述載體DNA為被設計成表達基 因或具有類似序列的DNA，以在所得的植物中選擇具有突變體特性的 植物，即半矮化植物。用于共抑制的該基因不需要完全與靶基因相同，然 而，其應該至少有70%或更多，優(yōu)選80%或更多，更優(yōu)選90%或更多(例
基因轉(zhuǎn)化植物而得以抑制。具有顯性陰性表型的基因指的是通過基因表達， 能夠消除或降低植物的野生型內(nèi)源基因活性的基因。
本發(fā)明還提供包含能抑制上述內(nèi)源基因表達的DNA的載體，保持該 DNA在可表達狀態(tài)的轉(zhuǎn)化植物細胞，包含該轉(zhuǎn)化植物體細胞的植物轉(zhuǎn)化 體，上述植物轉(zhuǎn)化體的后代的或克隆的植物轉(zhuǎn)化體，和植物轉(zhuǎn)化體的繁殖 材料。
此外本發(fā)明涉及制備前述植物轉(zhuǎn)化體的方法，包括將能抑制內(nèi)源基 因表達的DNA導入植物細胞；自植物細胞再生植物體。
本發(fā)明的DNA可通過本領域已知的方法導入植物細胞，例如，農(nóng)桿菌 介導的轉(zhuǎn)移方法，電穿孔的方法和粒子轟擊的方法。
如上所述的農(nóng)桿菌的方法，例如可以使用Nagel等的方法(Microbiol. Lett. 67:325, 19卯)。根據(jù)該方法，將重組載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌細胞，然后將轉(zhuǎn)化的 農(nóng)桿菌通過已知的方法例如葉盤法(leaf disk method)導入植物細胞。上述載
動子。一^:而言，本發(fā)明的DNA位于所述啟動子的下游，而且終止子位于 該DNA的下游。本領域的技術人員可以根據(jù)轉(zhuǎn)化的方法和植物類型合適的 選擇用于所述轉(zhuǎn)化的重組載體。前述啟動子包括例如，衍生自花椰菜花葉 病毒的CaMV35S啟動子和玉米遍在蛋白的啟動子(未經(jīng)審查的公開的日本 專利申請(JP-A) Hei2-79983)。
，導入的外
如95%或更多)的序列同一性。 jt匕外，本發(fā)明內(nèi)源基因的-
ii此外，上述的終止子包括衍生自花椰菜花葉病毒的和煙堿合成酶基因 的。然而，本發(fā)明并不限于此，在植物體中起功能的任何啟動子和終止子 者卩可以應用。
此外，導入本發(fā)明DNA的植物體可以是外植體移植?；蛘撸蛇@些植 物培養(yǎng)的細胞，并且這種DNA可以被導入培養(yǎng)細胞。本文中，術語"植物 細胞"包括，例如，來自葉，根，莖，花，以及種子中的盾片(胚盤)的植物 細胞，愈傷組織，和培養(yǎng)細胞懸浮物。
而且，為了有效選擇通過導入本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)化的植物細胞，上述重組 載體優(yōu)選包含合適的選擇標記基因，或優(yōu)選和包含這種選擇標記基因的質(zhì) 粒一起導入植物細胞。本文所用的選擇標記基因，例如，對抗生素潮霉素 有抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，對卡那霉素或慶大霉素有抗性的新霉素 磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，對除草劑膦絲菌素有抗性的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。
將導入了重組載體的植物細胞涂平板并在已知包含合適篩選藥物的選 擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述藥物根據(jù)導入的選擇標記基因的種類而變化。結(jié)果， 可以得到轉(zhuǎn)化植物培養(yǎng)細胞。
植物體由本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)化的植物細胞而得以再生。依據(jù)植物細胞的類 型用已知的方法實施植物體再生(Toki等，(1995) Plant Physiol. 100:1503-1507)。例如，轉(zhuǎn)化和再生水稻植;眛的方法包括(1)使用聚乙二醇 將基因?qū)朐|(zhì)體，并再生植物體(適合秈稻品種(indica)) (Datta等， (1995) in "Gene Transfer To Plants", Potrykus I and Spangenberg Eds., pp66-74); (2)使用電脈沖將基因?qū)朐|(zhì)體，并再生植物體(適合粳稻品種 (japonica))(Toki等(1992) Plant Physiol. 100: 1503-1507); (3)通過粒子轟擊將 基因直接導入細胞，并再生植物體(Christou等(1991) Bio/Technology, 9: 957-962);和(4)使用農(nóng)桿菌導入基因，并再生植物體(Hiei等(1994) Plant J. 6: 271-282)。這些方法已經(jīng)得以確立并在本領域中廣泛利用。因此，這些 方法可適合用于本發(fā)明中。
由轉(zhuǎn)化細胞再生的植物體然后在條件培養(yǎng)基上培養(yǎng)。當馴化的再生植 物體隨后培養(yǎng)在通常的培養(yǎng)條件下時得到半矮化植物體，然后該植物體成 熟并結(jié)實而形成種子。本文中，所存在的導入的外源基因可以通過已知的PCR或Southem雜交 方法，或通過植物體中DNA的核苷酸序列分析在已經(jīng)如上再生并培養(yǎng)的植 物轉(zhuǎn)化體中得以證實。
在這種情況下，根據(jù)已知的J. Sambrook等方法由植物轉(zhuǎn)化體進行DNA 4是取(Molecular Cloning, 2nd ed， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。
時，使用如上所述自再生植物體提取的DNA為模板，實施擴增反應。而且， 具有根據(jù)本發(fā)明DNA或由本發(fā)明修飾的DNA合適選出的核芬酸序列的合成 寡核苷酸可以用作引物以在反應溶液中實施擴增反應，該反應溶液包括這 種寡核苦酸混合物的反應溶液。在擴增反應中，包含本發(fā)明DNA序列的DNA 片段擴增產(chǎn)物可通過重復DNA的變性，退火，和延伸反應幾十次而獲得。 當包含擴增產(chǎn)物的反應溶液，例如，在瓊脂糖凝膠上電泳時，各種擴增的 DNA片段被分級分離以證實所述DNA片段如何對應于本發(fā)明的DNA。
一旦獲得染色體中導入本發(fā)明DNA-的轉(zhuǎn)化的植物體，就有可能通過有 'f生或無性繁歹直(sexual or vegetative propagation)獲^f該種才直物體的后^。或 者，植物可由該轉(zhuǎn)化植物以及其后代或克隆獲得的育種材料(例如種子，果 實，穗(ears),塊莖，塊根(tubercles)，單抹(tubs)，愈傷組織和原生質(zhì)體)而大 規(guī)模制備。轉(zhuǎn)化了本發(fā)明DNA的植物細胞，包括這些細胞的植物體，這些 植物體的后代和克隆，以及由這些植物獲得的育種材料，其后代和克隆， 都包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明中植物的半矮化可以如上所述通過抑制W/基因的表達而誘導。 由本發(fā)明方法制得的半矮化植物預計是有用的，例如作為農(nóng)作物，其可以 穩(wěn)定提供高產(chǎn)量，以及賦予觀賞植物新的審美價值。
此外，本發(fā)明提供編碼水稻sdl蛋白的DNA。 W7DNA可以用于促進植 物生長，尤其是促進莖/葉的延伸。使用編碼水稻sdl蛋白的DNA制備植物轉(zhuǎn) 化體可通過上述的方法實施。也就是，這種制備可以通過將所述DNA插入 前述載體，將所得的載體導入植物細胞，由該轉(zhuǎn)化的植物細胞再生植物體 而實施。而且，基于本發(fā)明編碼水稻sdl蛋白的DNA序列，可以制備出編碼 反義RNA的DNA，編碼具有核酶活性的RNA的DNA，以及編碼具有共抑制 效果的RNA的DNA等，用于抑制植物W/基因的表達。由此制備的DNAs可 用于誘導植物半矮化。本發(fā)明的"水稻sdl蛋白"不僅包括SEQ ID NO: 4的蛋白而且包括與該蛋 白功能等價的源于水稻的蛋白。這種蛋白包括人工制備的和水稻中內(nèi)源存 在的那些蛋白。本文中術語"功能等價的"表示目的蛋白具有GA合成的活 性且在導入植物時具有莖/葉延伸的活性。這種蛋白包括根據(jù)SEQ ID NO: 4 的蛋白的突變體，同系物和變體。
與水稻sdl蛋白功能等價的蛋白質(zhì)可使用例如本領域技術人員已知的用 于在蛋白質(zhì)氨基酸序列中導入突變的定點誘變的方法(Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology edit. Publish. Jhon Wily & Sons Section 8: 1-8.5， 1987)]制備。此外，在自然界中由氨基酸突變產(chǎn)生(arisingnature)的水稻內(nèi)源 蛋白質(zhì)可基于SEQIDNO: 3的DNA使用雜交技術，基因擴增技術(PCR)等進 行分離。
具有SEQ IDNO: 4中取代，缺失，插入和/或添加了 一個或多個氨基酸 的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，被包括在本發(fā)明中，只要它們具有與水稻sdl蛋白 相同的功能。蛋白中的突變數(shù)目通常是30個氨基酸或更少，優(yōu)選是10個氨 基酸或更少，更優(yōu)選是5個氨基酸或更少(例如，3個氨基酸或更少)。然而， 并不限制突變的數(shù)目和位點，只要該蛋白的功能能夠得以保持即可。就保 持蛋白質(zhì)功能方面，用于取代的氨基酸優(yōu)選與要取代的氨基酸具有類似的 性質(zhì)。例如，由于Ala, Val， Leu, lie, Pro, Met, Phe和Trp均歸類為非極性氨基 酸，它們可能相互具有類似的性質(zhì)。此外不帶電荷的氨基酸包括Gly， Ser,Thr, Cys， Tyr, Asn和Gln。而且，酸性氨基酸舉例為Asp和Glu，堿性氨基酸舉例 為Lys， Arg和His。
本發(fā)明中，對編碼水稻sdl蛋白的DNAs類型并不具體限制，只要它們能 夠編碼上述的蛋白；它們可以是基因組DNAs,化學合成的DNAs或cDNA， 其形式不限。此外，本發(fā)明的DNAs包括具有那些基于遺傳密碼簡并性的任 意核苦酸，只要它們能夠編碼水稻sdl蛋白。本發(fā)明編碼水稻sdl蛋白的DNAs 可以如上述，通過使用諸如SEQ ID NO: 3的DNA序列或其部分作為探針的 雜交技術和使用基于這所述DNA序列信息設計的引物的基因擴增方法 (PCR),進行分離。這些探針或引物可以由本領域技術人員利用已知技術根 據(jù)編碼本發(fā)明水稻sdl蛋白的DNAs容易地制備。
附圖簡述圖l是顯示低腳鳥尖(Dee-geo-woo-gen)， Calrose 76和黎明(Reimei)中W7 基因的突變位點的圖。
實施發(fā)明的最佳^t式
下文通過實施例更具體地描述了本發(fā)明。然而，然而本發(fā)明并不應被 限制。
實施例l
基于擬南芥C20氧化酶基因的序列，設計引物OsC20U(5，-ccgctcgccgagaagcgccg -37SEQ ID NO: 1)禾口OsC20L (5，- atgaaggtgtcgccgatgtt -37SEQ ID NO: 2)。利用日本晴(Nipponbare)水稻基因組DNA作為模板實施 PCR，以分離水稻GAC20氧化酶基因。結(jié)果得到618bp的擴增產(chǎn)物，測序顯 示其是新的水稻GA氧化酶基因。GAC20屬于2-氧化戊二酸依賴型雙加氧酶 (2-ODD)家族，保留用于結(jié)合2-氧化戊二酸的功能必需結(jié)構(gòu)域 (NYYPXCXXP)。此外，GAC20還保留三個組氨酸殘基以結(jié)合Fe離子和涉及 GA結(jié)合的LPWKET結(jié)構(gòu)域。水稻GAC20基因顯示與擬南芥有50。/。的同源性。
實施例2
4吏用BIL (1998; TAG 96: 997-1003， Mapping quantitative trait loci controlling seed dormancy and heading date in rice, Oryza sativa L， using backcross inbred lines.)對新的GAC20氧化酶基因的染色體基因座進行連鎖 分析顯示該基因位于水稻第l染色體上約155cM。該基因座非常接近W7基因 座，事實很有力地暗示水稻C20氧化酶基因可能等同于W7基因。
實施例3
由野生型日本晴(Nipponbare)構(gòu)建基因組文庫，利用噬菌斑雜交方法分 離包含GAC20氧化酶基因的基因組克隆以測定該基因的全部核香酸序列 (SEQ ID NO: 3)。所推導出的GAC20氧化酶的氨基酸序列在SEQ ID NO: 4中顯示。
實施例4測定在突變體低腳鳥尖(Dee-geo-woo-gen)和相應的野生型鳥尖 (Woo-gen)中的GAC20氧化酶基因的核苷酸序列作比較。由此，發(fā)現(xiàn)自第一 外顯子到第二外顯子延伸的386bp的核苷酸序列在低腳鳥尖中缺失。還在其 它W/突變體中測定了GAC20氧化酶基因核苷酸序列。結(jié)果，在W7突變體 Calrose76中，在第二外顯子中一個;咸基(胞嘧啶)被胸腺嗜啶取代，并且在 氨基酸水平上，亮氨酸被苯丙氨酸取代。類似地，在W/突變體Reimei中， 在第三外顯子中一個堿基(鳥p票呤)改變?yōu)榘奏?，在氨基酸序列水平上，?冬氨酸被組氨酸取代(


圖1)。
工業(yè)實用性
本發(fā)明提供一種植物W7基因和利用該基因的方法。本發(fā)明十分期望利 用植物W7基因能增加植物尤其是有用農(nóng)業(yè)作物和觀賞植物的產(chǎn)量，通過矮 化來增加觀賞作物的審美價值，并且通過標記選擇來提高矮化植物的產(chǎn)量 并促進高效培育。序列表
〈110>本田技研工業(yè)抹式會社(HONDA MOTOR CO., LTD.)
<120>涉及植物半矮化的sdl基因和其應用
<130> H3-A0101P
<140〉 <141>
<150> JP 2001-185128 <151〉 2001-06-19
<160〉 4
<170> Patentln Ver. 2. 0
<210> 1 <211> 20 <212〉 DNA <213〉人工序列
<220>
<223〉人工序列的描述人工合成引物序列
<400〉 1
ccgctcgccg agaagcgccg
20
<210〉 2
<211〉 20 <212>腿 <213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述人工合成引物序列
〈400〉 2
atgaaggtgt cgccgatgtt
20
<210〉 3 <211> 5575 <212> DNA
〈213〉稻(Oryzasativa)
<400> 3
gtatatttac
ctcctttctt
attgatctca
tccatgaaat
aggtataatg
tagttaacga gtaaacatag ccattaaaca taatcttgaa gtagcagatc
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gaagtatgtt 60 ttgmtttc 120 atcttcccsg 180 gatatatgaa 240 ccgagtagag 300
17<formula>formula see original document page 18</formula>ttttttttttta犯gtttttttagttttatccaaatttattgaaaaactt3gcaacgttt3480
ataataccaaattagtctcatttagttt犯tattgtatatattttgataatatatttatg3540
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tcatacttgttt犯gttggccaaitataggatt犯tgcagagtEltCC犯gggUtt5575
〈210〉 4 <211〉 389 〈212〉 PRT
<213>稻(Oryzasativa) <400〉 4
Met Val Ala Glu His Pro Thr Pro Pro Gin Pro His Gin Pro Pro Pro 15 10 15
Met Asp Ser Thr Ala Gly Ser Gly lie Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala 20 25 30
Val Cys Asp Leu Arg Met Glu Pro Lys lie Pro Glu Pro Phe Val Trp 35 40 45Pro Asn Gly Asp Ala Arg Pro Ala Ser Ala Ala Glu Leu Asp Met Pro
50 55 60
Val Val Asp Val Gly Val Leu Arg A印Gly Asp Ala Glu Gly Leu Arg
65 70 75 80
Arg Ala Ala Ala Gin Val Ala Ala Ala Cys Ala Thr His Gly Phe Phe
85 90 95
Gin Val Ser Glu His Gly Val Asp Ala Ala Leu Ala Arg Ala Ala Leu
100 105 110
Asp Gly Ala Ser Asp Phe Phe Arg Leu Pro Leu Ala Glu Lys Arg Arg
115 120 125
Ala Arg Arg Val Pro Gly Thr Val Ser Gly Tyr Thr Ser Ala His Ala
130 135 140
Asp Arg 145
Phe His
Phe Asp
Ala Arg
Ser Lys Leu 150
Ala Ala Ala 165
Pro Pro
Trp
Val
Lys
Val 170
Glu Thr 155
Ala Asp
Leu Tyr
Ser Phe
Phe Gly 160 Ser Ser 175
Thr Leu Gly Fro Asp Phe Ala Pro Met Gly Arg Val Tyr Gin Lys Tyr
180 185 190
Cys Glu Glu Met Lys Glu Leu Ser Leu Thr lie Met Glu Leu Leu Glu 195 200 205
Leu Ser Leu Gly Val Glu Arg Gly Tyr Tyr Arg Glu Phe Phe Ala Asp
210 215 220
Ser Ser Ser lie Met Arg Cys Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro Glu Pro
225
230
235
240
Glu Arg Thr Leu Gly Thr Gly Pro His Cys Asp Pro Thr Ala Leu Thr 245 250 255
lie Leu Leu Gin Asp Asp Val Gly Gly Leu Glu Val Leu Val Asp Gly 260 265 270
Glu Trp Arg Pro Val Ser Pro Val Pro Gly Ala Met Val lie Asn lie 275 280 285
Gly Asp Thr Phe Met Ala Leu Ser Asn Gly Arg Tyr Lys Ser Cys Leu 290 295 300
His Arg Ala Val Val Asn Gin Arg Arg Glu Arg Arg Ser Leu Ala Phe<formula>formula see original document page 21</formula>
權(quán)利要求
1. (a)到(c)中任一的DNA用于半矮化水稻植株的用途(a)編碼與水稻植株sd1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的反義RNA的DNA，所述sd1基因編碼包含SEQ ID NO4氨基酸序列的水稻sd-1蛋白；(b)編碼具有特異切割水稻植株sd1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酶活性的RNA的DNA，所述sd1基因編碼包含SEQ ID NO4氨基酸序列的水稻sd-1蛋白；或(c)編碼通過共抑制效果抑制水稻植株sd1基因表達的RNA的DNA，所述sd1基因編碼包含SEQ ID NO4氨基酸序列的水稻sd-1蛋白。
2. —種載體，其包含(a)到(c)中任一用于半矮化水稻植抹的DNA:(a) 編碼與水稻植抹W7基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的反義RNA的DNA,所述 基因編碼包含SEQ ID NO: 4氨基酸序列的水稻sd - 1蛋白；(b) 編碼具有特異切割水稻植株基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酶活性的RNA 的DNA,所述基因編碼包含SEQ ID NO: 4氨基酸序列的水稻sd - 1 蛋白；和(c) 編碼通過共抑制效果抑制水稻植抹W7基因表達的RNA的DNA, 所述基因編碼包含SEQ ID NO: 4氨基酸序列的水稻sd - 1蛋白。
3. —種包含處于可表達狀態(tài)的權(quán)利要求2的載體的轉(zhuǎn)化水稻植株細胞。
4. 一種半矮化水稻植株，其中包含權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)化水稻植抹細胞。
5. 權(quán)利要求4的半矮化水稻植抹，其中所述植株是后代或克隆。
6. 權(quán)利要求4或5的半矮化水稻植抹的繁殖材料。
7. 制備權(quán)利要求4或5的半矮化水稻植抹的方法，其中所述方法包括下 述步驟(i)將權(quán)利要求2的載體導入水稻植抹細胞以獲得轉(zhuǎn)化的水稻植抹細 胞，以及(ii)從所述轉(zhuǎn)化的水稻植抹細胞再生水稻植4朱體。
8. —種半矮化水稻植株的方法，其中所述方法包括抑制水稻植抹細胞 中內(nèi)源^/7基因表達的步驟，所述W7基因編碼包含SEQ ID NO: 4氨基酸序 列的W-7蛋白。
9. 權(quán)利要求8的方法，包括將權(quán)利要求2的載體導入水稻植抹。
10. —種分離的cDNA，其編碼包含SEQIDNO: 4氨基酸序列的水稻 sdl蛋白。
全文摘要
本發(fā)明人推測sd1基因是C20氧化酶基因，并且分離和鑒定了水稻的擬南芥C20氧化酶基因的對應物。結(jié)果顯示水稻sd1基因編碼新的C20氧化酶。進一步的研究顯示該基因的突變導致植物半矮化。預計利用該植物sd1基因可以提高植物產(chǎn)量，尤其是有用農(nóng)業(yè)作物和觀賞植物等，通過矮化以賦予植物的審美價值，并且通過標記選擇提高產(chǎn)量和有效培育矮化植物。
文檔編號A01H5/00GK101440374SQ20081021062
公開日2009年5月27日 申請日期2002年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月19日
發(fā)明者大河美保, 松岡信, 蘆苅基行 申請人:本田技研工業(yè)株式會社